Name: Test di tossicità per lo sviluppo basato sul monitoraggio in tempo reale dellinterruzione del segnale del fattore di crescita dei fibroblasti nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Scopri un test di tossicità per lo sviluppo basato su cellule iPS umane che monitora l'interruzione del segnale FGF/SRF in tempo reale. Questo metodo offre un'alternativa accurata ai test animali per valutare i composti teratogeni.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>FastGene</td><td>FG-MCT015C</td><td>Preparazione chimica di prova</td></tr><tr><td>Tubo centrifuga da 15 mL</td><td>VIOLAMO</td><td>1-3500-21</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Tubo PCR a 8 strisce</td><td>Watson</td><td>137-333C</td><td>Preparazione chimica di prova</td></tr><tr><td>Piastra inferiore bianca/trasparente a 96 pozzi, superficie TC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165306</td><td>Coltura cellulare e misurazioni di luminescenza</td></tr><tr><td>Micropiastra nera con fondo piatto 96Well</td><td>ASONE</td><td>3-3321-04</td><td>Per la misurazione della luminescenza negli saggi di citotossicità</td></tr><tr><td>Respira - PIÙ FACILE</td><td>TOHO</td><td>BERM-2000</td><td>Film sigillante permeabile al gas</td></tr><tr><td>Saggio di Viabilità delle Celle Luminescenti CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Test di citotossicità</td></tr><tr><td>Centrifuga 5702 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Centrifugazione</td></tr><tr><td>ClipTip 300, Filtrato, Sterile, Rack</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420513</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 50, Filtrato, Sterile, Rack</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420253</td><td></td></tr><tr><td>Contessa 3 FL Contatore Automatico delle Celle</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Conteggio delle celle</td></tr><tr><td>Cancelli della camera di conteggio delle celle della Contessa</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td>Conteggio delle celle</td></tr><tr><td>Cultura Certo: DMSO&nbsp;</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>031-24051</td><td>Solvente per sostanze chimiche</td></tr><tr><td>CultureSure Y-27632</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>036-24023</td><td>Inibitore ROCK per la semina di iPSC</td></tr><tr><td>DMEM/F12 HEPES, senza fenolo rosso</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039-021</td><td>Rivestimento per coltura cellulare iPS</td></tr><tr><td>F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30-300 & micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4661180N</td><td></td></tr><tr><td>F1-ClipTip Pipette multicanale, da 5 a 50 & micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4661160N</td><td></td></tr><tr><td>Chip filtro</td><td>Watson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrice della membrana basale senza fattore di crescita ridotto senza Geltrex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413202</td><td>Rivestimento per coltura cellulare iPS</td></tr><tr><td>HIENAI Mat 01R</td><td>COSMO BIO</td><td>HMAT01R</td><td>Per mantenere la stabilità della temperatura della lastra durante la gestione della coltura cellulare</td></tr><tr><td>Scaldatubo HIENAI GX01</td><td>COSMO BIO</td><td>TWGX013</td><td>Per mantenere il mezzo caldo durante la maneggiamento sperimentale</td></tr><tr><td>Proteina ricombinante bFGF stabili al calore umano</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0367</td><td>Stimolazione FGF per il saggio del reporter</td></tr><tr><td>Cellule Staminali Pluripotenti Indotte Umane (iPS)</td><td>201B7 (RCB Cat# HPS0063, RRID: CVCL_A324)</td><td>RIKEN BRC Cell Bank</td><td></td></tr><tr><td>Shaker a micropiastra</td><td>TAITEC</td><td>0089532-000</td><td>Scuotimento della placca per il test della citotocicità</td></tr><tr><td>Lettore multiplo</td><td>PerkinElmer</td><td>ARVO X4</td><td>Misurazione della luminescenza</td></tr><tr><td>Substrato a cellule vive di endurazina nano-glo</td><td>Promega</td><td>N2571</td><td>Substrato di luminescenza</td></tr><tr><td>PBS (-)&nbsp;</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>166-23555</td><td>Culutre cellulare</td></tr><tr><td>Parafilim</td><td>COME UNO</td><td>65-1681-93</td><td>Conservata per la piastra di rivestimento</td></tr><tr><td>Pipetto</td><td></td><td>eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>WSL-1563 KronosHT</td><td>ATTO</td><td>3510140</td><td>Sistema di misurazione della luminescenza in tempo reale&nbsp;</td></tr><tr><td>Serbatoio</td><td>BMBio</td><td>BM-0850-1</td><td></td></tr><tr><td>STEMdif APEL2 Medium &nbsp;</td><td>Tecnologie STEMCELL</td><td>ST-05275</td><td>Mezzo per il saggio</td></tr><tr><td>StemFlex Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3349401</td><td>Mezzo di manutenzione</td></tr><tr><td>Acqua sterile, senza endotossine</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>196-15645</td><td>Controllo dell'umidità per la coltura cellulare iPS</td></tr><tr><td>Placca di coltura tissutale VTC-P6</td><td>VIOLAMO</td><td>2-8588-01</td><td>Cultura cellulare</td></tr><tr><td>TrypL Select Enzyme (1X), senza fenolo rosso</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563011</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Acido valproico</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>227-01071</td><td>Chimico di prova</td></tr></tbody></table>

test di tossicità per lo sviluppo basato sul monitoraggio in tempo reale dell'interruzione del segnale del fattore di crescita dei fibroblasti nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane

Developmental Toxicity Assay Based on Real-Time Monitoring of Fibroblast Growth Factor Signal Disruption in Human Induced Pluripotent Stem Cells

Nella nostra esperienza, la morfologia cellulare è utile per determinare se un test è stato eseguito correttamente. La Figura 2A mostra le tipiche immagini al microscopio confocale delle cellule immediatamente prima e dopo l'esposizione chimica. Al termine del saggio, quasi l'intera superficie dei pozzetti è coperta da cellule. La Figura 2B mostra le immagini della colorazione di cellule vive/morte. Il numero di cellule morte colorate con ioduro di propidio (PI) aumenta dopo l'esposizione chimica; tuttavia, la vitalità cellulare è almeno del 50% e quasi tutte le cellule sono colorate con calceina-AM.
La tabella 1 elenca le sostanze chimiche in esame utilizzate nei nostri studi precedenti 7,8. Questi studi dimostrano che le sostanze chimiche Devtox possono essere distinte con maggiore precisione in base all'interruzione del segnale FGF nelle cellule iPS umane. Un risultato chiave è che il monitoraggio continuo dell'attività di segnalazione è fondamentale perché cambia dinamicamente nel tempo. L'uso di un sistema di misurazione della luminescenza in tempo reale fornisce una risoluzione temporale notevolmente più elevata con meno lavoro di misurazione. Qui descriviamo un protocollo che utilizza un sistema di monitoraggio in tempo reale.
La figura 3A mostra le variazioni dell'intensità della luminescenza nell'arco di 48 ore in sei pozzetti replicati nelle stesse condizioni senza la sostanza chimica in esame. Le sei curve sono quasi allineate, indicando una buona riproducibilità da pozzo a pozzetto. Sebbene non siano chiaramente identificati nelle misurazioni manuali a 24 ore nei nostri studi precedenti, due picchi distinti - un picco iniziale immediatamente dopo l'aggiunta del ligando FGF e un secondo picco a circa 24 ore - appaiono nelle misurazioni in tempo reale a 48 ore. La Figura 3B mostra le variazioni dell'intensità della luminescenza in seguito all'esposizione all'acido valproico (VPA), un noto tossico per lo sviluppo. Il VPA è un inibitore dell'istone deacetilasi che causa difetti nel tubo neurale, nel cuore e negli arti¹¹. Il VPA interrompe la segnalazione dell'FGF in modo dipendente dalla concentrazione. Il sistema di misurazione automatizzato in tempo reale ha acquisito la dinamica del segnale in modo più accurato rispetto alle misurazioni manuali.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68910/68910fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Saggio di interruzione del segnale FGF/SRF. (A) Ingegneria genetica di cellule iPS umane per generare cellule reporter di segnale FGF/SRF. È stato costruito un plasmide contenente Nluc a valle dell'elemento di risposta sierica, bracci omologhi per knock-in mirato e il gene di resistenza alla puromicina sotto il controllo del promotore della fosfoglicerato chinasi umana. Dopo la selezione della puromicina, sono state stabilite le cellule reporter SRE-Nluc. (B) Calendario del saggio. Le cellule reporter sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti e coltivate per 4 giorni fino a coprire l'intera superficie. Il substrato luminescente e la sostanza chimica in esame sono stati aggiunti rispettivamente 3 e 1 ora prima di iniziare la misurazione. Il tempo di aggiunta del ligando FGF è stato impostato a 0 ore e l'intensità della luminescenza è stata misurata continuamente nelle successive 48 ore. (C) Analisi dei dati. La dinamica del segnale è stata registrata in cellule esposte e non esposte alle sostanze chimiche in esame e normalizzata al controllo del veicolo per stimare l'area tra le curve come misura dell'interruzione del segnale causata da una sostanza chimica. I valori ABC sono stati ottenuti per ciascuna sostanza chimica a diverse concentrazioni ed è stata calcolata la loro somma. L'analisi della curva caratteristica operativa del ricevitore è stata eseguita utilizzando tutte le sostanze tossiche note per lo sviluppo testate per determinare la soglia. Abbreviazioni: iPS = cellule staminali pluripotenti indotte; RLU = Unità di Luce Relativa; AUC = Area sotto la curva; FGF = fattore di crescita dei fibroblasti; SRF = fattore di risposta sierica; SRE = elemento di risposta sierica; HA = braccio omologo; L = sinistra; R = destra; PuroR = gene di resistenza alla puromicina; hPGK = fosfoglicerato chinasi umano; Nluc = NanoLuc luciferasi; ROC = caratteristica di funzionamento del ricevitore; ABC = area tra le curve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68910/68910fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68910/68910fig2.jpg"> 
Figura 2: Morfologia cellulare e colorazione delle cellule vive/morte. A) Immagini microscopiche confocali di cellule prima (giorno 4) e dopo (giorno 6) l'esposizione a una sostanza chimica in esame. Le celle rimanenti che coprono quasi l'intera superficie dei pozzetti dopo il test sono un indicatore di un test di successo. Una copertura quasi completa del pozzetto alla fine del test indica un ciclo di successo. B) colorazione di cellule vive/morte prima e dopo l'esposizione a una sostanza chimica in esame. Le cellule vive sono state colorate di verde con Calceina-AM e le cellule morte sono state colorate di rosso con ioduro di propidio (PI). sono stati colorati con calceina-AM (verde) e cellule morte con ioduro di propidio (PI, rosso). La proporzione di cellule morte dovrebbe essere inferiore a quella che dovrebbe essere &lt; il 50% delle cellule totali. Barre di scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68910/68910fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68910/68910fig3.jpg"> 
Figura 3: Esempi tipici di dinamica dell'intensità della luminescenza. (A) La luminescenza dell'andamento temporale cambia l'andamento temporale della luminescenza dopo la stimolazione del ligando FGF, misurata utilizzando un sistema di misurazione della luminescenza in tempo reale. L'intensità della luminescenza è stata monitorata ogni 22 minuti per 48 ore. Le sei linee colorate rappresentano i segnali provenienti da diversi pozzi. (B) Confronto tra misure di luminescenza manuali e in tempo reale con acido valproico. L'interruzione del segnale è stata osservata con entrambi i metodi di misurazione, mentre il monitoraggio in tempo reale ha catturato più chiaramente il segnale potenziato al secondo picco. Abbreviazioni: RLU = Unità di Luce Relativa; VPA = acido valproico; FGF = fattore di crescita dei fibroblasti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68910/68910fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68910/68910_Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Test chimico</td>
			<td>Abbreviazione</td>
			<td>Cas NO.</td>
			<td>Studio degli animali (studio precedente)</td>
			<td>Studio in vitro (questo studio)</td>
			<td>Somma dei valori ABC</td>
			<td>Concentrazione massima (μg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acido all-trans-retinoico</td>
			<td>ATRA</td>
			<td>302-79-4</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>65.9</td>
			<td>0.0100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idrossiurea</td>
			<td>HU</td>
			<td>127-07-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>63.3</td>
			<td>149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido metossiacetico</td>
			<td>MAA</td>
			<td>625-45-6</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>225</td>
			<td>683</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloruro di metilmercurio</td>
			<td>MeHg</td>
			<td>115-09-3</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>77.7</td>
			<td>1.20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metotrexato idrato</td>
			<td>MTX</td>
			<td>133073-73-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>80.5</td>
			<td>5.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salicilato di sodio</td>
			<td>SA</td>
			<td>54-21-7</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>38.7</td>
			<td>666</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acido valproico</td>
			<td>AVP</td>
			<td>99-66-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>63.3</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminonicotinamide</td>
			<td>6-AN</td>
			<td>329-89-5</td>
			<td>P</td>
			<td>N</td>
			<td>24.9</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido borico</td>
			<td>BA</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td>P</td>
			<td>N</td>
			<td>24.2</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2'-deossiuridina</td>
			<td>BrdU</td>
			<td>59-14-3</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>83.9</td>
			<td>50.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5-dimetil-2,4-ossazolidindione</td>
			<td>DMO</td>
			<td>695-53-4</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>50.3</td>
			<td>840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloruro di litio</td>
			<td>LiCl</td>
			<td>7447-41-8</td>
			<td>P</td>
			<td>N</td>
			<td>29.8</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-fluorouracile</td>
			<td>5-FU</td>
			<td>51-21-8</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>92.4</td>
			<td>2.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciclofosfamide monoidrato</td>
			<td>CPA</td>
			<td>6055-19-2</td>
			<td>P</td>
			<td>N</td>
			<td>19.1</td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesilato</td>
			<td>IMA</td>
			<td>220127-57-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>42.4</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenalidomide</td>
			<td>LEN</td>
			<td>191732-72-6</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>94.7</td>
			<td>35.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>INGLESE</td>
			<td>19171-19-8</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>50.9</td>
			<td>2.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talidomide</td>
			<td>THA</td>
			<td>50-35-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>53.3</td>
			<td>12.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrilamide</td>
			<td>AcA</td>
			<td>79-06-01</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>37.1</td>
			<td>454</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Canfora</td>
			<td>CAMMA</td>
			<td>464-49-3</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>27.5</td>
			<td>50.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difenidramina cloridrato</td>
			<td>DHM</td>
			<td>147-24-0</td>
			<td>N</td>
			<td>P</td>
			<td>68.2</td>
			<td>262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimetilftalato</td>
			<td>DMP</td>
			<td>131-11-3</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>24.4</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillina G sale sodico</td>
			<td>Peng</td>
			<td>69-57-8</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>22.1</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccarina sodica</td>
			<td>SACCO</td>
			<td>82385-42-0</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>34.0</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetaminofene</td>
			<td>APAP</td>
			<td>103-90-2</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>22.3</td>
			<td>20.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillina triidrato</td>
			<td>AMX</td>
			<td>61336-70-7</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>28.4</td>
			<td>25.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cimetidina</td>
			<td>CENTIMETRO</td>
			<td>51481-61-9</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>25.3</td>
			<td>30.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eritromicina</td>
			<td>ERY</td>
			<td>114-07-8</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>20.0</td>
			<td>15.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idroclorotiazide</td>
			<td>HCTZ</td>
			<td>58-93-5</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>21.9</td>
			<td>20.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfasalazina</td>
			<td>SSZ</td>
			<td>599-79-1</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>30.8</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chimico</td>
			<td>AUC</td>
			<td>Soglia</td>
			<td>Sensibilità</td>
			<td>Specificità</td>
			<td>Accuratezza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 sostanze</td>
			<td>0.819</td>
			<td>37.9</td>
			<td>0.778</td>
			<td>0.917</td>
			<td>0.833</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Sostanze chimiche Devtox e non Devtox classificate all'interno di esperimenti su animali e risultati stimati con e senza interruzione del segnale FGF. Abbreviazioni: P = positivo (Devtox); N = negativo (non Devtox).

Test di tossicità per lo sviluppo basato sul monitoraggio in tempo reale dell'interruzione del segnale del fattore di crescita dei fibroblasti nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane

Developmental toxicity (Devtox) is typically evaluated in animal models. However, there are challenges in ensuring accuracy, such as false negatives due ...

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Biologia dello sviluppo

Dimostriamo il protocollo per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule somatiche umane utilizzando lentivirus-mediata consegna dei fattori umani Oct4, Sox2, Nanog, e Lin28. Pluripotenza è stata confermata dalla morfologia e la presenza di staminali embrionali (ES) cellulo-specifici marcatori.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da fibroblasti umani Riprogrammare con il Stemgent Lentivirus umani TF Set

Vi presentiamo un protocollo efficace per la riprogrammazione di cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) che utilizzano vettori retrovirali codificanti Oct3 / 4, Sox2, Klf4 e c-myc (OSKM) e l'individuazione di hiPSC correttamente riprogrammata mediante colorazione dal vivo con Tra- 1-81 anticorpo.

Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti

La qualità di fibroblasti embrionali di topo (MEF) è dettata dal ceppo destro del mouse, ad esempio CF-1. Pluripotenza-solidale MEF e mezzi condizionati (CM) ottenuti da questi dovrebbe contenere le concentrazioni ottimali di Activin A, Gremlin e Tgfβ1 necessari per la Activin / Nodale FGF e percorsi di co-operativamente mantenere il self-renewal e la pluripotenza.

Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

I protocolli descrivono due sistemi di test in vitro di tossicità dello sviluppo (UKK e UKN1) a base di cellule staminali embrionali umane e studi trascrittoma. I sistemi di test prevedono pericolo tossicità per lo sviluppo umano, e possono contribuire a ridurre studi sugli animali, i costi e il tempo necessario per le prove della sicurezza chimica.

Umano cellule staminali pluripotenti Basato Tossicità per lo sviluppo saggi per Chemical Screening e Safety Systems Biology generazione dati

Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficiente per propagare le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) utilizzando solo terreni condizionati derivati dalla placenta umana in un piatto rivestito di gelatina senza ulteriori supplementazioni esogene o substrati sintetici specifici per hPSC.

A Novel cultura Modello pluripotenti staminali umane propagazione delle cellule su Gelatina in Media Placenta condizionata

Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs) sono considerate un potente strumento per la screening di droga e chimica e per lo sviluppo di nuovi modelli in vitro per la sperimentazione di tossicità, compresa la neurotossicità. Qui viene descritto un protocollo dettagliato per la differenziazione di hiPSC in neuroni e glia.

Protocollo per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo in culture miste di neuroni e glia per la sperimentazione della neurotossicità

Il protocollo presentato qui descrive una piattaforma per identificare piccole molecole per il trattamento dell'affezione epatica. Una descrizione dettagliata è presentata dettagliare come differenziarsi iPSCs in cellule con le caratteristiche dell'epatocita in piastre da 96 pozzetti e per utilizzare le celle per schermo per piccole molecole con potenziale attività terapeutica.

Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga

Qui descriviamo un metodo clinicamente rilevante, ad alta efficienza e privo di alimentatore per riprogrammare i fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando modificate mRNA che codificano per fattori di riprogrammazione e maturo microRNA-367/302 imita. Sono inoltre inclusi metodi per valutare l'efficienza di riprogrammazione, espandere le colonie clonali iPSC e confermare l'espressione del marcatore pluripotenza TRA-1-60.

RNA-ha basato riprogrammazione dei fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte

La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

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I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo (hiPSC-CM) sono emersi come un promettente modello in vitro per lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci e la modellizzazione della malattia. Qui, dettagliamo un protocollo per misurare la contrattilità e l'elettrofisiologia delle hiPSC-CM.

Applicazioni tecniche di microelectrode array e patch clamp recordings su cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CM) offrono un'alternativa all'uso di animali per lo screening preclinico della cardiotossicità. Una limitazione all'adozione diffusa di hiPSC-CMs nello screening preclinico della tossicità è il fenotipo immaturo e fetale delle cellule. Qui sono presentati protocolli per la maturazione robusta e rapida delle hiPSC-CM.

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Test di tossicità per lo sviluppo basato sul monitoraggio in tempo reale dellinterruzione del segnale del fattore di crescita dei fibroblasti nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane (Video) | JoVE Journal

Test di tossicità per lo sviluppo basato sul monitoraggio in tempo reale dell'interruzione del segnale del fattore di crescita dei fibroblasti nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane

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