Valutazione degli interventi terapeutici nel modello murino carente di SHIP di ileite e fibrosi simile alla malattia di Crohn

Utilizziamo topi carenti di SHIP per studiare i meccanismi che guidano l'infiammazione intestinale e la fibrosi nel morbo di Crohn e per valutare nuovi farmaci o strategie terapeutiche per trattare il morbo di Crohn. Abbiamo quindi utilizzato questo modello in studi preclinici per dimostrare l'efficacia dei farmaci IBD per glicogeno nella somministrazione mirata di farmaci. Il nostro protocollo utilizza topi carenti di SHIP, che sviluppano naturalmente infiammazione ileale e fibrosi, fornendo un modello fisiologicamente più rilevante rispetto ai modelli tradizionali indotti chimicamente o basati su lesioni.

I nostri risultati stabiliscono i topi carenti di SHIP come un modello robusto di infiammazione e fibrosi ileale, permettendo studi meccanicistici e test preclinici delle terapie per la malattia di Crohn. Per cominciare, digiunare i topi per quattro ore prima di eseguire il test. Sciogliere quattro kilodalton FITC-dextrano in PBS sterile per raggiungere una concentrazione finale di 80 milligrammi per millilitro.

Successivamente, trattieni delicatamente ogni topo e somministra 150 microlitri della soluzione di FITC-destrono tramite gavage orale, poi tieni i topi senza cibo per altre quattro ore dopo il gavage. Dopo l'eutanasia del topo, eseguire una puntura cardiaca usando un ago calibro 25 e una siringa da un millilitro per raccogliere sangue. Aggiungere immediatamente 10 microlitri di soluzione acido-citrato-destrosio ogni 100 microlitri di sangue raccolto come anticoagulante.

Mescola accuratamente invertendo il tubo più volte. Centrifuga i campioni di sangue raccolti a 1.500 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire con attenzione il plasma su tubi microcentrifughe da 1,7 millilitri etichettati.

Tieni tutti i campioni sul ghiaccio e schermati dalla luce finché non saranno pronti per l'analisi. Ora, diluire ogni campione di plasma in rapporti uno a due e uno a dieci usando PBS. Aggiungi 100 microlitri di ciascuna diluizione del plasma in una piastra opaca da 96 pozzi, posizionandoli in pozzi duplicati.

Eseguire una o due diluizioni seriali del stock originale FITC-dextrano da 80 milligrammi per millilitro utilizzando PBS per preparare diverse concentrazioni della soluzione. Aggiungi 100 microlitri di ogni diluizione in pozzi duplicati della piastra da 96 pozzi. Successivamente, si misura la fluorescenza usando un lettore di microplacche impostato a 485 nanometri per l'eccitazione e 535 nanometri per l'emissione.

Dopo il prelievo di sangue Per il test FITC-dextrano, si elimina con cura l'intero intestino tenue dal topo. Rimuovi delicatamente qualsiasi grasso e tessuto connettivo attaccato dall'intestino. Stendi l'intestino pulito su un foglio bianco bianco per aumentare il contrasto visivo.

Esaminare il tessuto visivamente alla ricerca di segni macroscopici di malattia, prestando particolare attenzione ai 10 centimetri distali nei topi knockout SHIP, dove si verifica comunemente l'infiammazione. Allinea l'intestino accanto a un righello per fornire la scala e fotografa l'intero campione per documentare eventuali riscontri patologici grossolani. Risciacquo delicatamente il lumen intestinale con PBS usando una siringa per rimuovere qualsiasi contenuto intestinale, evitando una forza eccessiva per evitare distorsioni delle villosità e dell'architettura delle cripte.

Identificare la regione dell'ileo distale più rappresentativa della patologia grossolana e consumare circa un centimetro di tessuto. Stendere il tessuto espulso in una cassetta istologica e infilarlo tra due spugne per evitare il piegamento durante la fissazione. Per la colorazione di ematossilina ed eosina e la colorazione tricroma di Masson, fissare il tessuto in formalina tamponata al 10% di neutro usando da 10 a 20 volte il volume tissutale durante la notte a quattro gradi Celsius.

Dopo la fissazione, trasferire le cassette al 70% di etanolo per la conservazione e assicurarsi che rimangano completamente sommerse fino alla lavorazione. Per la colorazione acido-Schiff periodica e blu alciano, fissare il tessuto nella soluzione di Carnoy durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo la fissazione, trasferire le cassette al 100% di etanolo per la conservazione fino alla lavorazione.

Successivamente, immergi i tessuti fissi nella paraffina e li sezioni in fette da cinque micrometri per la successiva colorazione. Valutare le sezioni ileali colorate con ematossilina ed eosina utilizzando una scala di 16 punti secondo criteri istopatologici definiti. Valutare le sezioni trasversali tinte trichrome di Masson utilizzando una scala a sei punti basata su criteri predefiniti.

Calcola il punteggio finale della fibrosi come mediana dei punteggi assegnati da due revisori indipendenti che sono ciechi rispetto alle condizioni sperimentali. Dopo la dissezione e la rimozione del campione istologico, raccogliere la porzione residua dei 10 centimetri distali dell'ileone. Asciuga il tessuto raccolto con un asciugamano di carta o una salvietta senza pelucchi, poi annota il peso del tessuto usando una bilancia calibrata.

Congelare rapidamente il tessuto in azoto liquido prima di conservarlo a meno 80 gradi Celsius per una futura lavorazione. Quando è pronto per la lavorazione, recupera il tessuto congelato e mantenilo sempre sul ghiaccio. Poi, pesa nuovamente i campioni di tessuto per confermare la massa accurata.

Preparare il buffer di omogeneizzazione aggiungendo un inibitore della proteasi al PBS. Usa 10 microlitri di tampone per milligrammo di tessuto. Utilizzando un omogeneizzatore da banco da banco omogeneizzare il tessuto ileale di spessore completo in un tampone di omogeneizzazione gelido.

Continuare finché l'omogeneato non è uniforme e privo di frammenti di tessuto visibili. Risciacqua accuratamente la punta omogeneizzante con PBS tra i campioni e l'altro per evitare contaminazioni incrociate. Centrifugare il tessuto omogenea a 10.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Aliquota i supernatanti chiarificati in volumi più piccoli per prevenire cicli di gelo-disgelo, poi conservarli a meno 80 gradi Celsius per analisi future. L'analisi istologica ha rivelato un danno intestinale significativamente maggiore nei topi carenti di SHIP rispetto ai controlli SHIP. Il trattamento con desametasone ha ridotto i danni istologici nei topi carenti di SHIP, anche se la diminuzione non è stata statisticamente significativa.

La colorazione tricroma di Masson ha mostrato un aumento significativo della deposizione di collagene nei topi carenti di SHIP rispetto ai controlli SHIP, indicando punteggi più alti per la fibrosi. Il trattamento con desametasone ha ridotto notevolmente la fibrosi nei topi carenti di SHIP, avvicinando i punteggi ai controlli positivi per SHIP. La colorazione con blu di alciano e PAS ha confermato l'iperplasia delle cellule calicili nei topi carenti di SHIP, visibilmente ridotta dopo il trattamento con desametasone.

Le concentrazioni di IL-1 beta sono state significativamente elevate nei topi carenti di SHIP rispetto ai controlli SHIP. Il desametasone ha ridotto significativamente le concentrazioni di IL-1beta nei topi carenti di SHIP. Le concentrazioni di MPO erano significativamente elevate nei topi carenti di SHIP rispetto ai controlli SHIP, e questo aumento è stato ridotto dal desametasone senza raggiungere la significanza statistica.

Le concentrazioni di LCN-2 erano elevate anche nei topi carenti di SHIP, ma valori elevati non sono stati costantemente ridotti dal desametasone. Le concentrazioni di IL-1 beta erano positivamente correlate con i punteggi di danno istologico e di fibrosi, indicando un legame tra infiammazione e lesione tissutale. I punteggi di danno istologico erano positivamente correlati con quelli della fibrosi, suggerendo che il danno tissutale e il rimodellamento fibrotico sono progrediti parallelamente.