Modello murino per embolia microvascolare per microscopia a due fotoni in vivo utilizzando microsfere fluorescenti di polistirene
21 novembre 2025
Questo protocollo contiene una descrizione dettagliata di un approccio passo dopo passo per un modello murino a finestra cranica cronica e embolia microvascolare, ottimizzato per la microscopia a due fotoni in vivo utilizzando microsfere fluorescenti al polistirene.
Utilizzando questo metodo di iniezione della microsfera, miriamo a svelare le conseguenze a breve e lungo termine del tappage capillare per indagare i potenziali meccanismi di eliminazione dell'embolo nella rete capillare cerebrale. Consente l'imaging in vivo in tempo reale e il tracciamento delle particelle fluorescenti nella rete capillare corticale. Le microsfere e le conseguenze di casa possono essere seguite per settimane dopo l'iniezione.
I nostri studi aiutano a comprendere i danni tissutali locali causati dalle occlusioni microvascolari. Questi risultati potrebbero portare a nuove strategie terapeutiche. Ora possiamo studiare giorno dopo giorno e per settimane come il tuso dei capillari alteri i vasi, attiva le cellule, modifica il flusso sanguigno e danneggia la barriera emato-encefalica.
Per cominciare, pizzica il dito del piede di un topo anestetizzato per verificare la profondità dell'anestesia. Eseguire un'incisione mediana di circa 0,5 centimetri sopra la trachea sotto la mandibola utilizzando forbici chirurgiche e pinze dissezionali. Dissezionare il tessuto connettivo superficiale alla fascia cervicale utilizzando pinze di micro-sutura per esporre i muscoli ioidi sternali sottostanti.
Ora, separare i muscoli ioidi sternali sinistro e destro strappando delicatamente il tessuto connettivo tra di essi. Ritrae il muscolo omohioideo destro caudalmente lateralmente con un uncino di tessuto. Assicurati che il triangolo carotide destro, inclusa l'arteria carotide comune, l'arteria carotide interna e l'arteria carotide esterna, sia chiaramente visibile.
Successivamente, rimuovere eventuali fascie e tessuto adiposo residui intorno all'arteria carotide comune. Separare con cura l'arteria carotide comune dal nervo vago. Posiziona due fili 4/0 da 1,5 attorno all'arteria carotide comune e legale in modo morbido, assicurandosi che i nodi non ostacolino il flusso sanguigno.
Rimuovere fascia e tessuto adiposo dall'arteria carotide interna e dall'arteria parietale posteriore. Poi legare temporaneamente l'arteria parietale posteriore e tutti i rami laterali carotidi interni, inclusa l'arteria occipitale, legando un nodo con un filo 4/0 1.5. Rimuovere fascia e tessuto adiposo dall'arteria carotide esterna e dall'arteria temporale.
Posiziona due nodi allentati attorno all'arteria carotide esterna e all'arteria temporale usando filettature 4/0 1.5. Posiziona il filo più distale possibile il più lontano possibile dalla biforcazione a forma di Y e usalo per legare permanentemente l'arteria carotide esterna e l'arteria temporale. Lascia il nodo prossimale non legato.
Omogeneizzare e sonicare le microsfere da 10 micrometri per ottenere una sospensione uniforme delle singole particelle. Aggiungere 20 microlitri di microsfere omogeneizzate a 140 microlitri di FITC-Destrono per ottenere un volume finale di 160 microlitri di miscela contenente 1,44 per 10 alla potenza di cinque microsfere. Ritrae brevemente la siringa collegata al catetere per creare un airlock.
Poi immergi la punta del catetere nella miscela preparata di FITC-Dextran/Tween20/microsfera e tira lentamente la siringa finché la miscela non è nel catetere. Assicurati che non ci siano bolle d'aria nel catetere. Posiziona la siringa con il catetere carico nella pompa della siringa.
Imposta la pompa a 10 microlitri al minuto e fai funzionare finché non appare una piccola goccia di miscela microsfera alla punta del catetere. Ora, posiziona una clip per il vaso sull'arteria carotide interna e stringi uno dei nodi prossimali preparati in precedenza attorno all'arteria carotide comune. Con microforbici, eseguire una piccola incisione diagonale nell'arteria carotide esterna circa 0,5 millimetri distale rispetto al filo di legatura, assicurando che la dimensione dell'incisione sia leggermente inferiore al diametro del catetere.
Assorbi il sangue con un panno sterile. Avvia brevemente la pompa della siringa per formare una goccia di miscela microsferica alla punta del catetere, confermando che non rimanga aria nella punta. Apri l'incisione dell'arteria carotide esterna e inserisci il catetere usando micropinze sottili.
Poi fissa il catetere nell'arteria carotide esterna stringendo la sutura prossimale attorno all'arteria carotide esterna. Pompa gradualmente a 10 microlitri al minuto finché l'arteria non si ingrossa visibilmente e il colorante FITC verde riempie l'arteria carotide esterna, confermando l'iniezione riuscita a essere rimasta. Successivamente, rimuovere la clip del vaso dall'arteria carotide interna.
Poi aumenta la portata della pompa della siringa a 20 microlitri al minuto. Confermare il successo dell'iniezione della microsfera verificando che la biforcazione dell'arteria carotide interna, distale rispetto a quella parietale posteriore, sia riempita con colorante FITT. Una volta che l'iniezione ha avuto successo, si rimuove il filo che legava l'arteria carotide comune per permettere al mix microsferico di fluire nell'arteria carotide interna.
Durante l'iniezione, il colorante FITC può ancora essere osservato nell'arteria carotide esterna. Spegni la pompa della siringa una volta che la miscela nel catetere raggiunge la soglia degli 80 microlitri per fermare l'iniezione. Poi lega l'arteria carotide comune, taglia la carotide interna e rimuovi delicatamente il catetere, mantenendo il filo di fissaggio in posizione.
Legare permanentemente l'arteria carotide esterna stringendo il filo che aveva fissato il catetere. Rimuovere la clip del vaso e i fili intorno all'arteria carotide comune, all'arteria carotide interna e all'arteria parietale posteriore per ripristinare il flusso sanguigno. Il successo dell'intervento di embolia microvascolare è stato confermato dall'autopsia post mortem di tutto il corpo e del cervello completo quattro giorni dopo l'intervento.
Una sezione cerebrale sagittale ha mostrato l'alloggiamento di microsfere nel cervello. I cervelli di topo estratti e acquisiti un giorno dopo l'intervento hanno mostrato che le microsfere erano prevalentemente alloggiate nell'emisfero ipsilaterale all'interno del territorio di flusso delle arterie cerebrali medie e anteriori. Il conteggio delle microsfere nelle fette cerebrali è aumentato significativamente quando Tween20 è stato aggiunto alla miscela di microsfere.
I topi hanno perso meno peso e si sono ripresi più rapidamente dopo l'intervento chirurgico quando sono stati iniettati con una miscela di microsfera che conteneva Tween20. Le immagini microscopiche a fluorescenza della corteccia cerebrale scattate 0,5 ore dopo l'intervento hanno mostrato punti bianchi individuali, che rappresentano microsfere che occludono capillari. Le immagini di proiezione a due fotoni a z-stack hanno mostrato microsfere che causano embolie microvascolari cerebrali con perfusione compromessa.
Le embolie causano anche una rottura della barriera emato-encefalica con una perdita visibile di colorante dai vasi.
Panoramica
Questo protocollo descrive un approccio dettagliato passo dopo passo per la creazione di una finestra cranica cronica e di un modello murino di embolismo microvascolare, ottimizzato per l’imaging in vivo mediante microscopia a due fotoni. Il metodo utilizza microsfere fluorescenti di polistirene per studiare gli effetti dell’ostruzione capillare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca microvascolare
- Tecniche di imaging in vivo
Sfondo
- Comprendere le conseguenze delle occlusioni microvascolari è fondamentale per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.
- L'imaging in tempo reale consente il tracciamento di particelle fluorescenti nella rete capillare cerebrale.
- Studi precedenti hanno dimostrato che l'ostruzione dei capillari può provocare danni tissutali locali.
- Questa ricerca mira a chiarire i meccanismi di rimozione degli emboli nel cervello.
Scopo dello studio
- Studiare gli effetti a breve e a lungo termine dell'occlusione capillare.
- Comprendere come le occlusioni microvascolari influenzino il flusso sanguigno e la barriera emato-encefalica.
- Esplorare potenziali strategie terapeutiche per condizioni associate a danno microvascolare.
Metodi Utilizzati
- Creazione di una finestra cranica cronica nei topi per l'imaging.
- Iniezione di microsfere fluorescenti per indurre embolismo microvascolare.
- Utilizzo della microscopia a due fotoni per l'imaging in tempo reale.
- Imaging post-operatorio per confermare il deposito delle microsfere nel cervello.
Risultati principali
- Le microsfere erano principalmente localizzate nell'emisfero controlaterale.
- Un aumento del numero di microsfere è stato osservato con l'aggiunta di Tween20.
- I topi iniettati con Tween20 hanno mostrato un recupero più rapido dopo l'intervento chirurgico.
- La microscopia a fluorescenza ha rivelato l'occlusione dei capillari da parte delle microsfere.
Conclusioni
- Questo metodo consente uno studio dettagliato delle occlusioni microvascolari in vivo.
- I risultati potrebbero portare a nuove intuizioni sulle strategie terapeutiche per le condizioni microvascolari cerebrali.
- Lo studio migliora la comprensione della dinamica del flusso sanguigno e del danno tissutale nel cervello.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
I modelli di embolia microvascolare che utilizzano microsfere fluorescenti e la microscopia a due fotoni in vivo forniscono una piattaforma solida per analizzare i meccanismi e le conseguenze delle micro-occlusioni cerebrali. Questo approccio consente un monitoraggio longitudinale ad alta risoluzione degli eventi vascolari e delle risposte tessutali, sostenendo una valutazione predittiva affidabile nella validazione precoce di bersagli neurovascolari. La riproducibilità del modello e i suoi risultati quantitativi in imaging lo rendono una risorsa preziosa per la selezione di portafogli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci neurovascolari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi di ipotesi relative a lesioni neurovascolari mediante l'induzione controllata di micro-occlusioni.
- Consente la riduzione dei rischi meccanicistici visualizzando nel tempo le risposte dei vasi, delle cellule e della barriera ematoencefalica.
- Facilita la validazione funzionale delle target collegando gli eventi di embolia ai danni tissutali a valle e alla dinamica di rimozione.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema in vivo validato per la valutazione quantitativa dell'occlusione microvascolare e della ri-perfusione.
- Permette di ottenere immagini riproducibili e ricche di informazioni, adatte alla standardizzazione dei saggi e al confronto tra studi.
- Consente lo screening di interventi sperimentali mirati alla rimozione dell'embolia o alla protezione neurovascolare.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per la malattia di lesioni microvascolari cerebrali, favorendo l'esplorazione traslazionale di biomarcatori.
- Permette un percorso continuo dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo il monitoraggio longitudinale degli esiti.
- Fornisce indicazioni per decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, quantificando le risposte dei tessuti e dei vasi alle micro-occlusioni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, colmando il divario tra studi meccanicistici e ricerca traslazionale in biologia neurovascolare.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi sui meccanismi di danno microvascolare e di rimozione mediante imaging in tempo reale.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per la valutazione di terapie sperimentali in vivo.
- Analisi: Permette il confronto statistico del carico di embolia, del danno tissutale e del recupero tra gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati meccanicistici a endpoint rilevanti per le malattie e allo sviluppo di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma standardizzata e riutilizzabile per la ricerca neurovascolare e la sperimentazione di interventi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi neurovascolari e nella riduzione del rischio meccanicistico.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità attraverso protocolli standardizzati di imaging e iniezione.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento/cessazione fornendo dati quantitativi longitudinali sugli esiti vascolari e tissutali.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio dei programmi neurovascolari sulla base di solide evidenze in vivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microchirurgia, imaging in vivo e analisi quantitativa di eventi vascolari.
- Richiede l'accesso a microscopia a due fotoni e a infrastrutture per imaging 3D post-mortem.
- Necessita di una standardizzazione tra team diversi delle miscele di iniezione e dei protocolli di imaging per garantire la riproducibilità.
- Adattabile a vari modelli murini, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per diverse aree vascolari.
- Limitazioni potenziali includono la complessità tecnica e la necessità di un monitoraggio longitudinale degli animali.
