Test di biodegradazione aerobica dei materiali utilizzando un inoculo naturale di acqua marina marina e un respirometro a circuito chiuso

La nostra ricerca quantifica il tasso di biodegradazione aerobica e il grado di materiali naturali nell'ambiente marino utilizzando l'inoculo naturale dell'acqua di mare per il confronto dei dati. Le nostre attuali sfide sperimentali includono una capacità di test limitata e la mancanza di infrastrutture per soddisfare la crescente domanda di test di biodegradazione, garantendo al contempo metodi uniformi e trasparenti tra i laboratori. Per cominciare, raccogli da 10 a 20 litri di acqua di mare in una damigiana da 20 litri con lisciviazione acida usando una grande bottiglia di Niskin.

Trasporta la damiana piena di nuovo in laboratorio. Trasferire un litro di acqua di mare intera dal damigiana in una bottiglia HDPE ambrata da un litro con acido per l'analisi del carbonio e dell'azoto. Filtrarla attraverso una membrana acetata di cellulosa a basso contenuto di azoto e 0,2 micrometri.

Ora, riempi una fiaschetta volumetrica da uno, due o quattro litri fino a metà con acqua di mare. Se l'acqua di mare contiene materia organica ad alto contenuto particolato, si setaccia attraverso una rete da 20 micrometri per rimuovere particelle grandi e eterogenee. Poi raccoglie 60 millilitri di filtrato in una bottiglia di polietilene con liscivia acida per l'analisi dell'azoto e del fosforo disciolto, inorganico e organico.

Copri leggermente l'apertura della damigiana per permettere condizioni aerobiche. Conserva al buio a 30 gradi Celsius per un massimo di sette giorni. Successivamente, posiziona da 10 a 15 grammi del substrato sperimentale in un barattolo di fresatura in acciaio inox da 50 millilitri.

Con una palla d'acciaio da 20 millimetri. Immergi il barattolo da macinazione in azoto liquido per 15 minuti per farlo sfiorare. Fissa il barattolo di fresatura nell'accessorio del mulino a sfera.

Poi imposta lo strumento a 30 hertz e due minuti e 30 secondi, e premi start. Esegui la macinazione quattro volte con 30 secondi di raffreddamento in azoto liquido tra un ciclo e l'altro. Fresa il substrato a una dimensione uniforme delle particelle tra 0,10 e 0,25 millimetri prima dell'inizio del test.

Utilizzando una bilancia di precisione con sensibilità di 0,001 grammi, pesa 0,5 grammi per litro di cloruro di ammonio e 0,1 grammi per litro di fosfato di potassio monobasico. Aggiungi i nutrienti inorganici alla fiaschetta. Porta il volume a segnare usando acqua di mare.

Poi inserisci una barra di mescolare e mescola su un piatto finché tutti i sali non si sciolgono. Su una bilancia analitica, pesa 20 milligrammi del substrato sperimentale o di controllo. Annota il peso completo della lettura e metti da parte la fiala.

Per allestire le navi del reattore, si utilizza una pipetta volumetrica da 75 millilitri con lancivia acida e un regolatore motorizzato e aspira l'acqua di mare per erogare 75 millilitri di acqua di mare integrata in nutrienti in ciascuna nave del reattore. Rimuovere circa tre millilitri di acqua di mare da ogni imbarcazione. Poi posizionala su una superficie pulita accanto al recipiente per risciacquare il substrato macinato dalla fiala strappata.

Ora trasferisci il substrato macinato nel recipiente corrispondente del reattore dalla fiala strappata. Metti un anello O sul bordo del recipiente del reattore. Poi posiziona un coperchio a due porte sopra l'anello O e fissa con un tappo a vite.

Collega ogni recipiente del reattore alle linee corrispondenti di gas o condensazione. Inserisci saldamente le tubazioni del gas nelle prese di ingresso e uscita appropriate sul coperchio. Accendi la piattaforma shaker a 0,05G in modalità continua.

Controlla visivamente che tutti i recipienti siano ben sicuri, poi chiudi la porta dell'incubatrice. Nel software dello strumento, naviga su Sperimentazione e clicca su Imposta. Inserisci i numeri dei canali di inizio e fine dai menu a tendina corrispondenti ai canali occupati.

Imposta la soglia di aggiornamento a 0,50. Aggiorna l'intervallo su NA e aggiorna la finestra su Auto. Poi seleziona la casella per i sensori di purga sotto Configurazione Varie.

Assicurati che non siano selezionati i moduli Misurazione Automatica del Volume, Consumo di Ossigeno Positivo e Attiva Modalità Flusso Aperto. Imposta l'intervallo campione a 8.00. Poi imposta le unità di gas e tempo secondo necessità.

Se si utilizza una sonda primaria per la temperatura di incubazione, assicurarsi che non venga selezionato Inserire manualmente le temperature della camera. Seleziona la casella per la Modalità Ventilazione e assicurati che la Modalità Scarico non sia selezionata. Ora, seleziona Configurazione Camera e inserisci le etichette descrittive dei canali.

Se è indicata una perdita, assicurarsi che l'O-ring sia pulito, posizionato e privo di particelle o fibre. Stringi il tappo a vite. Ispeziona le connessioni dei tubi all'ingresso e all'uscita.

Rifilare i tubi usurati o deformati si terminano con una lama affilata per produrre tagli puliti. Dal menu, seleziona Strumenti, poi clicca su Menu Assistenza e conferma che la sonda primaria di temperatura misura 30 gradi Celsius con variazioni di due gradi ed è stabile. Clicca su Esegui per iniziare l'esperimento.

Salva il file dell'esperimento con un nome descrittivo, inclusa la data, e registra il nome del file nel foglio dati. La produzione cumulativa di anidride carbonica in 84 giorni ha confermato la performance attesa. In 84 giorni, la cellulosa ha mostrato una rapida produzione di anidride carbonica dopo un breve ritardo e ha raggiunto circa 700 micromoli.

PHA ha mostrato un tasso iniziale più lento in tre giorni. E il controllo dell'acqua di mare è rimasto basso a 150 micromoli. Le repliche di controllo negative individuali mostravano bassa variabilità, con tutte le curve rimasero vicine tra loro.

Le repliche di controllo positivo per cellulosa hanno mostrato costantemente bassa variabilità, confermando prestazioni stabili su tutte e quattro le repliche. Nel dataset negativo, il prodotto replicato cinque ha mostrato un picco anomalo nella produzione di anidride carbonica, probabilmente dovuto a materia organica labile, ma la sua produzione cumulativa ha iniziato a stabilizzarsi a 100 micromoli. Repliche, una su sei, ha avuto una produzione cumulativa di anidride carbonica inferiore rispetto ad altre, suggerendo potenziali problemi tecnici.

L'errore standard della produzione media cumulativa di anidride carbonica nel controllo negativo era del 2,5%, indicando una bassa variabilità tra le repliche. L'errore standard per il controllo positivo della cellulosa è stato dello 0,83%, confermando ulteriormente l'elevata riproducibilità del test di biodegradazione. PHA presenta un'elevata mineralizzazione vicino al controllo positivo con errore standard paragonabile al controllo.

Questo protocollo affronta la lacuna nei metodi standardizzati accessibili per lo screening della biodegradabilità dei materiali nell'ambiente marino per l'industria, il mondo accademico e gli enti regolatori. Il protocollo offre un modo standardizzato più rapido per misurare direttamente questa biodegradazione, con una durata di test più breve nella valutazione simultanea del campione. Il protocollo consente test standardizzati ad alta capacità di produzione per la comparabilità tra materiali e laboratorio per il machine learning e la modellazione predittiva delle prestazioni dei materiali.