Name: Determinazione e quantificazione dellinfezione litica de novo da herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi libero da cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Scopri un metodo in vitro per modellare l'infezione litica de novo del KSHV usando cellule HCT116. Questo protocollo permette di studiare la replicazione virale e i primi eventi dell'herpesvirus con riproducibilità.

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<ol><li>Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma+herpesvirus%2Fhuman+herpesvirus-8+%28KSHV%2FHHV8%29%2C+and+the+oncogenesis+of+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma herpesvirus/human herpesvirus-8 (KSHV/HHV8), and the oncogenesis of Kaposi's sarcoma.</a> Nat Rev Cancer. 10 (10), 707(2010).</li>
<li>Cesarman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gammaherpesvirus+and+lymphoproliferative+disorders+in+immunocompromised+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients.</a> Cancer Lett. 305 (2), 163-174 (2011).</li>
<li>Golas, G., Alonso, J. D., Toth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+de+novo+lytic+infection+of+dermal+lymphatic+microvascular+endothelial+cells+by+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of de novo lytic infection of dermal lymphatic microvascular endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Virology. 536, 27-31 (2019).</li>
<li>Dittmer, D. P., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+immunobiology%2C+oncogenesis%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Kaposi sarcoma-associated herpesvirus: immunobiology, oncogenesis, and therapy.</a> J Clin Invest. 126 (9), 3165-3175 (2016).</li>
<li>Chang, H. H., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+herpesviral+transcriptional+program+in+KSHV-infected+lymphatic+endothelial+cells+leads+to+mTORC1+activation+and+rapamycin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A unique herpesviral transcriptional program in KSHV-infected lymphatic endothelial cells leads to mTORC1 activation and rapamycin sensitivity.</a> Cell Host Microbe. 13 (4), 429-440 (2013).</li>
<li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li>
<li>Myoung, J., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+doxycycline-inducible+KSHV+producer+cell+line+of+endothelial+origin%3A+Maintenance+of+tight+latency+with+efficient+reactivation+upon+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction.</a> J Virol Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).</li>
<li>Grundhoff, A., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+establishment+of+KSHV+latency+suggests+an+additional+role+for+continued+lytic+replication+in+Kaposi+sarcoma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Inefficient establishment of KSHV latency suggests an additional role for continued lytic replication in Kaposi sarcoma pathogenesis.</a> J Clin Invest. 113 (1), 124-136 (2004).</li>
<li>Gao, S. J., Deng, J. H., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Productive+lytic+replication+of+a+recombinant+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+in+efficient+primary+infection+of+primary+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Productive lytic replication of a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in efficient primary infection of primary human endothelial cells.</a> J Virol. 77 (18), 9738-9749 (2003).</li>
<li>Atyeo, N., Chae, M. Y., Toth, Z., Sharma, A., Papp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+immediate+early+proteins+trigger+FOXQ1+expression+in+oral+epithelial+cells%2C+engaging+in+a+novel+lytic+cycle-sustaining+positive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus immediate early proteins trigger FOXQ1 expression in oral epithelial cells, engaging in a novel lytic cycle-sustaining positive feedback loop.</a> J Virol. 97 (3), e0169622(2023).</li>
<li>Lagunoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+infection+and+serial+transmission+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+in+cultured+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">De novo infection and serial transmission of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in cultured endothelial cells.</a> J Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).</li>
<li>ViejoBorbolla, A., Schulz, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and innate immunity.</a> J Gen Virol. 98 (2), 271-284 (2017).</li>
<li>Chandran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+infection+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Early events in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of target cells.</a> J Virol. 84 (5), 2188-2199 (2010).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+induces+mitochondrial+fission+to+evade+host+immune+responses+and+promote+viral+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus induces mitochondrial fission to evade host immune responses and promote viral production.</a> Nat Microbiol. 10 (6), 1501-1520 (2025).</li>
<li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+HIF-1alpha+promote+lytic+de+novo+KSHV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and HIF-1alpha promote lytic de novo KSHV infection.</a> J Virol. 97 (11), e0097223(2023).</li>
<li>White, I. E., Campbell, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+cell-free+and+cell-associated+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+DNA+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of cell-free and cell-associated Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus DNA by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 38 (5), 1992-1995 (2000).</li>
<li>Bechtel, J., Grundhoff, A., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAs+in+the+virion+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">RNAs in the virion of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> J Virol. 79 (16), 10138-10146 (2005).</li>
<li>Lin, X., Li, X., Liang, D., Lan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+unusual+small+RNAs+discovered+in+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and unusual small RNAs discovered in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus virions.</a> J Virol. 86 (23), 12717-12730 (2012).</li>
<li>Watzinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+PCR+assays+for+detection+and+monitoring+of+pathogenic+human+viruses+in+immunosuppressed+pediatric+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients.</a> J Clin Microbiol. 42 (11), 5189-5198 (2004).</li>
<li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+of+angelicin+against+gammaherpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity of angelicin against gammaherpesviruses.</a> Antiviral Res. 100 (1), 75-83 (2013).</li>
<li>Coen, N., Duraffour, S., Snoeck, R., Andrei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+targeted+therapy%3A+An+update+on+inhibitors+of+viral+lytic+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">KSHV targeted therapy: An update on inhibitors of viral lytic replication.</a> Viruses. 6 (11), 4731-4759 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,45 & micro; m filtro in polietersulfoma (PES)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>76479-020</td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender</td><td>N/A</td><td>Il progetto grafico è stato realizzato con BioRender.com, per il quale gli autori possiedono una licenza</td></tr><tr><td>Sistema di PCR in tempo reale CFX Opus 96</td><td>Bio-Rad</td><td>184-5072</td><td></td></tr><tr><td>DMEM completo</td><td></td><td></td><td>Il medium Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich) integrato con siero fetale bovino al 10% (v/v) (FBS; Gibco), 2 mM di L-glutammina (Gibco) e 100U/ml di penicillina-streptomicina (Pen-Strep; GenClone).</td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Biolaboratori del New England</td><td>Codice: M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso LSR II 18</td><td>BD Bioscienze</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Verde Master SuperMix</td><td>Quantabio</td><td>95054-02K</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>butirrato di sodio (NaB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione e quantificazione dell'infezione litica de novo da herpesvirus associato al sarcoma di kaposi libero da cellule

Establishment and Quantification of De Novo Lytic Infection by Cell-free Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus

Determinazione e quantificazione dell'infezione litica de novo da herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi libero da cellule

Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), a gammaherpesvirus implicated in multiple human malignancies, can undergo lytic replication during primary ...

establishment-quantification-de-novo-lytic-infection-cell-free-kaposi

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fattori cellula ospite giocano un ruolo critico nella creazione e mantenimento di sarcoma di Kaposi (KS). Delineiamo metodi per identificare i fattori cellula ospite alterato nelle cellule DMVEC KSHV-infetti, e nel tessuto tumorale KS. Geni cellulari alterato da virus servirà come potenziale bersaglio (s) per nuove terapie.

Identificare i geni disregolazione indotta da sarcoma di Kaposi associato Herpesvirus (KSHV)

Descriviamo un protocollo per identificare i ruoli chiave di molecole di segnalazione di accoglienza nella replicazione litica di un herpesvirus modello, gamma herpesvirus 68 (γHV68). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali per γHV68 replica litico, il protocollo consente sia la caratterizzazione fenotipica e molecolare del virus interrogatorio interazioni ospite-in replicazione virale litico.

Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

Herpesvirus-γ (γ-HVS) stabilisce per tutta la vita persistenza nel loro ospite. L'infezione di topi con γ-HV68 offre una geneticamente...

Misura della γHV68 infezione nei topi

Un metodo di osservazione singole molecole di DNA in cellule vive è descritto. La tecnica si basa sul legame di una proteina fluorescente etichettato repressore lac di siti di legame ingegnerizzati nel DNA di interesse. Questo metodo può essere adattato per seguire molti DNA ricombinanti in cellule vive nel tempo.

Monitoraggio replica plasmide in cellule di mammifero in diretta nel corso di generazioni multiple mediante microscopia a fluorescenza

Questo video descrive il test della placca virale del virus infettivo dell'herpes simplex o HSV. Le particelle virali diluite vengono inoculate nel monostrato di cellule epiteliali. Dopo l'incubazione, il virus forma placche e viene contato visivamente per determinare il titolo del virus infettivo.

Saggio della placca virale: una tecnica per misurare il virus infettivo dell'herpes simplex attraverso la quantificazione delle placche formate nel monostrato di cellule infettate da virus

Descriviamo un protocollo per misurare la produzione di citochina antivirale in topi infettati con un modello herpesvirus, murina gamma herpesvirus 68 (γ HV68) che è strettamente correlata alla associato al sarcoma herpesvirus di Kaposi umano (KSHV) e virus di Epstein-Barr (EBV). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali di topo (MEF), abbiamo valutato la produzione di citochina antivirale sia in vivo e ex vivo. "Ricostituzione" l'espressione di componenti...

Dissezione Innate Immune Signaling in Evasion virale di produzione di citochine

Abbiamo stabilito un protocollo di ibridazione fluorescente in situ per la rilevazione di un genoma del virus DNA persistente all'interno di sezioni tissutali di modelli animali. Questo protocollo permette studiando processo di infezione da codetection del genoma virale, i suoi prodotti di RNA e proteine ​​virali o cellulari all'interno delle cellule singole.

La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

La pelle è un tessuto bersaglio del virus dell'herpes simplex umano di tipo 1 (HSV-1). Per esplorare la via di invasione dell'HSV-1 nei tessuti, abbiamo stabilito un modello di infezione ex vivo di fogli epidermici murini che rappresentano lo strato più esterno della pelle.

Ex Vivo infezione di Murine epidermide con Herpes Simplex Virus di tipo 1

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore indotto tramite l'infezione con il virus oncogeno herpesvirus-8/KS il herpesvirus umano (HHV-8/KSHV). Il modello di coltura delle cellule endoteliali descritto qui è specificatamente concepito per studiare i meccanismi da cui KSHV trasforma le cellule ospite.

Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi

Descriviamo un protocollo che utilizza la fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH) per visualizzare più RNA herpesvirali all'interno di cellule umane lytically infette, sia in sospensione che aderenti. Questo protocollo include la quantificazione della fluorescenza producendo un rapporto nucleocitoplasmatica e può essere esteso per la visualizzazione simultanea di proteine ospite e virali con immunofluorescenza (IF).

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) e Immunofluorescence (IF) di prodotti genici specifici nelle cellule infette da KSHV

Questo protocollo consente l'isolamento delle particelle virali di Epstein-Barr dalla linea cellulare umana P3HR1 inducendo il ciclo litico virale con forbolo 12-miristato 13-acetato. Il DNA viene successivamente estratto dalla preparazione virale e sottoposto a PCR in tempo reale per quantificare la concentrazione di particelle virali.

Isolamento e quantificazione del virus Epstein-Barr dalla linea cellulare P3HR1

Scopri un metodo in vitro per modellare l'infezione litica de novo del KSHV usando cellule HCT116. Questo protocollo permette di studiare la replicazione virale e i primi eventi dell'herpesvirus con riproducibilità.

Determinazione e quantificazione dell'infezione litica de novo da herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi libero da cellule

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