Flusso di lavoro standardizzato SDS-PAGE per la profilazione personalizzata della corona proteica nella diagnosi precoce del cancro

Studiamo come le nanoparticelle interagiscono con il sangue per rivelare i primi segni tumorali, puntando a un test diagnostico semplice e riproducibile e principalmente non invasivo. Per cominciare, diluire la soluzione di quattro milligrammi per millilitro di nano fogli di ossido di grafene in acqua ultrapura fino alla concentrazione desiderata. Sonicare la soluzione diluita per due minuti al 28% di ampiezza con un'impostazione di impulso di otto secondi accesi e sei secondi di spezza per garantire una dispersione uniforme.

Quantificare la concentrazione della soluzione dispersa utilizzando spettroscopia visibile ultravioletta. Successivamente misura la dimensione idrodinamica e il potenziale zeta della soluzione utilizzando la diffusione dinamica della luce con un laser al neon di elio da 633 nanometri. Diluire il campione in acqua ultrapura secondo i limiti di rilevamento QVet.

Successivamente, diluire il plasma umano liofilizzato commerciale con acqua ultrapura secondo necessità. Centrifugare il plasma ricostituito a 18.620 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogli il sovrantagente e conservalo a meno 80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo.

Ora, quantifica la concentrazione di proteine usando il saggio sull'acido bicinconinico per regolare la diluizione del plasma e determinare il rapporto ottimale tra nanoparticelle e plasma. Mescola il volume selezionato di nanoparticelle con plasma per ottenere il rapporto target tra i due. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per un'ora.

Per isolare la corona proteica, centrifugare i campioni di plasma nanoparticolale a 18.620 G a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Lava il pellet risultante con 200 microlitri di acqua ultrapura. Poi risospendila e centrifuga di nuovo.

Dopo il lavaggio finale, confermare la presenza di un pellet compatto come prova dell'isolamento del complesso proteico nanoparticellare. Successivamente, mescola l'agente riducente, il tampone di carico e l'acqua per raggiungere il volume calcolato del tampone di carico. Sospezione del pellet nel buffer di carico preparato.

Poi bollisci la sospensione a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifuga il campione bollito a 18.620 G a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Raccogli il soprantantante in un nuovo tubo.

Ora, prepara la scala proteica diluendo lo standard di peso molecolare in un tampone non colorato con il tampone colorato. Diluire 10 x Tris-Glicina-SDS con tampone di funzionamento a una concentrazione x. Assemblare la camera di elettroforesi usando un gel senza colorazioni dal quattro al 20%.

Poi versa il buffer di funzionamento finché non raggiunge il livello raccomandato dal produttore. Carica 10 microlitri di campione in ogni pozzo. Poi pipetta sette microlitri di scala in ogni pozzo.

Fai funzionare il gel a 150 volt per circa 90 minuti a temperatura ambiente. Memorizza l'immagine gel come file tiff nella stessa cartella degli script. Poi apri la lavorazione del gel.

Sono in MATLAB. Inserisci il nome dell'immagine gel come nome dell'immagine. Poi inserisci l'indice di una corsia scala come indicatore di indice.

Esegui lo script. Il completamento dei passaggi sarà indicato nella finestra dei comandi e quattro finestre appariranno sullo schermo. Ora, apri la figura uno con l'immagine originale del gel in alto e la sua correzione per l'effetto corsia obliqua in basso.

Modifica i valori della correzione a sinistra e a destra per accordare i parametri di correzione. Apri la Figura Due. Contiene l'immagine corretta per l'effetto corsia obliqua in alto e l'immagine rimossa sullo sfondo in basso.

Regola il valore di BKG par X nello script per adattare la rimozione dello sfondo. Nota che tutte le corsie identificate sono indicate come linee bianche verticali nella Figura Due. Ora, apri la Figura Tre che contiene il profilo di intensità della corsia del marcatore con i picchi rilevati a sinistra e un adattamento non lineare con il valore di R quadrato a destra.

Controlla due volte che il numero di bande attese nella corsia scala corrisponda al numero di picchi rilevati utilizzati per la procedura di adattamento. Apri quindi la Figura Quattro contenente i profili di intensità normalizzati per tutte le corsie rilevate nel gel. Imposta il parametro di esportazione a uno per esportare i profili di intensità in funzione dei pesi molecolari in un file Excel.

Esegui lo script. Dopo il completamento, verrà generato un foglio Excel nella cartella di lavoro contenente i profili assoluti e normalizzati in funzione del peso molecolare nella prima colonna. Poi apri il file Gel Profiles Pro M e esegui lo script.

Quattro finestre appaiono sullo schermo. Apri la Figura Cinque contenente i profili di intensità assoluta in alto e le corrispondenti intensità totali in basso per ogni corsia. E la Figura Sei contenente i profili di intensità normalizzati per ogni corsia.

Con l'asse del peso molecolare suddiviso secondo gli intervalli specificati come reg nello script. Imposta i dati di esportazione su uno per esportare le aree integrali assolute e normalizzate. Esegui lo script.

Dopo il completamento, verrà generato un foglio di calcolo nella cartella di lavoro contenente le aree assolute e normalizzate esportate entro i range specificati di peso molecolare. Infine, apri Figure Seven e Eight. Contengono l'istogramma delle aree assolute e normalizzate per ogni corsia, raggruppate rispettivamente per corsia e per area.

Il protocollo qui presentato stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e riproducibile per isolare e caratterizzare la corona proteica formata sulle nanoparticelle dopo l'incubazione con plasma. Questo metodo produce profili SDS altamente coerenti in grado di catturare caratteristiche biologicamente significative e diagnosticamente rilevanti di ogni corona personalizzata. I profili SDS ottenuti in tutte le condizioni erano altamente riproducibili.

L'aumento delle concentrazioni plasmatiche dal 5% al 50% ha portato a intensità di segnale più forti nella regione da 30 a 80 kilodalton nei profili SDS. Il flusso di lavoro automatizzato di pipetting ha prodotto profili elettroforetici quasi identici. L'ossido di grafene produceva costantemente profili coronani stabili ben risolti, attribuiti alla sua elevata superficie e alle proprietà cariche.

Le distribuzioni di dimensioni dei campioni di ossido di grafene piccoli, medi e grandi erano strette, non sovrapposte e centrate rispettivamente intorno a 100, 300 e 750 nanometri. I profili SDS delle Corona proteiche formate su ossido di grafene erano simili in diverse dimensioni. Sebbene siano state osservate differenze nette tra le diverse diluizioni, concentrazioni plasmatiche più basse hanno prodotto bande più intense in specifiche fasce di peso molecolare, indicando un arricchimento proteico selettivo.

Nelle diluizioni plasmatiche intermedie, i profili della densità metrica hanno rivelato differenze specifiche per la malattia, specialmente nella regione dei 20-30 kilodalton, dove i campioni di PDAC hanno mostrato una riduzione dell'intensità del segnale. Il modello di profilazione basato su pagine SDS da solo identificava correttamente sia i campioni PDAC che quelli di controllo con un'accuratezza dell'83% e una sensibilità e specificità bilanciate. Il modello diagnostico combinato che incorpora i profili SDS delle pagine corona e i livelli CA da 19 a 9 raggiunge la massima accuratezza, sensibilità e specificità nella classificazione dei pazienti PDAC.

Utilizziamo flussi di lavoro automatizzati, tecniche non basate sulla tecnologia e strumenti basati sull'IA per far avanzare la ricerca diagnostica sul cancro. Il nostro protocollo è rapido, facile da usare, conforme all'OMS, garantendo le impronte digitali riproducibili standardizzate della corona con forte rilevanza diagnostica.