Amiloid e l'architettura Cross-Beta

La nostra ricerca utilizza la diffrazione delle fibre a raggi X per indagare la struttura della fibrilla amiloide incrociata beta e la sua organizzazione molecolare. Questo protocollo utilizza la diffrazione delle fibre a raggi X per confermare i pattern cross-beta e chiarire le architetture delle fibrille. Questo protocollo consente l'analisi strutturale delle fibrille amiloidi, dalla conferma dell'organizzazione incrociata beta fino all'elucidazione di ulteriori dettagli molecolari.

Per cominciare, allineare le fibrille proteiche o peptidiche per produrre un fascio i cui assi delle fibre sono idealmente tutti paralleli. Sciogli la cera di candela con una piastra calda finché non si liquefia. Con un tagliavetro, taglia capillari di vetro borosilicato da 1 millimetro a una lunghezza di circa 2-3 centimetri.

Immergi brevemente i capillari tagliati nella cera liquida. Poi ritira la cera di candela verso l'alto con azione capillare fino a circa 1-2 millimetri all'interno del capillare. Ora usa plastilina per fissare orizzontalmente i capillari sigillati all'interno di una piastra di Petri.

Mantieni uno spazio di 0,5-2 millimetri tra le estremità riempite di cera dei capillari. Con una pipetta, sospendere con cura una goccia di 10 microlitri di soluzione di fibrilla tra le estremità riempite di cera dei due capillari. Copri la piastra di Petri per proteggere il campione dalla polvere e lascia evaporare durante la notte.

Poi sigilla la piastra per mantenere un ambiente di asciugatura controllato. Per allineare le fibrille amiloidi in un capillare di vetro, si fissa una siringa da 1 millilitro con tubo di gomma all'estremità larga di un capillare di vetro siliconizzato di 0,7 millimetri di diametro. Aspira 2-3 centimetri di sospensione fibrilare nel capillare.

Sigilla un'estremità del capillare usando cera fusa e lascia l'altra estremità aperta per permettere l'evaporazione. Disposizionete il capillare verticalmente e lasciatelo asciugare finché non si forma un disco essiccato. Per allineare le fibrille come tappetino o film sottile, posiziona un campione di fibrilla ad alta concentrazione su un vetrino di vetro e coprirlo prima di asciugare all'aria per 24 ore.

Montare con attenzione il fascio di fibrille su una testa goniometrica e orientarlo in modo che il fascio di raggi X attraversi il fascio. Se si utilizza un campione di tappetino fibrilato, orientarlo in modo che il fascio di raggi X passi attraverso il bordo del tappeto. Esaminare il campione sotto un microscopio luminoso dotato di polarizzatore incrociato per osservare la birifringenza.

Posizionare il campione nel fascio di raggi X in base al fatto che si tratti di un fibrato, un tappetino o un disco. Raccogli un pattern di diffrazione utilizzando apparecchiature a raggi X interne o radiazioni di sincrotrone. Per eseguire l'analisi dei dati, carica il file nel software di analisi dei pattern di diffrazione CLEARER.

Naviga su Pattern di diffrazione e Impostazione di diffrazione per inserire le impostazioni di diffrazione, inclusa dimensione del pixel, sorgente a raggi X e distanza campione-rilevatore. Clicca su Elaborazione Immagini e Ruota per ruotare l'immagine di diffrazione in modo che il meridiano sia verticale. Usa il modulo di centraggio navigando su Pattern di diffrazione e cliccando su Immagine Centrale per centrare l'immagine.

Definisci gli assi meridiano ed equatore. Salva l'immagine centrata per un'analisi successiva. Successivamente, specifica un angolo appropriato lungo il meridiano e l'equatore.

Clicca su Pattern di diffrazione e poi su modulo Radially Average per generare un grafico della posizione del segnale di diffrazione. rispetto all'intensità. Naviga al modulo Peak Find dal menu Diagramma di Diffrazione per misurare e inviare automaticamente il segnale di diffrazione.

Regola la larghezza di ricerca di picco per rilevare segnali veri senza rumore. Usa l'opzione zoom e misura per verificare la posizione del segnale di diffrazione usando il picco di trovamento. Esplora le potenziali dimensioni delle celle unitarie utilizzando il modulo di ottimizzazione delle celle unitarie.

Inserire stime iniziali basate su segnali equatoriali forti e definire gli indici minimo e massimo per la ricerca delle celle. Calcola le dimensioni potenziali delle celle unitarie e confronta le posizioni previste dei segnali di diffrazione con le riflessioni osservate. Seleziona la cella unitaria che si adatta meglio ai dati e al campione.

Per costruire modelli molecolari, realizza disposizioni 3D dei peptidi in una configurazione a foglio beta che si adatti alla cella unitaria determinata. Assicurati che tutti i componenti legati alla simmetria siano inclusi. Successivamente, clicca su Simulazione di diffrazione seguito da Strutture e Generatore di Catena Strutturale e carica il modello PDB.

Assegna l'asse della fibra e dell'asse del fascio, inserisci le dimensioni della cella unitaria e poi controlla la presenza di conflitti sterici. Naviga fino a Simulazione di Diffrazione e clicca su Simulazione di Diffrazione Fibra per caricare le coordinate PDB nel modulo Simulazione di Diffrazione Fibra. Inserisci la direzione dell'asse della fibra, l'orientamento del fascio, le dimensioni della cella unitaria, la sorgente a raggi X e le impostazioni del rivelatore, poi clicca su Simulare per eseguire la simulazione.

Assicurati che l'asse del fascio sia perpendicolare all'asse della fibra. Poi naviga su File e clicca su Salva come per salvare le impostazioni della simulazione come file html da modificare successivamente. Salva il pattern simulato di diffrazione in formato RAW o come file TIFF.

Confrontare il pattern simulato con quello sperimentale di diffrazione. Misura i segnali simulati di diffrazione utilizzando lo stesso flusso di lavoro di analisi. Registra e confronta questi valori con dati sperimentali.

Le micrografie elettroniche hanno mostrato un'alta densità di fibrille amiloidi sulla griglia adatte alla preparazione di un campione di fibra a raggi X. Le fibre allineate con telai elastici producevano un caratteristico pattern di diffrazione cross-beta con una riflessione meridiale a 4,76 angstrom e riflessioni equatoriali derivanti dalla lunghezza della catena, dalla distanza dei fogli e dalla dimensione del protofilamento. Un modello idealizzato di diffrazione incrociale beta dimostrò che le riflessioni meridiali ed equatoriali corrispondono a distanziamenti ripetitivi lungo gli assi delle fibre.

Un modello di diffrazione ben centrato era simmetrico con i picchi equatoriali e meridiali che si sovrappongevano in posizione. I picchi di diffrazione venivano automaticamente rilevati e elencati tramite analisi di ricerca dei picchi. I picchi di diffrazione rilevati sono stati utilizzati per identificare dimensioni plausibili delle celle unitarie.

Un modello strutturale è stato preparato utilizzando la cella unitaria identificata e visualizzato prima della simulazione di diffrazione. I dati simulati di diffrazione generati dal modello strutturale proposto hanno mostrato una ragionevole concordanza con il pattern sperimentale di diffrazione sia nelle posizioni di riflessione sia nelle intensità relative. La sovrapposizione di pattern simulati e sperimentali di diffrazione ha ulteriormente dimostrato l'allineamento delle riflessioni corrispondenti.

Un corretto allineamento del campione è fondamentale perché determina la qualità dei dati di diffrazione e le informazioni ottenute da essi. Questo lavoro consente la modellazione strutturale a risoluzione atomica e l'integrazione con altre tecniche strutturali, come l'AFM, per consentire strutture molecolari dettagliate.