In-vitro Ricostituzione dell'ubiquitinazione batterica ed eliminazione mediata da VCP/p97

Il nostro lavoro svela come VCP o p97 agiscono come difensori citosolici contro molteplici patogeni diversi. Questo sblocca il potenziale di VCP o p97 per applicazioni terapeutiche e strategie di bioingegneria. Oltre alla biochimica di routine, vengono utilizzate microscopie a super risoluzione, criogenica EM, criogenica ET per capire come questi effettori ospiti si organizzino sul patogeno per distruggerli.

Per cominciare, coltivare la polmonite da streptococco è da sei ceppi di sierotipo due durante la notte a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% nel mezzo di lievito Todd Hewitt. Inoculare una parte della coltura notturna in 10 parti di mezzo fresco di lievito Todd Hewitt e incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% fino a raggiungere la densità ottica a 600 nanometri 0,4. Poi si mescolano 900 microlitri di coltura per la polmonite da streptococco con 600 microlitri di glicerolo al 50% e si conserva lo stock glicerolo a meno 80 gradi Celsius.

Poi scongela una nuova scorta di polmonite da streptococco da meno 80 gradi Celsius e inoculala completamente in cinque millilitri di medium per lievito Todd Hewitt. Prendi circa 10 al livello di sette cellule di polmonite da streptococco. Per lavare accuratamente le cellule, risospendere i batteri nel tampone di reazione e centrifugare a 21.000 G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Risospendere il pellet con un lisato di 549 cellule mammiferiche. Poi aggiungi ubiquitina purificata e un millimolare adenosina trifosfato e incuba la miscela per una o due ore a 27 gradi Celsius. Poi lava i batteri una volta con tampone di reazione contenente un'urea molare, seguita da due lavaggi aggiuntivi solo con il tampone di reazione.

Fissa i batteri con l'1% di paraformaldeide. Dopo la fissazione, incubare le cellule con PBS, contenente un milligrammo per millilitro di glicina, per 15 minuti. Poi lava due volte con PBS.

Prepara una miscela di reazione combinando ubiquitina con altri componenti necessari nel buffer di reazione. Regola il volume totale della miscela di reazione a 100-150 microlitri. Sospendere nuovamente i batteri nella miscela di reazione contenente l'enzima ubiquitina e incubare la sospensione per due ore a 27 gradi Celsius.

Dopo aver lavato i batteri tre volte con tampone di reazione contenente urea, fissarli con l'1% di paraformaldeide. Dopo la fissazione, incubare le cellule con PBS, contenente un milligrammo per millilitro di glicina, per 15 minuti. Poi incubare il campione al 3% di BSA per un'ora a 27 gradi Celsius, e lavare il campione due volte con PBS.

Risospendere i batteri ubiquitinati in una soluzione primaria di anticorpi, preparata a concentrazioni più elevate rispetto a quelle tipicamente utilizzate negli saghi di immunofluorescenza. Poi incubare per un'ora a 27 gradi Celsius. Dopo aver lavato i batteri due volte con PBS, risospenderli nell'anticorpo secondario corrispondente coniugato con Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 555.

Ora si gettano circa 10-20 microlitri del campione batterico etichettato su un vetrino di vetro e si mescolano cinque-dieci microlitri di mezzo di montaggio con o senza DAPI. Posiziona un biglietto di copertura sopra il campione e usa carta velina per tamponare eventuali liquidi in eccesso. Combinare sei micromolari VCP p97 con un micromolare NPLOC4 e un micromolare UFD-1.

Regolare il volume della miscela di reazione a circa 90 microlitri, usando il tampone di reazione, e incubare sul ghiaccio per due ore. Successivamente, aggiungere uno o due millimolari adenosina trifosfato alla miscela di reazione contenente p97 UFD-1, NPLOC4. Poi combinare questo con 10 alla potenza di sette cellule ubiquitinate di polmonite da streptococco, e incubare per due ore a 37 gradi Celsius.

Immediatamente dopo il trattamento, preleva un'aliquota di 10 microlitri dalla miscela di reazione ed esegui una diluizione seriale. Inserire 10-20 microlitri di ciascuna diluizione sulle piastre di infusione cardiaca cerebrale. Valuta le unità di formazione di colonie tra i punti di tempo zero e due ore.

Calcola la percentuale di vitalità batterica dividendo il conteggio di CFU di due ore per il conteggio di CFU di un'ora zero e moltiplicando per 100. È stata osservata una significativa ubiquitinazione di streptococcus pneumoniae quando trattata sia con lisato cellulare di mammifero sia con un sistema enzimatico E-1, E-2, E-3 ricostituito. Il segnale di ubiquitinazione era assente nel controllo e notevolmente diminuito quando lo streptococcus pneumoniae ubiquitinizzato fu esposto a OTUB1, confermando la modifica della poliubiquitina collegata a K48.

Un'analisi del profilo lineare ha mostrato la completa sovrapposizione tra ubiquitina e segnali batterici, confermandone la co-localizzazione spaziale. La ricostruzione tridimensionale ha confermato la sovrapposizione spaziale dei segnali di ubiquitina e streptococcus pneumoniae. Il tipo selvatico p97, combinato con i suoi cofattori, UFD1 e NPLOC4, riduceva la vitalità batterica al 10-20% dopo due ore, indipendentemente dal fatto che l'ubiquitinazione fosse effettuata con lisato cellulare o con un sistema enzimatico purificato.

Non è stata osservata alcuna riduzione della vitalità batterica quando l'ubiquitinazione è stata omessa, quando p97 è stato inattivato dal calore o quando si utilizza il mutante cataliticamente inattivo p97, E57 8Q, confermando che sia l'ubiquitinazione che il p97 attivo sono essenziali per l'uccisione batterica. Il nostro studio apre la porta su come le ligasi ubiquitina E3 dell'ospite modifichino diversi patogeni e indagano i meccanismi effettori per eliminare le minacce infettive. Il nostro prossimo obiettivo è esplorare come il p97 o VCP venga regolato e ulteriormente ingegnerizzarlo per aumentarne l'attività antibatterica.