Name: In-vitro Ricostituzione dellubiquitinazione batterica ed eliminazione mediata da VCP/p97 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-02T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Scopri la ricostituzione in vitro dell'ubiquitinazione batterica e l'eliminazione mediata da VCP/p97 utilizzando Streptococcus pneumoniae. Questo metodo rivela il ruolo di VCP/p97 come difensore citosolico contro i patogeni.

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<ol><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unravelling+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (5), 322-324 (2015).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis%3A+from+the+lysosome+to+ubiquitin+and+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).</li>
<li>Damgaard, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%3A+from+cell+signalling+to+disease+biology+and+new+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system: from cell signalling to disease biology and new therapeutic opportunities.</a> Cell Death Differ. 28 (2), 423-426 (2021).</li>
<li>Deol, K. K., Lorenz, S., Strieter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+logic+of+ubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic logic of ubiquitin chain assembly.</a> Front Physiol. 10, 835(2019).</li>
<li>Kikkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HRD1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+involved+in+degradation+of+proteins+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human HRD1 is an E3 ubiquitin ligase involved in degradation of proteins from the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 279 (5), 3525-3534 (2004).</li>
<li>Korac, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-independent+function+of+optineurin+in+autophagic+clearance+of+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-independent function of optineurin in autophagic clearance of protein aggregates.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 2), 580-592 (2013).</li>
<li>Asmat, T. M., Agarwal, V., Saleh, M., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+Streptococcus+pneumoniae+via+the+polymeric+immunoglobulin+receptor+of+epithelial+cells+relies+on+clathrin-+and+caveolin-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of Streptococcus pneumoniae via the polymeric immunoglobulin receptor of epithelial cells relies on clathrin- and caveolin-dependent mechanisms.</a> Int J Med Microbiol. 304 (8), 1233-1246 (2014).</li>
<li>Ercoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+replication+of+Streptococcus+pneumoniae+inside+splenic+macrophages+serves+as+a+reservoir+for+septicaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular replication of Streptococcus pneumoniae inside splenic macrophages serves as a reservoir for septicaemia.</a> Nat Microbiol. 3 (5), 600-610 (2018).</li>
<li>Chakravortty, D., Rohde, M., Jäger, L., Deiwick, J., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+novel+surface+structure+encoded+by+Salmonella+pathogenicity+island+2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Formation of a novel surface structure encoded by Salmonella pathogenicity island 2.</a> EMBO J. 24 (11), 2043-2052 (2005).</li>
<li>Surve, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+pneumolysin+expression+governs+the+fate+of+Streptococcus+pneumoniae+during+blood-brain+barrier+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in pneumolysin expression governs the fate of Streptococcus pneumoniae during blood-brain barrier trafficking.</a> PLoS Pathog. 14 (7), e1007168(2018).</li>
<li>Franco, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+SMURF1+functions+in+selective+autophagy+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+anti-tuberculous+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase SMURF1 functions in selective autophagy of Mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host defense.</a> Cell Host Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).</li>
<li>Manzanillo, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Parkin+mediates+resistance+to+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Parkin mediates resistance to intracellular pathogens.</a> Nature. 501 (7468), 512-516 (2013).</li>
<li>Polajnar, M., Dietz, M. S., Heilemann, M., Behrends, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+host+cell+ubiquitylation+machinery+targeting+cytosolic+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella.</a> EMBO Rep. 18 (9), 1572-1585 (2017).</li>
<li>Huett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LRR+and+RING+domain+protein+LRSAM1+is+an+E3+ligase+crucial+for+ubiquitin-dependent+autophagy+of+intracellular+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The LRR and RING domain protein LRSAM1 is an E3 ligase crucial for ubiquitin-dependent autophagy of intracellular Salmonella typhimurium.</a> Cell Host Microbe. 12 (6), 778-790 (2012).</li>
<li>Otten, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitylation+of+lipopolysaccharide+by+RNF213+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection.</a> Nature. 594 (7861), 111-116 (2021).</li>
<li>Yamada, A., Hikichi, M., Nozawa, T., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FBXO2%2FSCF+ubiquitin+ligase+complex+directs+xenophagy+through+recognizing+bacterial+surface+glycan%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">FBXO2/SCF ubiquitin ligase complex directs xenophagy through recognizing bacterial surface glycan.</a> EMBO Rep. 22 (11), e52584(2021).</li>
<li>Apte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+innate+pathogen+sensing+strategy+involving+ubiquitination+of+bacterial+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">An innate pathogen sensing strategy involving ubiquitination of bacterial surface proteins.</a> Sci Adv. 9 (12), eade1851(2023).</li>
<li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+AAA-ATPase+VCP%2Fp97+lyses+ubiquitinated+intracellular+bacteria+as+an+innate+antimicrobial+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host AAA-ATPase VCP/p97 lyses ubiquitinated intracellular bacteria as an innate antimicrobial defence.</a> Nat Microbiol. , (2025).</li>
<li>Mitchell, G., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+to+intracellular+pathogens%3A+balancing+microbial+elimination+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Innate immunity to intracellular pathogens: balancing microbial elimination and inflammation.</a> Cell Host Microbe. 22 (2), 166-175 (2017).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J Mol Biol. 166 (4), 557-580 (1983).</li>
<li>Blythe, E. E., Olson, K. C., Chau, V., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-+and+ATP-dependent+unfoldase+activity+of+p97%2FVCP-NPLoc4-UFD1L+is+enhanced+by+a+mutation+that+causes+multisystem+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin- and ATP-dependent unfoldase activity of p97/VCP-NPLoc4-UFD1L is enhanced by a mutation that causes multisystem proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (22), E4380-E4388 (2017).</li>
<li>Ducker, C., Ratnam, M., Shaw, P. E., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+protein+expression+systems+and+PTM+landscape+in+the+study+of+transcription+factor+ELK-1%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of protein expression systems and PTM landscape in the study of transcription factor ELK-1.</a> Protein Expr Purif. 203, 106216(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi 50X</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G6521</td><td></td></tr><tr><td>6x-His-Ubiquitin</td><td>UBPBio</td><td>E1100</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare A549 &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ubiquitina</td><td>Enzo</td><td>BML-PW8810-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitina K48-specifico, clone dell'anticorpo Apu2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ZRB2150</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/a6419">A6419</a></td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>M210</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (glucosio alto)</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>AL251</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (origine statunitense)</td><td>38220090</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>PureSynth&nbsp;</td><td>PSR37325</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TC006</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6148</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pET28a-p97</td><td>Il nostro laboratorio</td><td></td><td>Plasmide disponibile su richiesta</td></tr><tr><td>Plasmide pET41b-NPLOC4</td><td>Il nostro laboratorio</td><td></td><td>Plasmide disponibile su richiesta</td></tr><tr><td>Plasmide pET41b-UFD1</td><td>Addgene</td><td>Plasmide #117107</td><td></td></tr><tr><td>Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23-030</td><td></td></tr><tr><td>Ceppo R6 di Streptococcus pneumoniae</td><td>ATCC</td><td>ATCC BAA-255</td><td>Patogeno del Gruppo di Rischio -2, da gestire nella struttura BSL-2</td></tr><tr><td>Polvere di brodo Todd Hewitt</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>M313</td><td></td></tr><tr><td>UBE1</td><td>UBPBio</td><td>B1100</td><td></td></tr><tr><td>UbE2C</td><td>UBPBio</td><td>C1300</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>MB032</td><td></td></tr><tr><td>Polvere di estratto di lievito &nbsp;</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>RM027</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro ricostituzione dell'ubiquitinazione batterica ed eliminazione mediata da vcp/p97

In-vitro Reconstitution of Bacterial Ubiquitination and VCP/p97-mediated Elimination

Il nostro protocollo dettaglia l'utilizzo di cellule A549 di mammiferi per produrre un lisato cellulare ricco dei componenti necessari per avviare un processo di ubiquitinazione (Figura 1A). Questo lisse, sia in stato concentrato sia sostituito da componenti purificati come UBE1 (l'enzima attivante dell'ubiquitina E1), UbE2C (un enzima coniugante dell'ubiquitina E2) e il complesso Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (la ligasi E3 dell'ubiquitina), viene miscelato con ubiqui...

In-vitro Ricostituzione dell'ubiquitinazione batterica ed eliminazione mediata da VCP/p97

Ubiquitination is a versatile post-translational modification that plays a critical role in cytosolic immunity. Upon invasion of the host cells, ...

in-vitro-reconstitution-bacterial-ubiquitination-vcpp97-mediated

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di isolamento della vescicola, che permette per la purificazione dei compartimenti cellulari dove antigeni esogeni vengono elaborati dal reticolo endoplasmatico-collegata di degradazione in cross-presentazione.

Purificazione del compartimento di membrana per la degradazione del reticolo endoplasmatico-collegata di antigeni esogeni in Cross-presentazione

A differenza di ubiquitin-ligasi, sono stati identificati alcuni ligasi E3 SUMO. Questo modificate in vitro sumoilazione protocollo è in grado di identificare il romanzo SUMO E3 ligasi mediante saggio di ricostituzione in vitro .

In Vitro Saggio di SUMOilazione per studiare l'attività E3 ligasi SUMO

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante nei processi cellulari ed è strettamente coordinata dalla deubiquitinazione. I difetti in entrambe le reazioni sono alla base delle patologie umane. Forniamo protocolli per condurre l'ubiquitinazione e la reazione di deubiquitinazione in vitro utilizzando componenti purificati.

In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

Questo lavoro descrive la sintesi e la caratterizzazione di un omo-PROTAC bimalidomide a base di pomalimmide come un nuovo approccio per indurre l'ubiquitinazione e la degradazione della cereblon della ligase dell'ubiquitina E3 (CRBN), l'obiettivo degli analoghi di talidomide.

Inattivazione chimica dell'E3 Ubiquitin Ligase Cereblon da parte di Homo-PROTAC con sede a Pomeredomide

Questo protocollo mira a stabilire proteomi specifici di ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls) al fine di identificare alterazioni di questo tipo di modifiche post-traduzionali (PTM), associate a una condizione specifica come un trattamento o un fenotipo.

Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Il presente studio fornisce protocolli dettagliati di test di ubiquitilazione in vitro per l'analisi dell'attività catalitica dell'ubiquitina ligasi E3. Le proteine ricombinanti sono state espresse utilizzando sistemi procariotici come la coltura di Escherichia coli.

In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

L'ubiquitinazione è una modificazione post-traduzionale critica della proteina, la cui disregolazione è stata implicata in numerose malattie umane. Questo protocollo descrive in dettaglio come la visualizzazione dei fagi può essere utilizzata per isolare nuove varianti di ubiquitina in grado di legare e modulare l'attività delle ligasi E3 che controllano la specificità, l'efficienza e i modelli di ubiquitinazione.

Utilizzo di Phage Display per sviluppare modulatori varianti di ubiquitina per le ligasi E3

Forniamo un protocollo dettagliato per un test di ubiquitilazione di un substrato specifico e un'ubiquitina-ligasi E3 in cellule di mammifero. Le linee cellulari HEK293T sono state utilizzate per la sovraespressione proteica, il substrato poliubiquitilato è stato purificato dai lisati cellulari mediante immunoprecipitazione e risolto in SDS-PAGE. L'immunoblotting è stato utilizzato per visualizzare questa modifica post-traduzionale.

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

Il protocollo descrive un metodo passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero usando la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate dalle cellule in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione.

Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

Questo protocollo spiega come misurare l'effetto della variazione genetica associata ai disturbi dello sviluppo neurologico sull'attività dell'enzima deubiquitilante combinando la purificazione di proteine ricombinanti con saggi di scissione della catena dell'ubiquitina.

Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

Scopri la ricostituzione in vitro dell'ubiquitinazione batterica e l'eliminazione mediata da VCP/p97 utilizzando Streptococcus pneumoniae. Questo metodo rivela il ruolo di VCP/p97 come difensore citosolico contro i patogeni.

In-vitro Ricostituzione dell'ubiquitinazione batterica ed eliminazione mediata da VCP/p97

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