Procedura di campionamento basata su filo rosso di fenolo per lipidomi di fluidi lacrimali non mirati nella scoperta di biomarcatori
December 12th, 2025
Questo protocollo descrive un protocollo clinico unico per la raccolta di campioni di fluido lacrimale umano utilizzando filetti rosso fenolico e un flusso di lavoro basato su cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per scoprire il profilo lipidomico delle lacrime. Il semplice metodo di separazione biphasic tra metil-tert-butil etere (MTBE)/metanolo consente un'estrazione rapida dei lipidi lacrimali con un alto recupero per la scoperta dei biomarcatori lacrimali. <
Abbiamo stabilito un metodo più standardizzato e facile da usare basato su fili rossi di fenolo per aiutare a ottenere profili lipidomici riproducibili delle lacrime per future scoperte di biomarcatori delle lacrime. La sfida attuale è che le strisce di Schirmer irritano mentre i capillari mostrano variabilità operatorie nella raccolta delle lacrime. Questo ostacola la reportabilità sperimentale e i confronti tra gli studi.
Per cominciare, indossa i guanti e disinfetta accuratamente la postazione per prevenire qualsiasi contaminazione del campione. Tieni il filo rosso fenolico all'estremità opposta al gancio piegato, facendo attenzione a non toccare la zona dell'uncino piegato. Chiedi al soggetto di dirigere lo sguardo verso la direzione nasale superiore.
Poi abbassa delicatamente la palpebra inferiore del soggetto e inserisci il filo rosso fenolico con l'uncino piegato posizionato nella congiuntiva palpebrale temporale inferiore vicino all'angolo esterno dell'occhio. Ora, chiedi al soggetto di chiudere delicatamente gli occhi e inclinare leggermente la testa in avanti per evitare che il filo rosso fenolico entri in contatto con la pelle del viso. Abbassare nuovamente la palpebra inferiore del soggetto e rimuovere delicatamente il filo rosso fenolo, evitando il contatto con la zona campionata.
Registra la lunghezza della regione rossa campionata. E usando pinze sterili, trasferire il PRT in un nuovo tubo campione. Ora etichetta e tappa correttamente il tubo del campione.
Se la lunghezza campionata è inferiore a 50 millimetri, si chiede al soggetto di riposare per uno o tre minuti e poi ripeti la raccolta del liquido lacrimale usando lo stesso occhio. Inserisci ogni nuovo PRT campionato in un tubo campione separato. Utilizzando metanolo e salviette di carta pulite, pulisci accuratamente i guanti e le pinze per eliminare eventuali residui di lacrime o contaminanti.
Poi lasciali asciugare completamente all'aria. Sigilla tutti i tubi campione con parafilm e conservali immediatamente a meno 20 gradi Celsius per una conservazione temporanea o a meno 80 gradi Celsius per conservazione a lungo termine. Prelava le microforbici e le pinze con metanolo prima di lavorare i fili rosso fenolico.
Taglia l'estremità dell'uncino piegato circa i primi tre millimetri da ogni filo rosso fenolo. Taglia la regione campionata fino alla parte frontale del colorante rosso fenolico in pezzi da due millimetri e raccogli questi segmenti con un tubo microcentrifuga pulito da 1,5 millilitri di grado organico tollerante ai solventi. Scarta l'estremità piegata del gancio e la zona indesiderata del PRT.
Posizionare i campioni sul ghiaccio per mantenere una bassa temperatura prima dell'estrazione. Ora, aggiungi 232 microlitri di metanolo di grado spettrometrico freddo a ghiaccio a ciascun campione e vortice per 15 secondi per mescolarlo a fondo. Sonica i campioni in un detergente ultrasonico pre-raffreddato per 15 minuti.
Poi aggiungere 774 microlitri di metil-tert-butil di grado HPLC e 194 microlitri di acqua deionizzata a ciascun campione. Vortice di nuovo per 15 secondi per mescolare bene i solventi. Sonica di nuovo i campioni in un detergente ultrasonico pre-raffreddato per altri 15 minuti.
Dopo la sonicazione, incubare i campioni in un ThermoMixer impostato a quattro gradi Celsius, scuotendo a 1.200 giri al minuto per otto ore. Poi lascia riposare il composto a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare le miscele a 10.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, assicurarsi che le miscele siano visibilmente separate in due fasi liquide distinte. Raccogli con cura 700 microlitri della fase organica superiore contenente lipidi e trasferiscili in un nuovo tubo microcentrifuga pre-raffreddato da 1,5 millilitri. Scartare la fase acquosa inferiore, che contiene residui di metil-tert-butilo e metanolo come rifiuti chimici pericolosi.
Asciuga gli estratti lipidici usando un concentratore SpeedVac refrigerato impostato a quattro gradi Celsius per quattro ore. Poi conserva gli estratti lipidici essiccati a meno 20 gradi Celsius per la conservazione a breve termine o a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Prepara la miscela di solvente metanolo-cloroformio mescolando metanolo con cloroformio in un rapporto volumetrico uno a uno.
Ricostituire gli estratti lipidici essiccati utilizzando 50 microlitri della miscela fredda di metanolo-cloroformio. Sonica la soluzione ricostituita in un detergente ultrasonico pre-raffreddato per 15 minuti. Ora, centrifuga gli estratti lipidici ricostituiti a 14.000 G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Trasferire con cura 40 microlitri del surnatant risultante in una fiala di vetro autocampionatore dotata di un inserto di vetro. Copri strettamente la fiala con un tappo aperto del setto aperto senza fessura per prepararla all'analisi di spettrometria di massa in tandem per cromatografia liquida. Utilizzando criteri rigorosi, sono state identificate 773, 890 e 1.025 specie lipidiche uniche nei gruppi campionari replicate uno, replica due e replica tre.
La modalità ionica positiva ha identificato 1.302 specie lipidiche con identificazioni di grado A al 26%, 13,2% di grado B e 60,8% di grado C. La modalità ionica negativa ha identificato 257 specie lipidiche con circa l'8,2% di grado A, 22,9% di grado B e 68,9% di grado C. Nonostante le variazioni legate allo stoccaggio, sono state identificate in modo coerente 394 specie lipidiche uniche in tutti e tre i set campionari.
Il coefficiente di variazione tra soggetti in tre visite è stato del 21,5% in modalità positiva e del 31,3% in modalità negativa. Questo protocollo affronta l'assenza di un flusso di lavoro standardizzato per l'analisi lipidomica delle lacrime riproducibili e può migliorare la comparabilità tra gli studi. Il nostro metodo basato su PRT minimizza le irritazioni, consente una rapida raccolta delle lacrime e riduce la variabilità degli operatori.
Le nostre future ricerche convalideranno biomarcatori lipidomici delle lacrime in grandi coorti e integreranno multiomica per una diagnostica personalizzata.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo standardizzato per la raccolta di campioni di fluido lacrimale umano utilizzando fili di rosso fenolo, volto a migliorare la riproducibilità negli studi lipidomici delle lacrime. Il flusso di lavoro incorpora la cromatografia liquida-spettrometria di massa in tandem (LC-MS/MS) per l'estrazione e l'analisi dei lipidi.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biochimica
- Ricerca clinica
Sfondo
- I metodi attuali per la raccolta delle lacrime spesso portano a irritazione o variabilità.
- La standardizzazione è cruciale per una scoperta affidabile dei biomarcatori.
- I fili di rosso fenolo offrono un'alternativa meno invasiva per il campionamento delle lacrime.
- LC-MS/MS fornisce una piattaforma robusta per l'analisi lipidomica.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un metodo riproducibile per il profilaggio lipidomico delle lacrime.
- Minimizzare la variabilità dell'operatore e migliorare la comparabilità tra gli studi.
- Facilitare la ricerca futura sui biomarcatori lipidici delle lacrime.
Metodi utilizzati
- Raccolta di campioni di lacrime utilizzando fili di rosso fenolo.
- Estratto di lipidi utilizzando un metodo di separazione bifasico.
- Analisi delle specie lipidiche tramite LC-MS/MS.
- Conservazione dei campioni a temperature controllate per la stabilità.
Principali risultati
- Identificazione di oltre 1.300 specie lipidiche in modalità ioni positivi.
- Identificazione coerente di 394 specie lipidiche uniche tra i campioni.
- Variabilità tra soggetti misurata al 21,5% in modalità positiva.
- Il metodo migliora la riproducibilità e la comparabilità degli studi lipidomici.
Conclusioni
- Il metodo del filo di rosso fenolo riduce l'irritazione e la variabilità.
- Il flusso di lavoro standardizzato migliora l'affidabilità dell'analisi lipidomica delle lacrime.
- Gli studi futuri si concentreranno sulla validazione dei biomarcatori lipidici in coorti più ampie.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Standardized, minimally invasive tear fluid sampling is critical for robust lipidomic biomarker discovery in ocular and systemic disease research. The phenol red thread (PRT)-based protocol addresses reproducibility and operator variability, enabling higher predictive confidence in early biomarker validation. This workflow supports translational continuity from discovery to preclinical research by ensuring consistent, high-quality lipidomic data across studies and sites.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reproducible interrogation of tear lipid profiles for biomarker hypothesis testing.
- Reduces biological and procedural variability, supporting functional target validation.
- Facilitates portfolio triage by providing robust, quantitative lipidomic datasets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tear fluid samples for downstream high-resolution LC-MS/MS workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing operator-dependent variability.
- Supports scalable, user-friendly sample collection suitable for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipidomic outputs with disease-relevant biomarker discovery and monitoring.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent sample quality.
- Reduces risk of false negatives in translational biomarker studies due to sampling artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The PRT-based sampling protocol integrates into the biomarker discovery continuum, from early hypothesis testing to preclinical validation, by providing a standardized input for lipidomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven lipidomic profiling and pathway clarification in ocular and systemic disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tear lipid samples for high-throughput LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Enables identification and comparison of over 700 unique lipid species across replicates and conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease monitoring through robust, minimally invasive sampling.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, standardized protocol adaptable across research teams and clinical cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biomarker studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tear fluid collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing sampling-related risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires personnel trained in standardized PRT handling and sample processing.
- Needs access to high-resolution LC-MS/MS instrumentation and lipidomics software.
- Demands cross-team adherence to contamination control and storage protocols.
- Adaptable to subjects with low tear volume or sensitivity to traditional sampling methods.
- Potential limitations include storage-related lipid variability and need for further validation in large cohorts.
