Procedura di campionamento basata su filo rosso di fenolo per lipidomi di fluidi lacrimali non mirati nella scoperta di biomarcatori

Abbiamo stabilito un metodo più standardizzato e facile da usare basato su fili rossi di fenolo per aiutare a ottenere profili lipidomici riproducibili delle lacrime per future scoperte di biomarcatori delle lacrime. La sfida attuale è che le strisce di Schirmer irritano mentre i capillari mostrano variabilità operatorie nella raccolta delle lacrime. Questo ostacola la reportabilità sperimentale e i confronti tra gli studi.

Per cominciare, indossa i guanti e disinfetta accuratamente la postazione per prevenire qualsiasi contaminazione del campione. Tieni il filo rosso fenolico all'estremità opposta al gancio piegato, facendo attenzione a non toccare la zona dell'uncino piegato. Chiedi al soggetto di dirigere lo sguardo verso la direzione nasale superiore.

Poi abbassa delicatamente la palpebra inferiore del soggetto e inserisci il filo rosso fenolico con l'uncino piegato posizionato nella congiuntiva palpebrale temporale inferiore vicino all'angolo esterno dell'occhio. Ora, chiedi al soggetto di chiudere delicatamente gli occhi e inclinare leggermente la testa in avanti per evitare che il filo rosso fenolico entri in contatto con la pelle del viso. Abbassare nuovamente la palpebra inferiore del soggetto e rimuovere delicatamente il filo rosso fenolo, evitando il contatto con la zona campionata.

Registra la lunghezza della regione rossa campionata. E usando pinze sterili, trasferire il PRT in un nuovo tubo campione. Ora etichetta e tappa correttamente il tubo del campione.

Se la lunghezza campionata è inferiore a 50 millimetri, si chiede al soggetto di riposare per uno o tre minuti e poi ripeti la raccolta del liquido lacrimale usando lo stesso occhio. Inserisci ogni nuovo PRT campionato in un tubo campione separato. Utilizzando metanolo e salviette di carta pulite, pulisci accuratamente i guanti e le pinze per eliminare eventuali residui di lacrime o contaminanti.

Poi lasciali asciugare completamente all'aria. Sigilla tutti i tubi campione con parafilm e conservali immediatamente a meno 20 gradi Celsius per una conservazione temporanea o a meno 80 gradi Celsius per conservazione a lungo termine. Prelava le microforbici e le pinze con metanolo prima di lavorare i fili rosso fenolico.

Taglia l'estremità dell'uncino piegato circa i primi tre millimetri da ogni filo rosso fenolo. Taglia la regione campionata fino alla parte frontale del colorante rosso fenolico in pezzi da due millimetri e raccogli questi segmenti con un tubo microcentrifuga pulito da 1,5 millilitri di grado organico tollerante ai solventi. Scarta l'estremità piegata del gancio e la zona indesiderata del PRT.

Posizionare i campioni sul ghiaccio per mantenere una bassa temperatura prima dell'estrazione. Ora, aggiungi 232 microlitri di metanolo di grado spettrometrico freddo a ghiaccio a ciascun campione e vortice per 15 secondi per mescolarlo a fondo. Sonica i campioni in un detergente ultrasonico pre-raffreddato per 15 minuti.

Poi aggiungere 774 microlitri di metil-tert-butil di grado HPLC e 194 microlitri di acqua deionizzata a ciascun campione. Vortice di nuovo per 15 secondi per mescolare bene i solventi. Sonica di nuovo i campioni in un detergente ultrasonico pre-raffreddato per altri 15 minuti.

Dopo la sonicazione, incubare i campioni in un ThermoMixer impostato a quattro gradi Celsius, scuotendo a 1.200 giri al minuto per otto ore. Poi lascia riposare il composto a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare le miscele a 10.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, assicurarsi che le miscele siano visibilmente separate in due fasi liquide distinte. Raccogli con cura 700 microlitri della fase organica superiore contenente lipidi e trasferiscili in un nuovo tubo microcentrifuga pre-raffreddato da 1,5 millilitri. Scartare la fase acquosa inferiore, che contiene residui di metil-tert-butilo e metanolo come rifiuti chimici pericolosi.

Asciuga gli estratti lipidici usando un concentratore SpeedVac refrigerato impostato a quattro gradi Celsius per quattro ore. Poi conserva gli estratti lipidici essiccati a meno 20 gradi Celsius per la conservazione a breve termine o a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Prepara la miscela di solvente metanolo-cloroformio mescolando metanolo con cloroformio in un rapporto volumetrico uno a uno.

Ricostituire gli estratti lipidici essiccati utilizzando 50 microlitri della miscela fredda di metanolo-cloroformio. Sonica la soluzione ricostituita in un detergente ultrasonico pre-raffreddato per 15 minuti. Ora, centrifuga gli estratti lipidici ricostituiti a 14.000 G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Trasferire con cura 40 microlitri del surnatant risultante in una fiala di vetro autocampionatore dotata di un inserto di vetro. Copri strettamente la fiala con un tappo aperto del setto aperto senza fessura per prepararla all'analisi di spettrometria di massa in tandem per cromatografia liquida. Utilizzando criteri rigorosi, sono state identificate 773, 890 e 1.025 specie lipidiche uniche nei gruppi campionari replicate uno, replica due e replica tre.

La modalità ionica positiva ha identificato 1.302 specie lipidiche con identificazioni di grado A al 26%, 13,2% di grado B e 60,8% di grado C. La modalità ionica negativa ha identificato 257 specie lipidiche con circa l'8,2% di grado A, 22,9% di grado B e 68,9% di grado C. Nonostante le variazioni legate allo stoccaggio, sono state identificate in modo coerente 394 specie lipidiche uniche in tutti e tre i set campionari.

Il coefficiente di variazione tra soggetti in tre visite è stato del 21,5% in modalità positiva e del 31,3% in modalità negativa. Questo protocollo affronta l'assenza di un flusso di lavoro standardizzato per l'analisi lipidomica delle lacrime riproducibili e può migliorare la comparabilità tra gli studi. Il nostro metodo basato su PRT minimizza le irritazioni, consente una rapida raccolta delle lacrime e riduce la variabilità degli operatori.

Le nostre future ricerche convalideranno biomarcatori lipidomici delle lacrime in grandi coorti e integreranno multiomica per una diagnostica personalizzata.