Name: Imaging su cellule vive della permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Scopri l'imaging su cellule vive per monitorare la permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi utilizzando sonde fluorescenti. Questo metodo consente di osservare in tempo reale i cambiamenti di pH e il rilascio del carico.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Celle HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Cellule del cancro al colon</td></tr><tr><td>Vasto da 35 mm con fondo di vetro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C-GRD</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore CO2</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVL</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Confocale</td><td>Leica</td><td>SP8WLL</td><td></td></tr><tr><td>Perle verdi Dextrano</td><td>ThermoFisher</td><td>D1820</td><td>Dextran, Fluoresceina, 10.000 MW, Anionico, Lisina Risolvibile</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino (FBS)</td><td>Cytiva & nbsp;</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Tipo HF a immersione in olio</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>16915-01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina e Streptomicina (P/S)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mimetico Smac (S)</td><td>BV6, ApexBio, Catalogo</td><td>B4653</td><td>Concentrazione finale, 1 mM</td></tr><tr><td>The Brick&nbsp;</td><td>Servizi di imaging biologico</td><td>13685</td><td>Regolatore di CO2 a miscelatore di gas</td></tr><tr><td>Il Cubo</td><td>Servizi di imaging biologico</td><td>CBO2A</td><td>Microscopi da camera di controllo della temperatura</td></tr><tr><td>Fattore di Necrosi Tumorale alfa (TNF-&alfa; - T)</td><td>Peprotech</td><td>30001A100UG</td><td>Concentrazione finale, 20 ng/ml</td></tr><tr><td>z-VAD-FMK (Z)</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>Concentrazione finale, 20 mM</td></tr></tbody></table>

imaging su cellule vive della permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi

Live-cell Imaging of Lysosomal Membrane Permeabilization During Necroptosis

Le procedure descritte in questo protocollo consentono l'acquisizione di immagini di cellule vive utilizzando la microscopia confocale per monitorare la LMP in tempo reale. La Figura 1 illustra una rappresentazione schematica del protocollo sperimentale, dalla placcatura cellulare all'acquisizione delle immagini. Il giorno 0, 5.000 cellule HT-29 sono state piastrate e incubate per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2. Dopo 24 ore (Giorno 1), le cellule sono state incubate con perle di destrano marcate con fluoresceina (25 μg/mL) per altre 24 ore nelle stesse condizioni. Queste perle vengono internalizzate dall'endocitosi e dal traffico verso i lisosomi, dove si accumulano e appaiono come punti luminosi. Il giorno 2 (giorno dell'esperimento), le cellule sono state trattate con il colorante LysoTracker sensibile al pH (1 μM) per 2 ore a 37 °C e 5% di CO2. LysoTracker si concentra e mostra una forte fluorescenza all'interno di compartimenti acidi, come gli endosomi tardivi e i lisosomi. Trenta minuti prima dell'imaging, il sistema di microscopio confocale è stato acceso e stabilizzato, compresi i regolatori di temperatura, gas e umidità, come descritto nel passaggio 4 del protocollo. La camera di imaging è stata assemblata, come dimostrato nella Figura 2. Sono stati utilizzati i laser da 488 nm (verde) e 555 nm (rosso).
Dopo l'incubazione con LysoTracker, le cellule sono state accuratamente lavate tre volte con PBS e sono stati aggiunti 2 mL di DMEM fresco integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S. La lastra è stata trasferita al microscopio e una goccia di olio da immersione è stata applicata sull'obiettivo da immersione in olio 63x/1,40 NA. L'intensità del laser e i livelli di fondo sono stati quindi regolati per ottimizzare le condizioni di imaging, come descritto nel passaggio 5.5. del protocollo. Le nostre immagini iniziali hanno confermato la presenza di puncta stabili del Lysotracker e del destrano marcato con fluoresceina, indicando lisosomi intatti (Figura 3). Le immagini di base sono state acquisite prima di T/S/Z e utilizzate come controllo. Non è stato utilizzato alcun veicolo.
Dopo aver stabilito le impostazioni iniziali di imaging e microscopia, la piastra è stata rimessa nella cappa a flusso laminare ed è stato aggiunto 1 mL di DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S, contenente 100 ng/mL di TNF-α (T), 500 nM di SMAC mimetico (S) e 100 μM Z-VAD-FMK (Z). L'imaging è proseguito al microscopio confocale utilizzando il parametro di acquisizione dell'imaging descritto nella fase 6 del protocollo. Come mostrato nella Figura 3, nel filmato supplementare S1 e nel filmato supplementare S2, la progressiva diminuzione della fluorescenza di LysoTracker nelle cellule trattate con T/S/Z è servita come indicatore precoce della variazione lisosomiale. Questa perdita è stata seguita da, e occasionalmente si è verificata contemporaneamente, all'efflusso di destrano marcato con fluoresceina dai lisosomi al citosol (spostamento da puntato a diffuso), indicando LMP. A 8 ore, quasi tutto il segnale del Lysotracker è scomparso, tuttavia, molte cellule conservavano ancora i punti verdi con il segnale verde citosolico, suggerendo che la perdita del gradiente di pH lisosomiale precede la LMP completa e il rilascio del carico.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale. (Creato nel BioRender.com) Inizialmente, 5.000 cellule sono state piastrate (0 h) e incubate per 24 h; successivamente, sono state aggiunte perle di destrano (25 μg/mL) e incubate per altre 24 ore. A 48 ore, è stato aggiunto LysoTracker (1 μM) e incubato per 2 ore. Le cellule sono state lavate tre volte con PBS (fase 1), seguite dall'aggiunta di 2 mL di DMEM fresco integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S (fase 2). Le impostazioni della microscopia sono state regolate (fase 3) e le cellule sono state trattate con TNF-α (T), SMAC mimetico (S) e inibitore della pan-caspasi Z-VAD-FMZ (Z) (fase 4), prima dell'acquisizione dell'immagine della cellula viva (fase 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Schema della configurazione della camera di imaging. (A) Il supporto del campione, (B) la camera di incubazione del gas e (C) il coperchio superiore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig3.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3: Immagini rappresentative delle cellule HT29 prima e dopo il trattamento T/S/Z. Le cellule sono state colorate con perle di Lysotracker rosso e destrano verde e trattate con TNF-α (T), SMAC mimetico (S) e inibitore della pan-caspasi Z-VAD-FMZ (Z). Barra della scala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Filmato supplementare S1: Time-lapse di cellule HT29 incubate con perle verdi di destrano e trattate con T/S/Z. Le cellule sono state monitorate per oltre 6 ore per valutare la risposta cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S1_Dextran%20Green%20Beads.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato supplementare S2: Time-lapse di cellule HT29 incubate con LysoTracker red e trattate con T/S/Z. Le cellule sono state monitorate per oltre 6 ore per valutare la risposta cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S2_LysoTracker%20red.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>

Imaging su cellule vive della permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi

Necroptosis, a form of regulated necrosis, culminates in cell membrane rupture. Our lab and others have discovered that lysosomal membrane ...

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La mitofagia è il meccanismo primario del controllo di qualità mitocondriale. Tuttavia, la valutazione della mitofagia in vivo è ostacolata dalla mancanza di saggi quantitativi affidabili. Presentato qui è un protocollo per l'osservazione della mitofagia nelle cellule viventi utilizzando un colorante mitocondriale fluorescente verde e un colorante lisosoma rosso-fluorescente.

Visualizzazione della mitofagia con coloranti fluorescenti per mitocondri e lisosomi

Questo protocollo si basa sulla LPS e sulla morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. Utilizziamo la citometria a flusso per analizzare l'annessina V e la doppia colorazione 7-AAD per rilevare la morte cellulare, utilizzando l'intera cellula e impiegando la microscopia elettronica a scansione per osservare la morfologia della membrana cellulare.

LPS e morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA e sua validazione

Questo protocollo descrive un meccanismo per l'utilizzo della microscopia ottica ed elettronica correlativa per visualizzare l'interazione di mitocondri e lisosomi marcati rispettivamente con mEosEM e APEX2.

Microscopia correlativa a luce ed elettronica a due colori per la visualizzazione delle interazioni tra mitocondri e lisosomi

Scopri l'imaging su cellule vive per monitorare la permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi utilizzando sonde fluorescenti. Questo metodo consente di osservare in tempo reale i cambiamenti di pH e il rilascio del carico.

Imaging su cellule vive della permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi

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