Name: Approcci sperimentali per lanalisi biochimica della proteina acida fibrillare gliale e delle sue varianti associate alla malattia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Scopri metodi sperimentali per caratterizzare biochimicamente la GFAP e le sue mutazioni associate alla malattia di Alexander. Questo protocollo facilita lo studio dell'assemblaggio dei filamenti e delle modifiche post-traduzionali.

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<table><tbody><tr><td>Soluzione 30% di acrilammide/Bis 37,5:1</td><td>Biorad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>Biorad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>USB</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFAP</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>12389</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ubiquitina</td><td>Millipore</td><td>ST 1200</td><td>Clone FK2</td></tr><tr><td>Centrifuga Avanti J-26S XP</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroanfenicolo</td><td>USB</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>CM-Sephrose</td><td>Cytiva</td><td>1707 1901</td><td></td></tr><tr><td>Colorante blu Coomassie</td><td>USB</td><td>32826</td><td></td></tr><tr><td>Griglia in rame</td><td>Ted Pella</td><td>01753-F</td><td></td></tr><tr><td>CS 150 NX Micro ultra-centrurge</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore a dounce</td><td>Wheaton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>UR</td><td>DTT</td><td></td></tr><tr><td>Ceppo pLysS di E. coli BL21(DE3)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasiGlow</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL 105001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15699</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18312</td><td></td></tr><tr><td>Colonna S di HiRes</td><td>Cytiva</td><td>2927 5877</td><td></td></tr><tr><td>Colonna HiTrap Q</td><td>Cytiva</td><td>1711 5301</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>UR</td><td>IPTG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (LB Agar)</td><td>USB</td><td>75851</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (LB Broth)</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Honeywell</td><td>31434S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di cromatografia NGC</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrifuga</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>215740050</td><td></td></tr><tr><td>Polietileneimina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Rotore</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotore S55S</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotore S80AT3</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>USB</td><td>75819</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 520 capra anti-topo IgG&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>12005867</td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 700 capra anti-coniglio IgG&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>12004161</td><td></td></tr><tr><td>Sucrosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>USB</td><td>76320</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione H-7700)</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranyle</td><td>Scienze del microscopio elettronico &nbsp;</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Honeywell</td><td>15604H</td><td></td></tr></tbody></table>

approcci sperimentali per l'analisi biochimica della proteina acida fibrillare gliale e delle sue varianti associate alla malattia

Experimental Approaches for Biochemical Analysis of Glial Fibrillary Acidic Protein and Its Disease-associated Variants

Per indagare come le mutazioni causatrici di AxD influenzino le proprietà di assemblaggio del GFAP, abbiamo prodotto proteine ricombinanti nei batteri utilizzando un sistema di espressione basato su PET. Descriviamo i protocolli per l'espressione e la purificazione del GFAP, usando come esempio il GFAP del WT. Dopo l'induzione dell'IPTG (Figura 1A, corsia 2), il GFAP è stato purificato tramite un processo in tre fasi che prevede la preparazione del corpo di inclusione (F...

Approcci sperimentali per l'analisi biochimica della proteina acida fibrillare gliale e delle sue varianti associate alla malattia

Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) is a key intermediate filament protein critical for maintaining the structural integrity and function of astrocytes ...

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Biochimica

Abbiamo descritto una tecnica per la preparazione di omogenati chiarito umano corticale, la separazione delle proteine ​​mediante SDS-PAGE, recupero antigene e immunoblotting con un anticorpo per il peptide Aβ. Usando questo protocollo, abbiamo costantemente rilevare Aβ monomerici e multimerica nel tessuto corticale da esseri umani con patologia di Alzheimer.

Rilevazione SDS-PAGE/Immunoblot di multimeri Aβ in Human tessuto corticale omogenati utilizzando Antigen-epitopi recupero

Un protocollo di estrazione proteina comune con tampone di urea / tiourea / SDS per il tessuto cerebrale umano e topi permette indentification delle proteine ​​da 2D-DIGE e la loro successiva caratterizzazione mediante mini 2DE immunoblotting. Questo metodo permette di ottenere risultati più riproducibili e affidabili da biopsie umane e modelli sperimentali.

Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Utilizzando la microscopia a forza atomica in combinazione con la tecnologia di biopanning abbiamo creato un sistema di biopanning negativo e positivo per acquisire anticorpi contro varianti proteiche specifiche per la malattia presenti in qualsiasi materiale biologico, anche a basse concentrazioni.  Siamo riusciti a ottenere anticorpi contro le varianti della proteina TDP-43 coinvolte nella sclerosi laterale amiotrofica.

Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

Viene descritta un'ELISA che offre un approccio quantitativo innovativo. Rileva specificamente l'α-sinucleina associata alla malattia (αSD) in un modello di topo transgenico (M83) di sinucleinopatia utilizzando diversi anticorpi contro la forma αS fosforilata nella Ser129 o la parte C-terminale della proteina.

Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento di alfa-sinucleina (α-syn) sempre più insolubile/aggregata da tessuto cerebrale umano post-mortem. Attraverso l'utilizzo di tamponi con forza detergente crescente e tecniche di ultracentrifugazione ad alta velocità, è possibile esaminare le proprietà variabili dell'aggregazione α-syn in tessuti malati e non malati.

Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani

Presentato qui sono due metodi che possono essere utilizzati singolarmente o in combinazione per analizzare l'effetto di beta-amiloide sulla struttura del coagulo di fibrina. È incluso un protocollo per creazione di coagulo di fibrina in vitro , seguita da coagulo torbidità e microscopia elettronica di esame metodi.

Analisi delle anomalie indotta da β-amiloide sulla struttura di coagulo di fibrina di spettroscopia e microscopia elettronica a scansione

Qui, presentiamo un protocollo per un test di immunofluorescenza indiretta a fluttuazione libera sulle sezioni di biopsia cutanea che consente l'identificazione di varianti di conformazione specifiche della malattia di sinucleina alfa coinvolte nella malattia di Parkinson e proteine multiple del sistema nervoso periferico.

Targeting Alpha Synuclein Aggregati in cutaneous periferici nervose fibre nervose da Pro(Enunciante autofluorescenza libera)

Questo protocollo descrive un metodo per monitorare le singole traiettorie di invecchiamento cerebrale attraverso un programma di donazione di cervello e la corretta caratterizzazione del cervello. I donatori di cervello sono coinvolti in uno studio longitudinale a lungo termine che include valutazioni multidimensionali seriali. Il protocollo contiene una descrizione dettagliata dell'elaborazione del cervello e una metodologia diagnostica accurata.

Abbiategrasso Brain Bank Protocol per la raccolta, l'elaborazione e la caratterizzazione dei cervelli di invecchiamento

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Presentiamo qui un protocollo su come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia da cortecce di ratto per l'imaging video time-lapse di Ca2+ intracellulare per la ricerca sulla fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica nel modello di ratto hSOD1G93A .

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

Questo metodo di purificazione biochimica con analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa facilita la robusta caratterizzazione dei nuclei di fibrille amiloidi, che possono accelerare l'identificazione di bersagli per la prevenzione della malattia di Alzheimer.

Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello

Scopri metodi sperimentali per caratterizzare biochimicamente la GFAP e le sue mutazioni associate alla malattia di Alexander. Questo protocollo facilita lo studio dell'assemblaggio dei filamenti e delle modifiche post-traduzionali.

Approcci sperimentali per lanalisi biochimica della proteina acida fibrillare gliale e delle sue varianti associate alla malattia (Video) | JoVE Journal

Approcci sperimentali per l'analisi biochimica della proteina acida fibrillare gliale e delle sue varianti associate alla malattia

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