Purificazione di trofoblasti extravillosi HLA-G⁺ da tessuti placentari a termine umani per fenotipizzazione e analisi funzionale

Questo protocollo è progettato per purificare i trofoblasti umani primari dai tessuti placentari umani per studiarne le proprietà funzionali e immunologiche in gravidanze sane e in condizioni patologiche. Questo protocollo fornisce quindi una piattaforma riproducibile per superare alcune limitazioni precedenti nel lavorare con trofoblasti extravillosi umani primari, in particolare la loro vitalità. Quindi questo protocollo è davvero ottimizzato per migliorarne la vitalità e la purezza.

Per cominciare, preleva un campione di placenta umana. Posizionare la placenta con il lato fetale rivolto verso l'alto in modo che il sito di inserimento del cordone sia visibile. Speggi manualmente l'amnione dalla membrana laterale verso il sito di inserimento del cordone ombelicale e rimuovilo.

Poi usa le forbici per tagliare e scartare l'amnion. Taglia la membrana coriodeciduale in strisce da due pollici a partire dalla base della placenta verso l'alto, mantenendo ogni striscia attaccata alla placenta. Posiziona la striscia coriodeciduale sulla membrana su due dita, con il lato deciduale rivolto verso l'alto.

Con un paio di pinze sterili a punta curva, raschiare delicatamente la decidua pariettalis materna dal corio. Raccogliere la decidua parietalis in un tubo conico da 50 millilitri contenente 20 millilitri di PBS per l'isolamento dei linfociti. Poi raccogli la membrana corionica in un tubo conico separato da 50 millilitri contenente 20 millilitri di mezzo di lavaggio A. Con forbici, taglia la membrana corionica all'interno del tubo da 50 millilitri in pezzi più piccoli di due millimetri quadrati.

Scartare il mezzo di lavaggio A dal tubo. Lava ripetutamente il fazzoletto con PBS finché il soprannativante non diventa pulito. Per la dissezione placentare, posizionare la placenta con il lato materno rivolto verso l'alto e rimuovere i coaguli di sangue.

Con forbici sterili, taglia pezzi della placca basale della placenta evitando aree necrotiche, calcificate o ischemiche. Posiziona il pezzo di basale decidua sulle dita con i villi rivolti verso l'alto. Poi si usano forbici per rimuovere con cura i villosce, ottenendo una membrana da due a tre millimetri con solo uno strato sottile di villosità rimasto.

Raccogliere il tessuto della decidua basali in un tubo conico da 50 millilitri contenente 20 millilitri di PBS. Poi taglia il fazzoletto in pezzi più piccoli di due millimetri quadrati. Poi, scarta il PBS dal tubo.

Lavare ripetutamente la decidua basalis con PBS finché il soprantantante non è trasparente e non è visto sangue. Poi si dividono 15 millilitri di sospensione tissutale in due tubi conici da 50 millilitri ciascuno. Riempi tutti i tubi con PBS.

Centrifuga i tubi a 200G per un minuto e versa via il sovrandante. Aggiungi 150 millilitri di cocktail enzimatico per la digestione dei tessuti caldi in una bottiglia di vetro da 300 millilitri. Aggiungi 30 millilitri di membrana corionica alla bottiglia.

Aggiungi 20 millilitri di DMEM/F-20 caldo e 80 millilitri di cocktail enzimatico per la digestione dei tessuti caldi in due bottiglie separate da 300 millilitri di vetro. Poi aggiungi 7,5 millilitri di Decidua Basalis in ogni bottiglia. Incubare le bottiglie in un bagno d'acqua.

Agita tutte le bottiglie ogni tre o quattro minuti durante i 15 minuti di incubazione. Dopo la digestione, filtrare il tessuto attraverso setacci metallici con una griglia di 40. Poi aggiungi il medium B per sciacquare i tessuti e sciacquare il materiale gelatinoso.

Trasferire il tessuto non digerito nelle bottiglie di vetro e ripetere la digestione. Poi filtra le sospensioni delle celle attraverso un filtro da 100 micrometri in tubi conici etichettati da 50 millilitri. Tieni separate le cellule della prima e della seconda digestione.

Poi centrifuga la sospensione a 650G per otto minuti. Scartate il soprannatante. Combina pellet dello stesso tipo di tessuto e numero di digestione in un unico tubo.

Poi completa il volume con il mezzo B fino a 25 millilitri. Aggiungi 12 millilitri di ficoll a quattro tubi conici da 50 millilitri etichettati con il tipo di tessuto e il numero di digestione. Sovrapposizione con cura la sospensione della cella sul ficoll.

Poi centrifuga a 800G per 20 minuti a temperatura ambiente senza rompersi. Aspirare con cura lo strato cellulare all'interfaccia del mezzo ficoll e trasferirlo in tubi netti e etichettati. Poi riempi i tubetti con il medium di lavaggio B, centrifughi a 650G per otto minuti e risospezioni i pellet.

Posizionare i pellet sospesosi in tubi cellulari sterili attivati dalla fluorescenza etichettati con tipo di tessuto e numero di digestione. Aggiungi anticorpi anti-CD45 BV785, anti-HLA GAPC e anti-EGFR1 BV711. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.

Dopo aver lavato e risospeso le cellule nel mezzo di lavaggio B, passale immediatamente attraverso un filtro a 40 micrometri. Smista il CD45 negativo HLAG positivo EGFR positivo in trofoblasti extravillosi in tubi contenenti un millilitro di coltura EVT medio A. L'analisi della citometria a flusso dei marcatori di linea ha mostrato una coltura primaria vitale di trofoblasti extravillosi vitali fino al quarto giorno. Immagini rappresentative di microscopia luce di trofoblasti extravillosi HLAG positivi corionici e di decidua basali sono state catturate dopo 24 ore, 48 e 72 ore di coltura.

Trofoblasti extravillosi espressi molecole polimorfiche HLAC e coinibitori immunosoppressori. Il trofoblasto extravilloso ha aumentato l'espressione di HLAC, PD-L1, PD-L2 e HLA-E, ma non ha aumentato l'espressione di PVR e B7H3 quando co-colturato con linfociti attivati per 72 ore. Non è stato osservato alcun aumento della morte extravillosa per trofoblasti dopo la co-coltura con linfociti attivati.

Questo protocollo permette alle persone, agli scienziati, di utilizzare trofoblasti extravillosi primari per una vasta gamma di sani. Il vantaggio è l'alta vitalità che permette analisi utilizzando colture cellulari, colture a freddo, citometria a flusso, proteomica, trascrittomica, utilizzando questi trofoblasti extravillosi ad alta resa davvero molto validi. Uno degli aspetti più importanti del nostro protocollo è che bisogna utilizzare materiali placentari nuovi.

Non puoi metterli in frigorifero. I trofoblasti amano morire, quindi per favore procurati i tessuti placentari il prima possibile dopo il parto, preferibilmente entro due ore dal parto, e tienili sempre a temperatura ambiente. Questo è fondamentale per ottenere un trofoblasto extravilloso altamente valido.

Alcuni dei metodi più aggiuntivi e innovativi più avanzati per cui si possono utilizzare questi trofoblasti primari sono la coltura cellulare a lungo termine. Quindi puoi usarli per stabilire colture cellulari primarie di quattro giorni. Quindi le cellule saranno vitali fino a 96 ore, che è piuttosto lungo, e permette di fare colture a freddo con cellule immunitarie, come le cellule T e le cellule NK.

L'altra innovazione è che si possono usare per stabilire linee cellulari simili a trofoblasti usando i metodi descritti per la prima volta da Aoki, e che abbiamo anche applicato a queste colture per stabilire davvero tipi cellulari proliferanti a lungo termine che si possono usare per l'editing genomico e altri saghi di coltura a lungo termine. Quindi, usando questi metodi innovativi, inclusa la coltura cellulare a lungo termine, penso possa davvero aiutarti a progettare colture meccanicistiche a lungo termine dove puoi applicare l'editing genomico, knock-out, geni knock-in, proteine, sovraesprimere alcuni di questi trofoblasti per ottenere molti più dettagli meccanicistici su come questi trofoblasti impongano tolleranza, o permettere immunità e maggiore citotossicità quando interagiscono con le popolazioni immunitarie.