Il saggio sull'emostasi di Nijmegen: misurazione simultanea fluorogenica della generazione di trombina e plasmina in un singolo pozzo

La mia ricerca si concentra sulla misurazione insieme dell'emostasi secondaria e della fibrinolisi per misurare l'equilibrio emostatico complessivo. La maggior parte degli sami attuali valuta componenti isolati della coagulazione o della fibrinolisi. Questo saggio misura entrambi i processi simultaneamente in un unico saggio.

Per cominciare, accendi il lettore di lastre a fluorescenza e lascialo equilibrare fino a 37 gradi Celsius. Configura le impostazioni del filtro nel software impostando il numero di coppie di lunghezze d'onda a due. Imposta la lunghezza d'onda dell'eccitazione a 355 nanometri per la trombina e 485 nanometri per la plasmina.

Poi imposta la lunghezza d'onda di emissione a 460 nanometri per la trombina e 525 nanometri per la plasmina. Poi, imposta il tipo di piastra su una micropiastra nera Greiner a fondo piatto a 96 pozzi. Naviga fino all'Area di Lettura e definisci la disposizione delle piastre usando un massimo di 20 pozzi per placca.

Configura le impostazioni PMT e ottica impostando il guadagno PMT a 200 volt e il numero di lampi per lettura a sei. Poi naviga su Timing per confermare le impostazioni di Timing con un tempo di esecuzione totale di un'ora, nove minuti e 30 secondi, un intervallo di 30 secondi. Naviga su Shake per confermare un shake di tre secondi prima della prima lettura.

Naviga su Altre impostazioni per assicurarti che l'ordine di lettura sia impostato su Colonna. Configura le impostazioni di Trasferimento Composto prima della Lettura impostando il numero di Trasferimenti Composti a uno e il Volume Iniziale a 120 microlitri. Controlla che l'altezza della pipetta sia 130 microlitri, il volume sia 20 microlitri, la velocità di un microlitro al secondo e il punto temporale sia 14 secondi.

Sotto Fonte Composta, conferma il formato della piastra composta a 96 pozzi e scegli specificamente l'opzione Beckman 96 da 2,3 millilitri. Conferma le impostazioni di layout delle punte delle pipette selezionando le colonne corrette. Ora vai alle colonne Consigli Composti e seleziona le colonne corrette.

Imposta la temperatura dello shaker a micropiastre a 37 gradi Celsius e verifica la temperatura prima dell'uso. Poi imposta l'intensità di scuotimento a 1.100 giri al minuto. Successivamente scongelare il plasma del paziente e il plasma normale concentrato in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un massimo di 10 minuti.

Mescola accuratamente i campioni di plasma e verifica il completo scongelamento senza crioprecipitato visibile. Utilizzando una pipetta, aggiungi 80 microlitri di plasma paziente o plasma normale concentrato ai pozzi preselezionati, utilizzando una punta fresca per pipetta per ogni campione. Successivamente prepara la miscela di substrato mescolando 48 microlitri di cefalina con 48 microlitri di fattore tissutale.

A questo, aggiungi un tampone di cloruro trisodico da 240 microlitri, poi pipetta un substrato di trombocina da 96 microlitri e un substrato di plasmina da 48 microlitri. Fai uscire 20 microlitri della miscela di substrato in ogni pozzo. Stringi la mano dopo.

Ora inserisci la micropiastra nel lettore di piastre a fluorescenza e lasciala equilibrare a 37 gradi Celsius per diversi minuti. Combinare il tampone di cloruro trisodico, il tampone cloruro di calcio trisodio e l'attivatore del plasminogeno tissutale per preparare il reagente iniziale. Vortice accuratamente per mescolare.

Pipetta la miscela di reagenti iniziale in tutte le file della colonna composta. Inserisci la piastra contenente la miscela di reagenti iniziale nel cassetto della sorgente e avvia la misurazione della fluorescenza. Registra i segnali di fluorescenza ogni 30 secondi per 70 minuti.

Mantieni la piastra a 37 gradi Celsius durante tutta la misurazione. Per l'analisi dei dati, esportare i dati di fluorescenza cinetica come una tabella contenente punti temporali e valori di fluorescenza per pozzo. Calcola la prima derivata e traccia le curve di generazione enzimatiche per ciascun pozzo per visualizzare la generazione di trombina o plasmina nel tempo.

Il saggio di emostasi ha permesso una misurazione simultanea e risolta nel tempo della generazione di trombine e plasmine, fornendo una valutazione integrata della coagulazione e della fibrinolisi. Dalla curva di generazione della trombina possono derivare diversi parametri, tra cui il tempo di ritardo, l'altezza di picco e il potenziale della trombina. Tempi di ritardo più lunghi, picchi più bassi e potenziali di trombina ridotti indicano una produzione di trombina compromessa.

La curva di generazione della plasmina fornisce anche molteplici parametri, tra cui il tempo di lisi della fibrina e l'altezza massima della plasmina. Tempi di lisi della fibrina più brevi e alte altitudini di picco riflettono una maggiore generazione di plasma. Le curve di generazione di trombomba e plasma da tre controlli sani e plasma normale aggregato hanno mostrato tempi di picco riproducibili all'altezza e alla fine, fungendo da profili di riferimento per la normale funzione emostatica.

In un paziente con attività di Fattore V del 3% della generazione di trombina era completamente assente. Tuttavia, la generazione di plasma aumentò marginalmente. Il paziente con attività del Fattore V del 44% ha mostrato una riduzione della generazione di trombine con un tempo di ritardo prolungato e una diminuzione dell'altezza di picco, mentre la generazione del plasma è rimasta all'interno della norma.

In caso di carenza di Alfa-2-antiplasmina, la generazione di plasma è aumentata con la diminuzione dell'attività dell'Alfa-2-antiplasmina. Il paziente omozigote con attività del 23% ha mostrato un inizio precoce della generazione di plasmina, un tempo di lisi fibrina più breve e un picco plasmatico più elevato. Queste alterazioni sono state osservate anche nel paziente eterozigote con attività del 73%, anche se non erano così evidenti.

Il saggio sull'emostasi è particolarmente adatto alla ricerca su rare carenze di fattori di coagulazione, disturbi fibrinolitici ed effetti emostatici. Le principali sfide sono la standardizzazione della tecnica e la normalizzazione dei risultati per migliorare la comparabilità tra stanze e laboratori. I lavori futuri potrebbero concentrarsi sull'automatizzazione del saggio e sullo sviluppo di adattamenti per la compatibilità con il sangue intero o plasma ricco di piastre.