Sviluppo di un nuovo modello di fissazione interna per le fratture radiali dei ratti: valutazione della guarigione delle fratture e isolamento dei ganglioni della radice dorsale

Le fratture radiali sono altamente diffuse a livello globale e una delle principali cause di fratture ossee lunghe degli estremi. Il modello della frattura radiale del ratto è fondamentale per studiare la guarigione delle fratture, lo screening farmacologico e la valutazione dei biomateriali nella ricerca ortopedica. Poiché il raggio dei ratti è relativamente sottile, le piastre e le viti d'acciaio attualmente utilizzate in pratica clinica non sono adatte al trattamento delle fratture radiali dei ratti.

Per superare questa limitazione, il protocollo combina in modo innovativo sutura e fissazione con ago in titanio, stabilendo un modello stabile di frattura radiale per la ricerca sulla fissazione interna. Nel protocollo, abbiamo anche presentato l'uso del sistema di micro-TC per animali vivi per chiarire la guarigione delle fratture nei ratti. Abbiamo inoltre mostrato l'estrazione e la coltura della DRG nel modello di frattura del ratto, che sarà utilizzato per studiare il meccanismo della lesione nervosa e della riparazione nelle fratture.

Gli strumenti chirurgici per fratture di ratto includono lama per bisturi, manico per bisturi, forbici operatorie, portaago, pinze emostatiche e pinze di tessuto dentato. Il maschio di ratto Sprague Dawley, di circa 8 settimane e del peso di circa 200 grammi. Anestetizzare il ratto utilizzando una macchina anestesicatrice a gas isoflurano e mantenere l'anestesia ventilatoria durante tutta la procedura chirurgica.

Mantieni la temperatura della sala operatoria a 28 °C. Posiziona il ratto in posizione laterale. Esponi l'arto anteriore destro e rasa i peli usando una tosa per capelli. Applicare un lenzuolo sterile e avvolgere un laccio emostatico attorno all'arto anteriore destro prossimale per ridurre il sanguinamento chirurgico.

Prepara la pelle alternando tre volte gli scrub di alcol e betadina. Effettuare un'incisione longitudinale di 1,5 cm sul lato radiale dorsale dell'avambraccio destro. Separare gli spazi muscolari ed esporre completamente il raggio dell'arto anteriore destro.

Usa forbici operatorie per tagliare il radio e creare una frattura trasversale. La direzione delle forbici forma un angolo di 90 gradi rispetto al raggio. Prendi un ago in titanio lungo 10 mm di diametro 0,8 mm e inseriscilo nella frattura radiale lungo il suo asse longitudinale.

Fissa il raggio e l'ago in titanio con la sutura. La sutura veniva legata con tre nodi consecutivi e l'ago di titanio veniva fissato al raggio tramite quattro suture interrotte. Sutura il colore della pelle della sutura in eccesso e chiudi il legno.

Disinfetta la pelle con scrub betadina. Copri la ferita con una garza sterile e fissala con delle bende. Il ratto riprese conoscenza dopo l'anestesia e le sue condizioni si riprese bene.

Anestetizzare il ratto usando una macchina per anestesia a gas isoflurano. Posiziona il ratto in posizione prona all'interno della camera di scansione. Regolare la posizione di arto e testa per centrare l'area di scansione del bersaglio nel campo visivo e mantenere una ventilazione e anestesia continue durante tutta la procedura.

Spingi il letto fisso per animali nella camera di scansione e chiudi la porta della camera. I parametri di scansione micro-CT erano impostati come segue: modalità di scansione: standard, tempo di esposizione: due minuti, campo visivo: 72 mm, dimensione voxel: 144 m, kilovolt: 90; micro-ampere: 88, filtro: 3D-soft. I dati della scansione vengono trasmessi automaticamente al software e viene generata un'immagine TC tridimensionale.

Separare i tessuti bersaglio. Esporta le immagini elaborate. Recidi la colonna vertebrale, rimuovi i corpi vertebrali da C1 a C7.

Tagliare la colonna cervicale lungo le linee medie anteriori e posteriori, divise in metà sinistra e destra. Usa le pinze a tessuto dentato per sollevare il DRG, sollevalo delicatamente e poi usa forbici operative per tagliare le fibre nervose. Trasferire i DRG estratti in un tubo centrifuga da 1,5 mL con mezzo di estrazione.

Mettere sul ghiaccio. Aspira lentamente e scarta il mezzo di estrazione. Aggiungi 1 mL di soluzione mista digestiva e enzimatica funzionante.

Digerisci in un bagno d'acqua a 37°C per 60-70 minuti. Pipetta una quantità adeguata della soluzione lavorativa sulla fibronectina in una piastra di Petri e copronala in un incubatore a 37 °C per un'ora. Dopo la digestione, aspira e scarta la soluzione funzionante di enzimi digestivi misti.

Raccogli il filtrato, centrifuga a 70 x g per 8,5 minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare e scartare il soprantantante nel tubo della centrifuga. Aggiungere 1 mL di mezzo intero per risospendere il precipitato.

Togli la piastra di Petri. Scartare la soluzione di lavoro sulla fibronectina e lavare due volte con PBS. Inocula le cellule in una piastra di Petri, aggiungi 1 mL di mezzo intero.

Mettili in un incubatore a temperatura costante a 37 °C con anidride carbonica al 5% per 8-12 ore. L'imaging micro-CT ha confermato il successo dell'istituzione di modelli di ratti per fratture radiali e di modelli di fissazione interna per le fratture radiali dei ratti. 20 giorni dopo la modellazione, l'analisi micro-CT dei ratti SD nel gruppo modello fratturale ha rivelato una prognosi favorevole.

È stata osservata la formazione di calli che collega le estremità della frattura, con fusione progressiva e obliterazione graduale della linea di frattura, coerente con la fase iniziale dell'unione ossea. Le immagini mostravano una linea di frattura sfocata nella regione modellata, suggerendo che il tessuto osseo nel sito della frattura si fosse in gran parte rimarginato. Nel quinto o sesto giorno dopo l'isolamento con DRG, le cellule neuronali mostrano un'estesa esposizione citoplasmatica.

A questo stadio, l'intero corpo cellulare neuronale e le sinapsi circostanti sono chiaramente distinguibili. La microscopia a immunofluorescenza è stata utilizzata per fotografare le cellule neuronali al sesto giorno di coltura. Come mostrato nella Figura 9, la Beta III-tubulina è stata mostrata come fluorescenza verde.

Le cellule positive alla beta III-tubulina, inclusi sia i corpi cellulari DRG che gli assoni, sono state colorate di verde, e la fluorescenza blu rappresenta i nuclei dei neuroni colorati da DAPI. I ratti sono un modello classico per studiare il meccanismo di guarigione delle fratture grazie al loro chiaro background genetico e al breve ciclo riproduttivo. Tuttavia, il piccolo diametro del raggio di circa 1-1,5 mm rende impossibile eguagliare il dispositivo di fissazione interna di livello clinico, limitandone gravemente l'utilità nella ricerca sulla guarigione nervo-ossa.

In risposta a questo problema, questo studio ha proposto in modo innovativo il metodo combinato di sutura e fissazione interna con ago in titanio. La logica centrale è sostituire la fissazione rigida delle viti con la legatura flessibile delle suture, che potrebbe ridurre la lesione nervosa iatrogena e fornire un ambiente meccanico stabile. Questo protocollo forniva ripetibilità e standardizzazione per la costruzione del modello.

Le suture e gli aghi in titanio sono utilizzati per la fissazione interna nei modelli di frattura radiale del ratto. La guarigione della frattura viene valutata tramite micro-TC. I neuroni primari della DRG vengono isolati e coltivati dopo esami di guarigione delle fratture.

Nel protocollo, combiniamo in modo innovativo suture e aghi di titanio per una fissazione interna stabile nel modello di frattura radiale del ratto. La guarigione della frattura è stata valutata tramite micro-TC, e i neuroni DRG primari sono stati isolati e coltivati per ulteriori indagini.