Migliorare gli schermi CRISPR-Cas9 nelle cellule CAR T: un metodo raffinato per la preparazione delle librerie
2 gennaio 2026
Abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato di screening knockout CRISPR-Cas9 per le cellule CAR T primarie. Riducendo il trasferimento del gDNA tramite la digestione enzimatica e il pulldown delle cassette sgRNA, questo approccio minimizza gli artefatti PCR, garantendo una rilevazione accurata degli sgRNA e un'identificazione robusta dei bersagli genici funzionali.
La nostra ricerca si concentra sull'uso di approcci di screening CRISPR per identificare i bersagli e aumentare l'efficacia delle terapie con cellule CAR T. Le sfide attuali degli esperimenti includono il raggiungimento di metodi di laboratorio riproducibili negli approcci di screening CRISPR. Per cominciare, aggiungi una quantità predeterminata di libreria virale CRISPR di Lenta a una piastra a 24 pozzi contenente cellule T.
Aggiungi policervello a una concentrazione finale di otto microgrammi per millilitro. Mescola delicatamente per garantire una distribuzione uniforme. Centrifugare le celle a 700 G per 90 minuti a 32 gradi Celsius per eseguire la spin-fection.
Dopo la centrifugazione, rimuovi con cura la piastra dalla centrifuga. Sostituisci il substrato con un nuovo mezzo di crescita per cellule T. Dopo sei ore, aggiungi il vettore virale CAR lenta a una molteplicità di infezione di tre.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro giorni. Una volta completata l'incubazione, raccogliere le cellule CAR T. Lava una volta con PBS.
Poi colora le cellule usando iodio di propidio arancione acradina e contale in un contatore fluorescente. Prepara una soluzione a quattro micromolari di Cas9 in un tampone di elettroporazione. Sospensa cinque volte 10 alla potenza di sei cellule CAR T in 50 microlitri di soluzione cas9.
Poi pipetta 50 microlitri della sospensione a celle in ogni pozzetto di una striscia cuvete multi-pozzetto senza formare bolle. Rimuovi eventuali bolle visibili facendo passare delicatamente una punta di pipetta lungo i bordi del pozzo. Usa il programma expand T-cell three per nucleettare le cellule CAR T.
Metti le cuvette in un incubatore a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Risospendere le cellule nucleoffectate nel mezzo di crescita delle cellule T. Poi incubare di nuovo a 37 gradi Celsius per tre giorni.
Contare le cellule utilizzando la colorazione con iodio di propidio arancione acradine in un contatore fluorescente. Dopo aver regolato la densità cellulare a dieci alla potenza di sei cellule per millilitro, aggiungere puromicina a una concentrazione finale di 2,5 microgrammi per millilitro. Dopo sei giorni di incubazione, valutare la percentuale di cellule CAR positive utilizzando la citometria a flusso.
Poi ordina le popolazioni di cellule CAR T e conserva i pellet a cellule secche a meno 80 gradi Celsius. Estrarre il DNA genomico dai campioni utilizzando un metodo di estrazione del DNA cellulare e tissutale. Misurare la concentrazione genomica di DNA utilizzando un kit di quantificazione del DNA a doppio filamento.
Successivamente, digerire fino a cinque microgrammi di DNA genomico con 20 unità degli enzimi di restrizione selezionati in un volume totale di 50 microlitri. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius in un termociclatore. Il giorno successivo, preparare 10 millilitri di tampone per eluzione contenenti 10 millimolartris HCL e 50 millilitri di etanolo fresco al 70%.
Pipetta 100 microlitri del prodotto digerito in un tubo contenente perle vortizate. Pipettare per mescolare accuratamente la sospensione e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente prima di magnetizzare per altri cinque minuti. Mentre si è sul magnete, scartare il sovrantantante e pipetare 200 microlitri della soluzione al 70% di etanolo senza disturbare il pellet.
Dopo 30 secondi, scartare il sovrantantante ed eseguire altri due lavaggi con alcol. Dopo due lavaggi, lascia asciugare le perline per due minuti, poi rimuovile dal magnete. Aggiungi 40 microlitri di tampone eluciano e pipetta per sospendere le perline.
Magnetizza la sospensione per due minuti, poi trasferisci il surnatante in un nuovo tubo. Aggiungi un buffer di legame x a un tubo contenente un milligrammo di perline magnetiche di sreptavidina vortice. Pipetta per sospendere le perline nel buffer.
Poi posiziona la sospensione su un magnete per un minuto, scarta il sovrantantante ed esegui altri due lavaggi. Dopo il terzo lavaggio riusciamo le perline in due x buffer di rilegatura per lavaggio. Poi aggiungi cinque microlitri di primer pull down biotinilati da 10 micromolari al prodotto digeritivo purificato.
Incubare la miscela in un bagno a secco a 96 gradi Celsius per cinque minuti e raffreddare immediatamente sul ghiaccio per cinque minuti. Aggiungi un milligrammo di sfere magnetiche di streptavidina pre-lavate alla reazione, assicurandoti che sia le sfere di streptavidina abbiano volumi uguali. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente, risospendendo ogni quattro minuti.
Magnetizza le perline per cinque minuti, poi lava tre volte con un x wash binding buffer. Infine, risospendere le sfere contenenti la cassetta sgRNA legata in 50 microlitri di buffer eluciano. Prepara e amplifica la libreria sgRNA e sequenziala.
Dopo la selezione degli antibiotici, le cellule CAR T trasdotte con la libreria CRISPR hanno mostrato sopravvivenza e proliferazione continuate in entrambi i donatori dopo il trattamento con puromicina. Le cellule T non trasdotte e le cellule T CAR prive di trasduzione della libreria CRISPR non hanno mostrato una proliferazione comparabile sotto selezione antibiotica e sono servite come controlli negativi. La digestione enzimatica di restrizione con NDEL e PSPXI ha generato DNA genomico frammentato, preservando al contempo la singola cassetta di RNA guida per l'arricchimento.
I frammenti contenenti sgRNA sono stati poi amplificati selettivamente. Le correlazioni di Pearson e Spearman hanno mostrato che il conteggio di letture di RNA guida singolo e la complessità della libreria sono stati mantenuti nei campioni genomici di DNA donatore rispetto alla libreria plasmidiale. Un'analisi robusta di aggregazione dei ranghi ha identificato geni significativamente arricchiti o impoveriti dopo l'editing Cas9 in entrambi i donatori.
L'analisi dell'arricchimento delle vie ha rivelato i termini principali dell'ontologia genica associati ai regolatori genetici identificati. Il nostro protocollo offre un'alternativa affidabile alle tecniche di laboratorio esistenti che utilizzano approcci di screening CRISPR. I nostri risultati faranno progredire il campo supportando lo sviluppo di protocolli di screening CRISPR più riproducibili e robusti.
I nostri risultati hanno aperto la strada all'identificazione dei geni e possono essere moderati per migliorare il fenotipo e la funzione delle cellule CAR T.
Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo ottimizzato di screening knockout mediante CRISPR-Cas9, appositamente adattato per linfociti T CAR umani primari. Il metodo affronta le difficoltà relative all'amplificazione PCR dei cassetto di sgRNA a partire da grandi quantità di DNA genomico, consentendo un'identificazione più efficiente e riproducibile di regolatori genetici che influenzano la funzione dei linfociti T CAR. Il flusso di lavoro comprende passaggi di digestione enzimatica e di prelievo selettivo per migliorare il recupero di sgRNA, favorendo così la scoperta di bersagli utili a potenziare le terapie con linfociti T CAR.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunoterapia
- Analisi genetica
- Ingegneria cellulare
Sfondo
- Le terapie con cellule CAR T sono altamente efficaci nelle neoplasie ematologiche, ma presentano limitazioni nei tumori solidi e nei tassi di recidiva.
- Migliorare l'efficacia e la persistenza delle cellule CAR T è un obiettivo principale della ricerca.
- Il screening CRISPR-Cas9 consente l'identificazione sistematica dei geni che regolano la funzione delle cellule CAR T.
- Il recupero standard di sgRNA mediante PCR dal DNA genomico è spesso inefficiente, specialmente in campioni difficili.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo solido e riproducibile di screening CRISPR per linfociti T CAR umani primari.
- Superare gli ostacoli tecnici nell'amplificazione del cassetto di sgRNA dal DNA genomico.
- Facilitare l'identificazione dei determinanti genetici che modulano il fenotipo e la funzione dei linfociti T CAR.
Metodi Utilizzati
- Trasduzione di linfociti T con una libreria lentivirale di sgRNA CRISPR e un vettore lentivirale CAR.
- Spin-fection e nucleofezione per un efficiente trasferimento genico e introduzione di Cas9.
- Selezione con antibiotico (puromicina) per arricchire le cellule T CAR correttamente modificate.
- Estrazione di DNA genomico, digestione enzimatica con enzimi di restrizione e recupero selettivo dei cassette di sgRNA mediante primer biotinilati e microsferette magnetiche di streptavidina.
- Amplificazione mediante PCR e sequenziamento dei cassette di sgRNA arricchiti.
- Analisi bioinformatica, inclusa la correlazione dei conteggi di letture, la valutazione della complessità della libreria e l'analisi dell'arricchimento dei percorsi biologici.
Risultati principali
- Il protocollo ottimizzato ha permesso un recupero e un'amplificazione efficienti dei cassetto di sgRNA dal DNA genomico delle cellule T CAR.
- Le cellule T CAR transdotte con la libreria CRISPR sono sopravvissute e si sono proliferate in presenza di selezione antibiotica, mentre i controlli non lo hanno fatto.
- La digestione con enzimi di restrizione ha preservato i cassetto di sgRNA per un arricchimento selettivo.
- I dati di sequenziamento hanno mostrato una complessità della libreria mantenuta e una forte correlazione con la libreria plasmidica originale.
- L'analisi di aggregazione robusta dei ranghi e l'analisi dei percorsi hanno identificato i principali regolatori genetici che influenzano la funzione delle cellule T CAR.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile e riproducibile per l'analisi CRISPR in cellule T CAR umane primarie.
- Il flusso di lavoro supera i limiti precedenti nel recupero di sgRNA dal DNA genomico.
- I risultati supportano l'identificazione di bersagli genetici per potenziare le terapie con cellule T CAR.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Lo screening efficiente con CRISPR-Cas9 in cellule T CAR umane primarie è fondamentale per identificare i determinanti genetici che modulano l'efficacia terapeutica e la persistenza. Questo metodo perfezionato di preparazione delle librerie affronta ostacoli tecnici di lunga data nel recupero di sgRNA, influenzando direttamente l'affidabilità della validazione degli obiettivi e della scoperta di percorsi molecolari nelle terapie cellulari ingegnerizzate. Una riproducibilità migliore e una qualità superiore dei dati a questo stadio consentono un avanzamento più sicuro dei candidati cellule T CAR nel percorso di immunoterapia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette un'analisi sistematica della funzione genica nelle cellule CAR T ai fini della validazione degli obiettivi.
- Supporta la riduzione dei rischi meccanicistici collegando le perturbazioni genetiche agli esiti fenotipici.
- Facilita l'identificazione dei percorsi che influenzano l'attivazione, la proliferazione e la citotossicità.
- Migliora la fiducia predittiva nella selezione di bersagli genetici per ulteriori sviluppi.
Sviluppo di screening e saggi
- Garantisce un recupero e un'amplificazione robusti degli sgRNA per schermate CRISPR ad alta complessità.
- Standardizza la preparazione delle librerie, riducendo la variabilità e migliorando la riproducibilità.
- Consente una valutazione quantitativa degli esiti della modifica genica in più donatori.
- Prepara sistemi cellulari validati per saggi funzionali e fenotipici a valle.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati genetici ai fenotipi delle cellule T CAR rilevanti per la malattia, garantendo continuità traslazionale.
- Permette lo sviluppo di terapie cellulari ingegnerizzate in modelli preclinici con valutazione del rischio.
- Fornisce una base per la scoperta di biomarcatori associati alla persistenza e all'efficacia delle cellule T CAR.
- Riduce il rischio biologico in fase avanzata chiarificando i fattori genetici che guidano la risposta terapeutica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo ottimizzato si inserisce nel percorso continuo che va dalla scoperta alla fase preclinica per le terapie cellulari ingegnerizzate, collegando l'identificazione del bersaglio, il screening e la validazione traslazionale.
- Biologia della scoperta: Consente test ipotetici della funzione genica e mappatura di percorsi nelle cellule CAR T.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili di sgRNA per analisi comparative solide.
- Analisi: Supporta la valutazione statistica dell'arricchimento e dell'esaurimento genico, informando la priorizzazione dei bersagli.
- Ricerca traslazionale: Collega le perturbazioni genetiche a fenotipi funzionali delle cellule CAR T rilevanti per l'avanzamento preclinico.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato adattabile ad altre piattaforme di cellule immunitarie ingegnerizzate.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione delle target.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità degli screening CRISPR in cellule primarie.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale nei portafogli di terapie cellulari.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione basate su una valutazione del rischio dei candidati per terapie cellulari ingegnerizzate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di librerie CRISPR, nella trasduzione lentivirale e nella manipolazione di cellule primarie.
- Necessita dell'accesso a strumenti di estrazione e quantificazione del DNA genomico di alta qualità.
- Richiede protocolli standardizzati per la digestione enzimatica e l'arricchimento mediante perle magnetiche.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi tipi cellulari o complessità delle librerie di sgRNA.
- Dipende da solide pipeline bioinformatiche per l'analisi e l'interpretazione dei dati di sequenziamento.
Domande frequenti di biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:21
CAR T Cell Production and CRISPR-Cas9 Screening Workflow in Primary Human T Cells
2:59
Genomic DNA Digestion and sgRNA Cassette Enrichment for CRISPR Screening
4:40
Streptavidin-Based Pulldown of sgRNA Cassettes for CRISPR-Cas9 Screening
6:14
Results
7:35
Conclusion
