Saggio multiplexato di immunofluorescenza per la valutazione spaziale dei marcatori di senescenza in vivo

L'analisi spaziale delle cellule senescenti è importante per comprendere il loro contributo a processi come l'invecchiamento, il cancro, l'immunità e l'omeostasi dei tessuti normali. La rilevazione delle cellule senescenti si basa sul profiling di più biomarcatori. L'imaging multiplex a immunofluorescenza consente un profilaggio ad alta produttività di questi all'interno di una singola sezione tissutale.

Per cominciare, verificare che le sezioni di tessuto fisse in formalina, incorporate in paraffina o FFPE, spesse 5 micrometri, con una dimensione massima di 4 x 2 centimetri quadrati, siano montate centralmente su vetrine di microscopia carica positivamente e siano chiaramente visibili all'interno della finestra di osservazione del portavetrino senza copertura. Esegui i passaggi di preparazione del campione, sia manualmente usando una camera di decloaking sia automaticamente tramite un tintore automatico. Inserisci le vetrine preparate nel portavetri senza slip.

Allinea i bordi superiore e destro contro i fermi metallici. Blocca il carrello in posizione usando entrambe le mani contemporaneamente per girare le camme di plastica nella posizione chiusa del lucchetto. Verifica che il carrello sia completamente piatto e non oscilli all'interno del porta.

Posiziona il ClickWell, inserisci la camera sopra il carrello e pizzica le barre laterali con entrambe le mani per limitare la pressione e prevenire roture. Carica il pozzo di scatto con 2 millilitri di mezzo di montaggio contenente il 50% di glicerolo in soluzione salina tamponata fosfato tramite la porta di ingresso. Aggiungi un'etichetta con codice a barre sul lato sinistro della diapositiva in entrambe le orientazioni, poi procedi per l'imaging.

Per la selezione delle regioni e l'analisi dell'autofluorescenza, apri il Mx Workflow versione 4204, software per acquisizione immagini multiplex. Clicca su Strumenti per selezionare Protocollo Publisher. Nel pop-up Multiplex Protocol Publisher, inserisci il nome del protocollo.

Clicca su Crea Turno di Configurazione, seguito da aggiungi Round Protocollo Successivo per creare più round di etichettatura dei biomarcatori. Clicca su Pubblica, poi seleziona OK nella finestra pop-up. Acquisisci il canale Cy3 per immagini virtuali H&E.

Clicca su Slide, poi Crea un nuovo lotto. Dopo aver selezionato il nome del protocollo, inserisci l'ID della diapositiva. Clicca su Aggiungi Diapositiva e poi seleziona Crea Batch per creare un flusso di lavoro di esperimenti multiplex. Apri il software di acquisizione Cell DIVE.

Clicca su Carica per caricare il vetrino nel microscopio. Nel menu a tendina Strumenti, clicca sull'icona della griglia per definire le regioni desiderate e usa lo strumento Move per riposizionare le regioni definite. Successivamente, usa lo strumento Disegna per deselezionare i campi non necessari, assicurandoti che ogni campo visivo abbia almeno due campi visivi vicini per evitare problemi di cucitura, e clicca su Salva regioni.

Nella finestra Mx Workflow, clicca su Viewer QC per aprire la pagina del visualizzatore Cell DIVE e visualizzare l'immagine del tessuto in ingrandimento 10x. Clicca sull'icona di correzione immagine per regolare la luminosità dell'immagine e clicca su Invia controllo qualità per selezionare Passa e ricarica slide nella finestra pop-up. Quando l'immagine si ricarica, clicca su Aggiungi ROI per disegnare e regolare le regioni di interesse.

Seleziona i campi visivi desiderati e ripeti l'aggiunta del ROI. Successivamente, clicca su Invia al laboratorio. Carica il diapositive per iniziare l'acquisizione dell'immagine in autofluorescenza 20x.

Nel menu Imaging QC, seleziona la casella corrispondente all'ID specifico della Diapositiva, poi clicca su Visualizzatore QC. Ingrandisci l'immagine caricata per scansionare regioni sfocate o artefatti. Controlla le immagini di sfondo per ogni canale, che verranno sottratte dal segnale finale del biomarcatore. Clicca su Invia QC, poi seleziona Passa ed Esci per generare immagini di sfondo.

Prima della colorazione sequenziale dei biomarcatori, centrifugare gli anticorpi a 13.000 G per un minuto a temperatura ambiente per limitare gli artefatti. Preparare la soluzione di anticorpi a una diluizione 1 su 200 in soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, contenente albumina sierica bovina allo 0,3%. Rimuovi il supporto di montaggio facendo pipetta dalla porta ClickWell.

E lava tre volte con 2 millilitri di PBS contenente 0,01% Tween 20 o PBST per 5 minuti. Aggiungere 350 microlitri di soluzione di anticorpi nel port per garantire una copertura completa del campione all'interno della camera di colorazione. Incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Successivamente, pipetta la soluzione di anticorpi dalla porta ClickWell. E lava tre volte con 2 millilitri di PBST per 5 minuti. Aggiungi 2 millilitri di supporto di montaggio.

Inserisci il portaoggetti ClickWell nel microscopio e carica il vetrino per iniziare l'imaging con biomarcatori 20x. Esegui il controllo qualità dell'immagine utilizzando l'editor di fusione e le opzioni di correzione dell'immagine e invia la valutazione del controllo qualità dell'immagine. Pipetta il supporto di montaggio dalla porta ClickWell e lava tre volte con 2 millilitri di PBST per 5 minuti.

Prepara la soluzione di inattivazione del colorante frescamente prima dell'uso. Dopo aver rimosso il PBST, aggiungi 2 millilitri di soluzione di inattivazione del colorante per ogni vetrina. Incubare per 15 minuti nel portavetri.

Pipetta la soluzione di inattivazione del colorante dal porto ClickWell e lava con 2 millilitri di PBST per 5 minuti. Aggiungi 2 millilitri di supporto di montaggio e inserisci il portaClickWell nel microscopio per avviare l'imaging automatico a autofluorescenza 20x specifico per il round. Fai progredire il flusso di lavoro passando i passaggi di controllo qualità come indicato sullo schermo al completamento.

Ripetere la colorazione sequenziale, l'inattivazione del colorante e l'imaging multiplex per tutti i marcatori necessari, e proseguire fino al completamento. Utilizza il software HALO per selezionare vari canali per visualizzare la localizzazione dei marcatori in diverse regioni del nucleo tissutale. Clicca su Analizza e seleziona Immagine Completa per analizzare le metriche quantitative dei singoli indicatori.

Clicca su Risultati per visualizzare il numero totale di cellule nel nucleo tessutale analizzato e il sottoinsieme di cellule che esprimono marcatori specifici. Rispetto al metodo automatizzato basato su coloratore di vetrina, il metodo manuale a camera di decloaking ha portato a una frequenza più elevata di artefatti tissutali caratterizzati specificamente da distacco di tessuto così come da carote perse o scivolate. La quantificazione effettuata con software di patologia digitale su tessuto pancreas rappresentativo ha rivelato che le cellule p16 positive erano associate a livelli più bassi di LB1 e viceversa, dimostrando un profilo coerente con i pattern marcatori associati alla senescenza.

Una mappa termica normalizzata Z-score illustra la distribuzione del fenotipo di senescenza p16 positivo lamin-B1 negativo in vari tessuti, rivelando alte concentrazioni di cellule senescenti nei polmoni, nelle ghiandole surrenali e pituitarie corrispondenti a livelli elevati di p16 e diminuizione di LB1. Al contrario, appendice, linfonodo e milza hanno mostrato una bassa senescenza, mantenendo un'alta espressione di LB1 e bassa di p16. Questo protocollo consente di sondare una combinazione di biomarcatori di senescenza, strutturali e immunitari all'interno di un singolo vetrino microscopico.

Combinando più marcatori all'interno di un singolo campione, è possibile effettuare un'analisi spaziale dell'architettura tissutale e della distribuzione cellulare senescente. Le applicazioni future includono la profilazione su larga scala di biomarcatori di senescenza su più tipi di tessuto e l'integrazione con omici spaziali per risolvere meglio l'eterogeneità cellulare.