Isolamento dei periciti dal tessuto corticale del topo tramite FACS per il sequenziamento a singola cellula
30 gennaio 2026
Per ottenere periciti corticali cerebrali di topo che soddisfano le esigenze dello scRNA-seq, presentiamo un protocollo FACS ottimizzato in modo critico basato sulla selezione CD13⁺/CD31⁻. I nostri principali perfezionamenti migliorano significativamente la vitalità cellulare e l'integrità dell'RNA, consentendo un profiling trascrittomico affidabile.
La nostra ricerca esamina i parassiti cerebrali concentrandosi sui loro ruoli vascolari e sulle loro interazioni all'interno dell'unità neurovascolare per comprendere la funzione cerebrale. Bassa imaging e la mappatura spaziale del FACS in un processo intestinale o la funzione parassita all'interno della vascolatura cerebrale rivelano i ruoli specifici della localizzazione e i bersagli terapeutici. Per cominciare, spruzzare la zona della testa e del collo di un topo soppresso con il 75% di etanolo.
Con un bisturi, si effettua un'incisione centrale del cuoio capelluto dalla regione occipitale a quella frontale per esporre il cranio. Eseguire un'incisione trasversale anteriore alle orbite bilaterali, seguita da incisioni laterali lungo i margini inferiori del cervelletto per staccare la base del cranio. Incisci il calvario longitudinalmente lungo la sutura sagittale da posteriore a anteriore.
Solleva il lembo cranico insieme a un duramatero per esporre il cervello. Utilizzando forbici chirurgiche, solleva delicatamente il cervello recidendo i nervi ottici e la connessione del midollo oblungato. Posiziona delicatamente il cervello intatto in una piastra da 10 centimetri contenente 10 millilitri di PBS ghiacciato, evitando qualsiasi danno.
Trasferisci il cervello su carta stagnola. Esponi lo spazio subaracnoidea. Dopo aver rimosso la dura con la pinza, risciacquala con la soluzione salina equilibrata di Hank.
Trasferisci il fazzoletto su carta filtrante e rimuovi il piater arrotolandolo. Con una lametta, taglia e scarta il bulbo olfattivo e le sezioni più caudali, e sezioni coronali del cervello in fette spesse due o tre millimetri. Isola la corteccia cerebrale lungo il corpo calloso.
Trasferire il tessuto corticale in fiole contenenti tre millilitri di tampone di raccolta del tessuto gelido. Utilizzando bisturi chirurgici, trita tessuto e fiole in frammenti di circa un millimetro per un millimetro, e completa la tritazione entro cinque minuti per preservare la freschezza del tessuto. Pre-risciacquo le punte della pipetta con il tampone per la raccolta dei tessuti.
Poi aspira lentamente i frammenti tritati verso l'apice della punta tenendo la pipetta in verticale. Espelle delicatamente i frammenti in tubi centrifuga da 15 millilitri pre-raffreddati. Lava le fiole originali con 2% FBS in soluzione salina PBS.
Trasferisci il lavaggio negli stessi tubi centrifughe e centrifuga a 300G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il soprantantante dopo la centrifugazione. Risospendere ogni pellet in tre millilitri di soluzione funzionante enzimatica CD.
Distribuisci la sospensione in tre tubi in modo uniforme e aggiungi una soluzione enzimatica aggiuntiva per raggiungere un volume finale di cinque millilitri per tubo. Incubare i tubi in un forno di ibridazione a 37 gradi Celsius per 100 minuti con scuotimento orbitale a 100G. Durante l'incubazione, aggiungere un millilitro di dnase a una soluzione a 10 millilitri di 2% FBS in PBS.
Terminare la digestione centrifugando a 300G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Poi risospendi ogni pellet in un millilitro di soluzione di dissociazione tissutale. Pipetta la soluzione 100 volte per aiutare la dissociazione meccanica.
Successivamente, concentra tutte le sospensioni in un unico tubo centrifugo da 50 millilitri. Risciacqua ogni tubo con due millilitri di tampone e unisci i lavaggi. Dopo la centrifugazione a 300G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartando lo strato superiore, aggiungere 12,5 millilitri di 20% BSA e invertire per mescolare.
Centrifugare a 1000 G a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Ora raccogli il pellet inferiore e trasferisci il surnante in un nuovo tubo centrifuga da 50 millilitri. Risospendi delicatamente prima di centrifugare di nuovo.
Risospendere ogni pellet in due millilitri di 2%FBS in PBS. Poi combini entrambe le sospensioni in un unico tubo. Centrifuga la sospensione combinata a 300G a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Dopo aver scartato il surnadante, sospendere nuovamente l'ultimo pellet in due millilitri di PBS con il 2%FBS. Preparare quattro tubi centrifughe da 15 millilitri contenenti quattro millilitri di soluzione al 22% per chiamata. Applicare delicatamente aliquote di 0,5 millilitri della sospensione della cella su ogni gradiente e centrifugare a 560G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver aspirato il soprantantante, risospendere ogni pellet in un millilitro di buffer di glucosio HBSS BSA. Poi smonta le sospensioni in un nuovo tubo da 15 millilitri. Risciacquare i tubi di percol con due millilitri di tampone e combinare i lavaggi prima della centrifugazione a 300G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Per la citometria a flusso, risospendere il pellet in un millilitro di buffer di glucosio HBSS BSA dopo aver aspirato il supernadant. Aggiungi cinque microlitri di reagente bloccante i recettori FC e incuba a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Poi pipetta con anticorpi coniugati fluorescenti contro la sospensione prima dell'incubazione.
Lavare le cellule con sei millilitri di buffer di glucosio HBSS BSA. Poi centrifuga la sospensione a 300G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver aspirato il surnadante, risospendere il pellet in un millilitro di tampon.
Aggiungi 200 microlitri di soluzione di sette amminomicine D e incuba sul ghiaccio per 10 minuti. Poi regola il volume finale a due millilitri con buffer HBSS integrato con BSA e glucosio. Risciacqua la superficie interna dei tubi di raccolta con una soluzione all'1%BSA.
Aspira la soluzione in eccesso, lasciando esattamente un millilitro di soluzione in ogni provetta. Conserva i tubi sul ghiaccio per ricevere le celle selezionate. Le cellule dissociate dal tessuto cerebrale sono state sequenzialmente bloccate dall'area di scatter in avanti e dall'area di dispersione laterale per escludere i detriti cellulari durante la selezione della citometria di flusso.
Gli eventi positivi a CD45 e positivo a CD41 sono stati esclusi per rimuovere cellule ematopoietiche e contaminanti piastrinosi. Le cellule della parete vascolare CD13 positive sono state arricchite. E le cellule apoptotiche sono state escluse tramite sette gating amminomicina D negativa, seguita dalla selezione CD31 negativa per isolare i parassiti.
L'ordinamento della citometria a flusso ha mostrato che le cellule nucleate rappresentavano il 59,8% di tutti gli eventi. Le cellule positive al CD13 hanno rappresentato l'1% di tutti gli eventi. E la popolazione finale positiva al CD13 positivo al CD31 ha rappresentato lo 0,7% di tutti gli eventi.
La riduzione della dimensionalità UMAP delle cellule ordinate ha rivelato sei cluster principali distinti che indicano l'eterogeneità cellulare all'interno della popolazione isolata. L'analisi della mappa termica normalizzata con Z-score ha dimostrato che i geni marcatori del parassita erano fortemente e prevalentemente espressi nei cluster da zero a tre. L'analisi della proporzione di cluster ha mostrato che i cluster da zero a tre costituivano l'87,1% della popolazione totale.
Mentre i marcatori delle cellule muscolari lisce sono stati arricchiti nel cluster quattro al 10,14% e i marcatori dei fibroblasti sono stati arricchiti nel cluster 5 al 2,77%, questo protocollo consente ai ricercatori di isolare parassiti indossabili ad alta purezza adatti al sequenziamento a singola cellulare a valle e all'analisi funzionale. La principale sfida è l'assenza di marcatori parassitari altamente specifici, l'isolamento complicato e l'aumento del rischio di contaminazione secolare. Studi futuri potranno concentrarsi sull'identificazione dei marcatori specifici dei parassiti, permettendo un miglioramento degli isolati, una caratterizzazione funzionale più profonda e indagini terapeutiche mirate.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato e riproducibile per l'isolamento di periciti cerebrali murini adatti al sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Affinando la consolidata strategia di selezione basata su CD13+/CD31- e introducendo miglioramenti chiave, il metodo consente un isolamento robusto di periciti vitali, facilitando lo studio della loro eterogeneità e dei loro ruoli nelle malattie neurovascolari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia vascolare
Sfondo
- I periciti sono essenziali per mantenere l'integrità della barriera emato-encefalica.
- Regolano l'omeostasi emodinamica cerebrale modulando il tono microvascolare.
- La disfunzione dei periciti è associata a diverse patologie neurologiche.
- Comprendere l'eterogeneità dei periciti è fondamentale per chiarire il loro ruolo nelle malattie neurovascolari.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo ottimizzato per l'isolamento di periciti cerebrali murini adatto alla scRNA-seq.
- Permettere un'analisi di alta qualità dell'eterogeneità dei periciti a singola cellula.
- Fornire uno strumento per lo studio dei meccanismi dei periciti nelle malattie neurovascolari.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento dei cervelli da topi adulti C57BL/6.
- Dissociazione meccanica e digestione enzimatica del tessuto cerebrale per ottenere sospensioni cellulari singole.
- Passaggi sequenziali di centrifugazione.
- Risospensione del pellet cellulare finale in albumina sierica bovina (BSA) al 20% per ridurre al minimo lo stress e l'aggregazione.
- Ordinamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS) mediante strategia CD13+/CD31-.
Risultati principali
- Il protocollo permette di ottenere periciti cerebrali di topo vitali, adatti per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq).
- L'uso del 20% di BSA migliora la vitalità cellulare e la qualità dell'RNA.
- Il metodo è riproducibile e robusto per l'isolamento dei periciti.
- Consente lo studio dettagliato dell'eterogeneità dei periciti a risoluzione singola cellula.
Conclusioni
- Questo protocollo ottimizzato facilita l'isolamento di alta qualità delle periciti cerebrali murine per la scRNA-seq.
- Fornisce uno strumento prezioso per analizzare la diversità delle periciti e il loro ruolo patologico nelle malattie neurovascolari.
- L'approccio potrebbe favorire la ricerca sui meccanismi legati alle periciti nei disturbi neurologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Un isolamento robusto di periciti vitali da tessuto corticale murino mediante FACS soddisfa direttamente la necessità di input cellulari ad alta fedeltà nella scoperta di bersagli neurovascolari. Questo protocollo aumenta la sicurezza predittiva negli studi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula riducendo lo stress cellulare e l'aggregazione, sostenendo una rigorosa validazione dei bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase iniziale della scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale. L'approccio consente flussi di lavoro scalabili e riproducibili, essenziali per la selezione del portafoglio e la continuità della ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi precisa dell'eterogeneità dei periciti, rilevante per i meccanismi delle malattie neurovascolari.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi fornendo input di singole cellule di alta qualità per il profilo trascrittomico.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico attraverso l'isolamento riproducibile di popolazioni cellulari definite.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce popolazioni di periciti convalidate per saggi a singola cellula e screening molecolari successivi.
- Migliora la riproducibilità e la standardizzazione dei saggi riducendo al minimo l'aggregazione cellulare e lo stress.
- Consente letture quantitative essenziali per una valutazione affidabile dei composti nei processi mirati al sistema nervoso centrale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Permette un allineamento con la modellizzazione del sistema rilevante per la malattia isolando i periciti implicati nella patologia neurovascolare.
- Consente una transizione continua dalla scoperta alla validazione preclinica mediante la generazione di dati di singola cellula di alta qualità.
- Fornisce una piattaforma per l'identificazione di biomarcatori traslazionali associati alla disfunzione dei periciti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di isolamento delle periciti basato sulla FACS si inserisce all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e la ricerca preclinica, fornendo materiale cellulare di alta qualità per il sequenziamento a singola cellula e per studi funzionali successivi.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'analisi trascrittomica a singola cellula dei periciti.
- Screening: Fornisce popolazioni cellulari riproducibili e vitali per lo sviluppo di saggi e lo screening di composti.
- Analisi: Fornisce dati quantitativi di RNA a singola cellula per l'analisi comparativa in diverse condizioni.
- Ricerca Translazionale: Facilita la scoperta di biomarcatori e la chiarificazione dei meccanismi delle malattie nei modelli neurovascolari.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato adattabile ad altri tipi cellulari del sistema nervoso centrale con ottimizzazione dei marcatori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione di bersagli neurovascolari.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro per l'isolamento di singole cellule.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) e l'efficienza nell'uso del capitale nello sviluppo del portafoglio CNS.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata ai rischi di bersagli neurovascolari e programmi traslazionali.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze nell'uso del FACS e nella selezione dei marcatori cellulari neurovascolari.
- Richiede accesso a infrastrutture di citometria a flusso e di sequenziamento a singola cellula di alta qualità.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di elaborazione dei tessuti e di sorting cellulare.
- Potrebbe richiedere l'adattamento dei pannelli di marcatori per altri tipi cellulari del SNC o modelli di malattia.
- La vitalità cellulare e l'integrità dell'RNA dipendono da una manipolazione accurata e dalla prevenzione dell'aggregazione mediata da BSA.
