Metodo standardizzato per rilevare nanotubi in tunneling nelle cellule della pelle umana per applicazioni di ingegneria tissutale

Abbiamo sviluppato metodi per rilevare e analizzare in modo affidabile i nanotubi di tunneling tra cellule della pelle umana e per studiare il loro potenziale ruolo nella rigenerazione della pelle. Il nostro protocollo è progettato per campioni fissi o per cellule primare della pelle umana. È utile nella ricerca relativa alla biologia della pelle e alla rigenerazione dei tessuti.

Per cominciare, scongelare e coltivare cheratinociti epidermici umani e fibroblasti dermici in piastre da 60 millimetri contenenti il terreno di crescita appropriato. Integrare le colture cheratinotici con Y-27632 fino a una concentrazione finale di cinque micromolari durante la rianimazione. Mantieni tutte le colture a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato fino a raggiungere circa l'80% di confluenza.

Poi togli il substrato dal piatto di coltura. Risciacquare brevemente le cellule con un millilitro di PBS per mantenere il pH fisiologico e l'osmolarità durante il lavaggio. Aspira completamente il PBS.

Aggiungi un millilitro di EDTA allo 0,05% di tripsina e distribuiscilo uniformemente sulla superficie cellulare. Incubare il piatto a 37 gradi Celsius per 1,5-2,5 minuti. Sospezioni delicatamente le cellule pipettando su e giù.

Aggiungi due millilitri di mezzo di crescita per neutralizzare la tripsina. Trasferire la sospensione della cella in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 200 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, si elimina il soprandanzante dal tubo della centrifuga.

Risospendere il pellet cellulare in uno o due millilitri di mezzo e contare le cellule utilizzando un contatore automatico. Successivamente, semina 12.000 fibroblasti dermici o 20.000 cheratinoviti in ciascun pozzo di una lamina a camera a otto pozzi in un volume finale di 400 microlitri. Dopo la semina, agitare bene la camera per distribuire uniformemente le cellule e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per circa 24 ore.

Dopo l'incubazione, verificare se la confluenza cellulare è intorno all'80% al microscopio. Quando le colture raggiungono l'80% di confluenza, aggiungi delicatamente diverse gocce di soluzione fissativa, una direttamente nel pozzo della camera per prefissare le cellule. Incubare le cellule a temperatura ambiente per quattro minuti, assicurandosi che il fissativo si distribuisca uniformemente senza disturbare le cellule.

Poi aspira il prefissativo dal pozzo e aggiungi 140 microlitri di soluzione fissativa fresca uno, assicurando una copertura completa della superficie del pozzo. Incubare il vetrino a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, rimuovere il fissativo dal pozzo della camera e aggiungere 140 microlitri di 100 millimolari cloruro di ammonio per temprare gli aldeidi residui.

Incubare il vetrino a temperatura ambiente per 10-30 minuti. Risciacquare i campioni tre volte con PBS per 30 secondi ciascuno a temperatura ambiente. Durante ogni risciacquo, pipetta delicatamente il tampone lungo la parete della camera per evitare di lavare via le cellule o danneggiare i nanotubi in tunnel.

Incubare le cellule con 140 microlitri di diluizione volume-volume 1:300 di aglutinina di germi di grano Alexa Flour coniugato in PBS. Eseguire l'incubazione al buio a temperatura ambiente per 20 minuti per etichettare glicoproteine della membrana plasmatica e visualizzare i nanotubi di tunneling derivati dalla membrana. Poi lava le cellule tre volte con PBS per 30 secondi ciascuna.

Poi incubare le cellule con 140 microlitri di falloidina coniugato diluiti da una a 250 volte all'1% di BSA per 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le cellule tre volte con PBS, incubarle con 140 microlitri di soluzione DAPI per cinque minuti a temperatura ambiente al buio. Infine, aggiungi due o tre gocce di substrato da montaggio in ogni pozzo e incuba il campione a temperatura ambiente per 20 minuti.

Conserva le vetrine a quattro gradi Celsius al buio per almeno 20 minuti fino all'imaging finale. Nelle colture di fibroblasti dermici, i nanotubi tunneling sono stati osservati come lunghe sottili proiezioni che collegano cellule adiacenti con membrane colorate da agglutinina germinale di grano e F-actina marcate dalla falloidina. Nelle colture di cheratinociti epidermici, sono stati osservati anche nanotubi tunneling con caratteristiche protuberanze positive per la F-actina che collegano cellule vicine.

Nelle co-colture di fibroblasti dermici e cheratinociti epidermici, sono stati costantemente rilevati nanotubi tunneling tra fibroblasti dermici e cheratinociti epidermici, visualizzati tramite colorazione con membrana e citocheratina 5. I nanotubi tunneling nelle co-colture hanno mostrato una diversificata organizzazione citoscheletrica con esemplari contenenti solo F-actina, sia i filamenti, sia F-actin con parziale alfa-tubulina, sia con bassi livelli di alfa-tubulina. La sfida principale è preservare il tunnel nei nanotubi.

Questo richiede una fissazione delicata, tempi appropriati e l'uso di additivi fissi appena preparati. Utilizzando il nostro protocollo, i nanotubi di tunneling possono essere misurati in condizioni cellulari variabili per esplorare le loro potenziali funzioni. In futuro, marchieremo i mitocondri con fluorescenza per studiarne il trasferimento tramite nanotubi a tunneling.