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Gli autori ringraziano gli sviluppatori e i manutentori dei pacchetti Seurat, Giotto e SPOTlight per il supporto e la documentazione forniti. Si riconosce inoltre con gratitudine il contributo dei repository di dati pubblici e dei ricercatori che hanno generosamente condiviso i loro set di dati.

<ol>
	<li>Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.</li>
	<li>Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.</li>
	<li>Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.</li>
	<li>Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933</li>
	<li>Wang G, Wu S, Xiong Z, Qu H, Fang X, Bao Y. CROST: A comprehensive repository of spatial transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D882-D890.</li>
	<li>Chen JG, Ch&#225;vez-Fuentes JC, O&#8217;Brien M, et al. Giotto Suite: a multiscale and technology-agnostic spatial multiomics analysis ecosystem. Nat Methods. 2025;22(10):2052-2064. doi:10.1038/s41592-025-02817-w</li>
	<li>Butler A, Hoffman P, Smibert P, Papalexi E, Satija R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 2018;36(5):411-420.</li>
	<li>Elosua-Bayes M, Nieto P, Mereu E, Gut I, Heyn H. SPOTlight: seeded NMF regression to deconvolute spatial transcriptomics spots with single-cell transcriptomes. Nucleic Acids Res. 2021;49(9):e50-e50.</li>
	<li>McCarthy DJ, Campbell KR, Lun ATL, Wills QF. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics. 2017;33(8):1179-1186.</li>
	<li>Lun ATL, McCarthy DJ, Marioni JC. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with bioconductor. F1000Research. Preprint posted online October 31, 2016. doi:10.12688/f1000research.9501.2</li>
	<li>Miller BF, Huang F, Atta L, Sahoo A, Fan J. Reference-free cell type deconvolution of multi-cellular pixel-resolution spatially resolved transcriptomics data. Nat Commun. 2022;13(1):2339.</li>
	<li>Palla G, Spitzer H, Klein M, et al. Squidpy: A scalable framework for spatial omics analysis. Nat Methods. 2022;19(2):171-178.</li>
	<li>Luecken MD, B&#252;ttner M, Chaichoompu K, et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 2022;19(1):41-50.</li>
	<li>Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019 Dec 23;20(1):296.</li>
	<li>Cuevas-Diaz Duran R, Wei H, Wu J. Data normalization for addressing the challenges in the analysis of single-cell transcriptomic datasets. BMC Genomics. 2024;25(1):444.</li>
	<li>Sun S, Zhu J, Zhou X. Statistical analysis of spatial expression patterns for spatially resolved transcriptomic studies. Nat Methods. 2020;17(2):193-200.</li>
	<li>Jin S, Plikus MV, Nie Q. CellChat for systematic analysis of cell&#8211;cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 2025;20(1):180-219.</li>
	<li>Zohora FT, Paliwal D, Flores-Figueroa E, et al. CellNEST reveals cell&#8211;cell relay networks using attention mechanisms on spatial transcriptomics. Nat Methods. 2025;22(7):1505-1519.</li>
	<li>Wang Q, Zhu H, Deng L, et al. Spatial transcriptomics: Biotechnologies, computational tools, and neuroscience applications. Small Methods. 2025;9(5):2401107.</li>
	<li>Chen MM, Gao Q, Ning H, et al. Integrated single-cell and spatial transcriptomics uncover distinct cellular subtypes involved in neural invasion in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2025;43(9):1656-1676.e10.</li>
	<li>Li H, Guan W, Huang J, et al. A complete model of mouse embryogenesis through organogenesis enabled by chemically induced embryo founder cells. Cell. 2025;188(21):5912-5930.e20.</li>
	<li>Loh JW, Lee JY, Lim AH, et al. Spatial transcriptomics reveal topological immune landscapes of asian head and neck angiosarcoma. Commun Biol. 2023;6(1):461. </li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in conflitto.

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro computazionale completo per l'analisi dei dati di trascrittomica spaziale, che coniuga profondità analitica e accessibilità pratica. L'approccio passo dopo passo guida i ricercatori attraverso l'intero percorso analitico, dalla acquisizione iniziale dei dati fino ad analisi spaziali avanzate, sottolineando al contempo i punti critici decisionali e i potenziali ostacoli.
Diversi passaggi del protocollo richiedono particolare attenzione a causa del loro impatto sui risultati successivi. Le soglie di controllo qualità e filtraggio devono essere attentamente adattate ai tipi specifici di tessuto e alle piattaforme tecnologiche, poiché un filtraggio eccessivamente rigoroso potrebbe rimuovere spot biologicamente rilevanti, mentre soglie troppo permissive possono introdurre rumore tecnico. La scelta del metodo di normalizzazione influenza in modo significativo i risultati successivi di clustering ed espressione differenziale. Ad esempio, la pipeline utilizza SCTransform invece della normalizzazione logaritmica standard perché si è riscontrato che SCTransform modella e riduce la variazione tecnica associata alla profondità di sequenziamento e ad altri effetti tecnici nei flussi di lavoro single-cell e spaziali14,15. Durante l'integrazione, la selezione delle caratteristiche di integrazione e dei parametri di risoluzione richiede un'attenta valutazione per bilanciare la forza di integrazione con la conservazione del segnale biologico. Per l'individuazione di geni variabili spazialmente, è stato scelto Moran's I per la sua scalabilità computazionale e idoneità all'analisi di autocorrelazione spaziale in dati basati su array, anche se possono essere considerati chiamatori alternativi come SPARK a seconda delle dimensioni del dataset e degli obiettivi dello studio16.
Il componente relativo alla risoluzione dei problemi di questo flusso di lavoro si concentra sui comuni problemi di interoperabilità che si verificano quando si passano gli output da un pacchetto al successivo. Piuttosto che fare affidamento su un singolo passaggio generico di conversione, il flusso di lavoro utilizza conversioni di formato personalizzate a ciascuna interfaccia software: i dati spaziali di conteggio vengono copiati in uno slot di saggio RNA standard prima dell'integrazione con Seurat; gli oggetti di riferimento Seurat e single-cell vengono convertiti in oggetti SingleCellExperiment per SPOTlight; le matrici di conteggio spaziali vengono riformattate per STdeconvolve; i conteggi, le coordinate e i metadati relativi ai tipi cellulari derivati da Seurat vengono convertiti in un oggetto Giotto per l'analisi della comunicazione cellula-cellula; e le annotazioni delle ROI da Select Spatial Spots vengono esportate come file CSV con CELL_ID, coordinate X/Y ed etichette di gruppo, in modo che possano essere ricollegate all'oggetto Seurat. Questi passaggi aiutano gli utenti a identificare e correggere problemi comuni come slot di saggio incompatibili, identificatori di spot non corrispondenti, colonne di metadati mancanti, formattazione errata delle coordinate e discrepanze nei simboli genici ligando-recettore.
Una caratteristica aggiuntiva di questo flusso di lavoro è l'uso di due strategie complementari di deconvoluzione anziché il ricorso a un singolo algoritmo. SPOTlight utilizza riferimenti scRNA-seq preesistenti per la stima guidata da riferimento delle proporzioni dei tipi cellulari, mentre STdeconvolve consente la scoperta indipendente da riferimenti di argomenti trascrizionali latenti. Nel set di dati dimostrativo, gli argomenti identificati da STdeconvolve si allineavano con regioni definite istologicamente (Figura 5B), confermando l'interpretabilità biologica. Un confronto quantitativo diretto tra i due metodi non è stato effettuato in questo protocollo; gli utenti che desiderano confrontarli sui propri dati possono seguire il framework fornito nel passaggio 7.3.2 del protocollo. Inoltre, il protocollo favorisce usabilità e tracciabilità utilizzando script per le funzioni principali, offrendo al contempo un'interfaccia grafica (Seleziona punti spaziali) per un isolamento intuitivo delle aree di interesse.
Collegare Seurat e Giotto consente al flusso di lavoro di combinare la pre-elaborazione e l'integrazione basate su Seurat con le statistiche spaziali e l'analisi delle reti basate su Giotto. Seurat fornisce un ambiente consolidato per ricercatori con esperienza in scRNA-seq e supporta l'integrazione di dati multi-campione, mentre il trasferimento dei dati armonizzati in Giotto permette la costruzione di reti spaziali e l'analisi ligando-recettore. Questa progettazione consente agli utenti di sfruttare i punti di forza documentati di entrambe le piattaforme senza implicare che siano stati confrontati qui con Squidpy o altri framework. Per la comunicazione tra cellule, è stata utilizzata l'inferenza ligando-recettore basata sulla rete di Delaunay di Giotto poiché incorpora l'adiacenza spaziale all'interno dello stesso ambiente analitico; framework come CellChat offrono ampie basi di dati sui segnali, ma non vengono valutati nel presente protocollo17.
Devono essere considerati diversi limiti. L'approccio di deconvoluzione basato su riferimenti dipende fortemente dalla disponibilità di riferimenti singola-cellula di alta qualità e abbinati. Inoltre, le assunzioni fondamentali alla base dell'analisi della comunicazione tra cellule si basano sulla co-espressione trascrizionale come indicatore di interazione fisica tra proteine, richiedendo una successiva validazione sperimentale. Infine, questo flusso di lavoro è stato sviluppato principalmente per dataset Visium standard. Con il progresso del settore verso tecnologie con risoluzione quasi singola-cellula, come Visium HD, le considerazioni analitiche cambieranno; dati con risoluzione più elevata potrebbero richiedere parametri di pre-elaborazione diversi e ridurre la necessità assoluta della deconvoluzione dei punti. Per adattare questo flusso di lavoro a dataset Visium HD, i bin ad alta risoluzione possono essere aggregati computazionalmente in bin spaziali più grandi, oppure i moduli di deconvoluzione dei punti possono essere ignorati a favore di una segmentazione cellulare basata su immagini18.
Queste caratteristiche suggeriscono un'ampia applicabilità in diversi ambiti biologici, tra cui la biologia dello sviluppo, le neuroscienze, la ricerca sul cancro e l'immunologia19,20,21,22. Il design modulare consente ai ricercatori di adattare specifici componenti alle proprie esigenze, sia che si concentrino sull'identificazione di domini spaziali, sulla comunicazione cellulare o sulla specializzazione regionale. Con il progressivo sviluppo delle tecnologie spaziali e l'espansione dei set di dati, questo protocollo fornisce una base che può essere estesa per integrare nuovi metodi analitici e affrontare domande biologiche emergenti.

La trasmissione spaziale del trascrittoma (ST) è una famiglia rivoluzionaria di tecnologie che misura l'espressione genica su scala genomica mantenendo le coordinate spaziali delle molecole di RNA messaggero (mRNA) all'interno di sezioni di tessuto. I metodi ST comprendono approcci basati sul sequenziamento che utilizzano matrici con codici a barre posizionali e approcci di imaging in situ che mappano i segnali trascrizionali all'interno di microambienti tissutali integri1,2. Preservando il contesto spaziale, la ST consente l'analisi dell'architettura tissutale, dell'organizzazione delle vicinanze cellulari, della comunicazione tra cellule e dei processi biologici associati al microambiente che non possono essere completamente risolti dopo la dissociazione del tessuto3.
La rapida crescita dei repository pubblici di dati ST ha creato opportunità senza precedenti per l'analisi secondaria e lo sviluppo di metodi3. Risorse come il database CROST curano centinaia di dataset trascrittomica risolta spazialmente provenienti da diverse specie e piattaforme tecnologiche, mentre collezioni specializzate come STOmicsDB si concentrano su metodologie specifiche quali Stereo-seq4,5. Nonostante l'abbondanza di dati, l'analisi computazionale rimane complessa a causa della struttura complessa dei dati spaziali, della diversità degli strumenti analitici e degli ostacoli tecnici nell'implementare flussi di lavoro riproducibili6,7,8,9,10,11.
Per affrontare i limiti derivanti dall'uso di un singolo ambiente software, viene qui presentato un flusso di lavoro computazionale integrato che sfrutta strumenti analitici complementari. Gli ecosistemi esistenti per l'analisi di dati ST comprendono principalmente Seurat, Giotto e framework basati su Python come Squidpy6,7,12. Sebbene strumenti basati su Python come Squidpy offrano funzionalità estese per l'analisi di grafi spaziali, consolidare la principale pipeline computazionale all'interno di un unico ambiente linguistico riduce gli ostacoli tecnici legati all'interoperabilità tra linguaggi. Di conseguenza, la pipeline principale è implementata principalmente in R per minimizzare tali difficoltà tecniche. All'interno di questo flusso di lavoro basato su R, Seurat viene utilizzato per il caricamento dei dati, il controllo di qualità, la normalizzazione, la riduzione della dimensionalità, la visualizzazione e l'integrazione di campioni multipli, riflettendo il suo uso comune nei flussi di lavoro di trascrittomica singola-cellula e spaziale. Successivamente, Giotto viene impiegato per la costruzione di reti spaziali e per l'analisi della comunicazione cellulare basata su ligandi-recettori. Pertanto, questa pipeline collega la pre-elaborazione e l'integrazione basate su Seurat con l'analisi spaziale basata su Giotto, mantenendo esplicito e riproducibile il trasferimento dei dati tra i due insiemi di strumenti.
All'interno di questo framework, vengono implementate due strategie complementari di deconvoluzione: SPOTlight, un metodo guidato da riferimento che utilizza dati di scRNA-seq per stimare le proporzioni dei tipi cellulari, e STdeconvolve, un metodo di modellazione argomentale non supervisionato che identifica modelli trascrizionali latenti8,11. Gli output forniscono visioni complementari dell'eterogeneità cellulare spaziale, ma non sono considerati una validazione incrociata quantitativa a meno che gli utenti non eseguano l'analisi di concordanza facoltativa descritta nel protocollo. Un'applicazione Python Dash personalizzata, Select Spatial Spots, è integrata per l'annotazione interattiva di regioni di interesse (ROI) ed esporta file di annotazione standard basati su coordinate che possono essere utilizzati in analisi successive.
Per quanto riguarda l'applicabilità pratica, questo flusso di lavoro è concepito principalmente per dati ST basati su array standard (ad esempio, Visium con risoluzione di 55 µm) e potrebbe essere adattato ad altri tipi di tessuto dopo una valutazione dei parametri. Prima dell'analisi, è necessario considerare alcune limitazioni fondamentali. In primo luogo, il modulo di deconvoluzione guidata da riferimento richiede un riferimento scRNA-seq di alta qualità e corrispondente al tessuto in esame. In secondo luogo, piattaforme subcellulari o quasi monocellulari potrebbero richiedere una pre-elaborazione modificata, un'aggregazione spaziale dei bin o una segmentazione cellulare basata su immagini prima dell'integrazione2. Il dataset rappresentativo del colon di topo viene utilizzato come caso dimostrativo per mostrare come il flusso di lavoro possa valutare domini spaziali e l'organizzazione tissutale definita da marcatori, piuttosto che come prova di compatibilità universale della piattaforma.

<table><tbody><tr><td>ggplot2</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v4.0.0(CRAN)</td><td>Visualizzazione avanzata dei dati</td></tr><tr><td>Giotto</td><td>Dries Lab</td><td>v4.2.2 (GitHub)</td><td>Analisi di reti spaziali e comunicazione tra cellule</td></tr><tr><td>patchwork&amp;nbsp;</td><td>Thomas Lin Pedersen</td><td>v1.3.2 (CRAN)</td><td>Composizione e disposizione dei grafici</td></tr><tr><td>R software&amp;nbsp;</td><td>Fondazione R per il Calcolo Statistico</td><td>v4.4.3</td><td>Ambiente principale di esecuzione (macOS aarch64)</td></tr><tr><td>scater</td><td>Davis McCarthy et al.</td><td>v1.34.1 (Bioconductor)</td><td>Controllo qualità e visualizzazione a singola cellula</td></tr><tr><td>scran</td><td>Aaron Lun et al.</td><td>v1.34.0 (Bioconductor)</td><td>Modellazione della varianza a singola cellula e rilevamento di marcatori</td></tr><tr><td>Select Spatial Spots (Strumento Python personalizzato)</td><td>LeafLight</td><td>v1.0.0 (GitHub)</td><td>Selezione interattiva di regioni di interesse spaziali (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)</td></tr><tr><td>Seurat&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.3.0 (CRAN)</td><td>Pre-elaborazione, integrazione e raggruppamento dei dati spaziali</td></tr><tr><td>SeuratObject&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.2.0 (CRAN)</td><td>Strutture dati per dati a singola cellula e spaziali</td></tr><tr><td>SingleCellExperiment</td><td>Squadra principale di Bioconductor</td><td>v1.28.1 (Bioconductor)</td><td>Contenitore standardizzato per dati scRNA-seq</td></tr><tr><td>SPOTlight</td><td>Marc Elosua-Bayes et al.</td><td>v1.10.0 (Bioconductor)</td><td>Deconvoluzione spaziale guidata da riferimento</td></tr><tr><td>Stdeconvolve</td><td>Jean Fan Lab</td><td>v1.3.2 (Bioconductor)</td><td>Modellazione non supervisionata di argomenti latenti</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v2.0.0 (CRAN)</td><td>Pacchetto principale per manipolazione e formattazione dei dati</td></tr></tbody></table>

un flusso di lavoro pratico per l'analisi dei dati di transcriptomica spaziale: dall'acquisizione dei dati alle analisi avanzate

A Practical Workflow for Spatial Transcriptomics Data Analysis: From Data Acquisition to Advanced Analyses

La trascrittomica spaziale (ST) analizza l'espressione genica su scala genomica preservando il contesto spaziale bidimensionale delle molecole di mRNA all'interno di sezioni di tessuto, consentendo studi sull'architettura tissutale e sulla biologia associata al microambiente. Tuttavia, l'analisi della ST rimane complessa poiché l'importazione dei dati, il controllo di qualità, l'integrazione, la deconvoluzione, le statistiche spaziali e la visualizzazione richiedono spesso ambienti software multipli e scelte di parametri riproducibili. Questo protocollo presenta un flusso di lavoro computazionale pratico per dataset pubblici di ST in R, partendo dall'acquisizione dei dati e dalla configurazione del software, per proseguire con il caricamento dei dati basato su Seurat, controllo di qualità, normalizzazione, integrazione multiplo, clustering e analisi dei geni variabili nello spazio. Il flusso di lavoro applica quindi strategie complementari di deconvoluzione, inclusa l'analisi SPOTlight guidata da riferimento e la modellizzazione a topic non supervisionata STdeconvolve, seguita dall'analisi della comunicazione cellulare spaziale basata su Giotto e dalla selezione interattiva di regioni di interesse (ROI) mediante un'applicazione personalizzata in Python Dash. Sottolineando l'esecuzione basata su script, le giustificazioni esplicite dei parametri, gli output attesi e i punti di controllo per la risoluzione dei problemi, il protocollo fornisce un quadro adattabile per dataset di ST basati su array standard e piattaforme correlate, dopo una valutazione dei parametri specifici per dataset e piattaforma.

Implementazione del flusso di lavoro e integrazione dei dati illustrano le caratteristiche principali dei tessuti
Il flusso di lavoro computazionale è stato applicato ai dati di trascrittomica spaziale del colon del topo per illustrare gli output attesi in ciascuna fase analitica. Come mostrato nello schema del flusso di lavoro (Figura 1), la procedura è iniziata con l'acquisizione dei dati e il controllo di qualità, in cui i grafici delle caratteristiche spaziali hanno delineato i confini del tessuto (Figura 2A,B). Successivamente, è stato utilizzato il flusso di lavoro di integrazione basato su ancoraggi di Seurat per ridurre gli effetti tecnici di lotto preservando al contempo la variabilità biologica interpretabile. Le visualizzazioni UMAP hanno mostrato l'allineamento dei campioni e i modelli di raggruppamento spaziale dopo l'integrazione (Figura 2C,D). È stata implementata una selezione quantitativa e dinamica dei componenti principali (PC) basata sulla varianza cumulativa per guidare la riduzione dimensionale e il raggruppamento successivo (vedi Figura supplementare 1). L'analisi della mappa termica dei geni marcatore ha rivelato profili trascrizionali distinti alla base dei cluster spaziali (Figura 2E).
Per valutare se gli aggregati computazionali fossero coerenti con l'architettura anatomica nota dell'istologia del colon, sono stati analizzati i profili di espressione dei geni marcatore specifici per strato. Lo strato dell'epitelio mucosale ha mostrato espressione di marcatori delle cellule epiteliali, tra cui Epcam e Krt8, insieme al marcatore delle cellule caliciformi Muc2. Marcatori mesenchimali e stromali come Col1a1 e Vim hanno identificato la lamina propria e le regioni sottomucose, mentre lo strato esterno della muscolaris propria è stato indicato da geni strutturali delle cellule muscolari lisce come Acta2 e Tagln. La localizzazione spaziale di questi marcatori associati alla linea cellulare supporta l'interpretazione secondo cui il flusso di lavoro di integrazione e raggruppamento ha preservato le principali stratificazioni istologiche del tessuto colico lungo l'asse dalla mucosa alla muscolaris (vedi Supplementary Figure 2).
Dopo la convalida dei cluster, è stata eseguita un'analisi differenziale dell'espressione per identificare i geni differenzialmente espressi (DEG) tra le condizioni sperimentali (Figura 2F,G). Inoltre, i geni con variabilità spaziale sono stati identificati mediante la statistica di Moran's I, mettendo in evidenza i geni con una distribuzione spaziale significativamente non casuale nel tessuto (Figura 2H).
La deconvoluzione cellulare e le reti di interazione spaziale rivelano la microorganizzazione del tessuto
L'elaborazione dei dati di riferimento dell'RNA-seq a singola cellula ha prodotto annotazioni supportate dal filtraggio di controllo qualità (Figura 3A), dal clustering non supervisionato (Figura 3B), dalla validazione dei geni marcatore (Figura 3C) e dalla concordanza con annotazioni indipendenti (Figura 3D). La composizione cellulare (Figura 3E) ha guidato la strategia di sottocampionamento per la deconvoluzione. SPOTlight ha stimato le proporzioni dei tipi cellulari guidate dal riferimento attraverso i punti spaziali (Figura 4A,B), mentre STdeconvolve ha fornito una visione basata su modellazione per argomenti non supervisionata dei modelli cellulari spaziali (Figura 5B). Lo strumento personalizzato Select Spatial Spots ha fornito il contesto istologico per questi modelli (Figura 5A). Infine, utilizzando le assegnazioni dei tipi cellulari deconvolute, l'analisi della comunicazione spaziale ha identificato interazioni ligando-recettore tra gruppi di tipi cellulari prossimi nello spazio (Figura 6A,B).
Osservazioni per la risoluzione dei problemi derivanti dall'ottimizzazione del protocollo
Durante l'ottimizzazione del protocollo, sono stati identificati diversi problemi che hanno suggerito punti di controllo pratici. Risultati di deconvoluzione subottimali si sono verificati quando i riferimenti monocellulari non corrispondevano adeguatamente al contesto del tessuto, indicando la necessità di utilizzare dati di sequenziamento dell'RNA monocellulare (scRNA-seq) corrispondenti al tessuto e alla specie, quando disponibili. I primi tentativi di clustering con parametri predefiniti non hanno sempre risolto le strutture biologiche attese; l'analisi della selezione delle componenti principali (PC), della risoluzione del clustering e della coerenza dei geni marcatore ha aiutato a identificare domini interpretabili spazialmente, allineati con l'anatomia del tessuto. Queste osservazioni forniscono esempi pratici di come gli utenti possano diagnosticare problemi analitici comuni durante l'esecuzione del flusso di lavoro.
<img alt="Diagramma del flusso di lavoro per l&#x27;analisi dei dati scRNA-seq. Processi: normalizzazione, integrazione, raggruppamento." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Flusso di lavoro per l'analisi integrata della trascrittomica spaziale. Rappresentazione schematica della pipeline analitica, dall'acquisizione e pre-elaborazione dei dati fino alle analisi spaziali avanzate. I passaggi chiave includono: (1) Caricamento dei dati, controllo di qualità e integrazione multiplo campione mediante Seurat; (2) Raggruppamento spaziale e rilevamento di geni variabili nello spazio; (3) Deconvoluzione dei tipi cellulari tramite metodi basati su riferimento (SPOTlight) e non supervisionati (STdeconvolve); (4) analisi della comunicazione spaziale tra cellula e cellula con Giotto e selezione interattiva di regioni di interesse mediante un tool personalizzato, Selezionare punti spazialiI risultati di tutti i moduli vengono sintetizzati per ricavare informazioni biologiche sull'architettura tissutale e sul microambiente cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Analisi di trascrittomica spaziale con grafici a violino, raggruppamento t-SNE, grafico a vulcano e dati di mappa termica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Integrazione dei dati, raggruppamento e analisi dell'espressione differenziale. (A,B) Metriche di controllo qualità per i campioni spaziali A1 e B1, che mostrano le distribuzioni dei conteggi genici, dei conteggi UMI e delle percentuali di geni mitocondriali. (C) Visualizzazione UMAP dei dati integrati di trascrittomica spaziale, colorati in base all'origine del campione (a sinistra) e all'identità del raggruppamento (a destra). (D) Proiezione spaziale delle identità dei cluster sulle sezioni di tessuto. (E) Mappa termica dei principali geni marcatore per ciascun cluster spaziale. (F) Grafico a vulcano che mostra i geni differenzialmente espressi tra le condizioni A1_colon_d0 e B1_colon_d14. (G) Pattern di espressione spaziale di geni rappresentativi differenzialmente espressi attraverso le sezioni di tessuto. (H) Mappe di espressione spaziale dei principali geni variabili spazialmente identificati via la statistica di Moran's I, con i due pannelli a sinistra che mostrano geni del campione A1_colon_d0 e i due pannelli a destra che mostrano geni del campione B1_colon_d14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig2large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="analisi di scRNA-seq: grafici a violino, cluster UMAP, punteggi dei tipi cellulari e distribuzione a barre." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Elaborazione e annotazione dei dati di riferimento a singola cellula. (A) Metriche di controllo qualità per i dati di riferimento di scRNA-seq prima e dopo il filtraggio. (B) Visualizzazione UMAP dei dati di scRNA-seq colorata in base ai cluster non supervisionati. (C) Grafico a punti che mostra i punteggi di espressione dei geni marcatore canonici dei tipi cellulari nei diversi cluster. (D) Visualizzazione UMAP annotata dei dati di scRNA-seq con i principali tipi cellulari etichettati. (E) Composizione cellulare del set di dati di riferimento di scRNA-seq. La linea rossa tratteggiata indica la soglia di sottocampionamento (n = 50 cellule per tipo) applicata durante la deconvoluzione SPOTlight per bilanciare efficienza computazionale e rappresentatività dei tipi cellulari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig3large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Distribuzione dei tipi cellulari, immagini al microscopio; analisi di cellule B, endoteliali e fibroblasti nei tessuti." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Deconvoluzione spaziale dell'eterogeneità cellulare. (A,B) Grafici a dispersione spaziali a torta ottenuti mediante deconvoluzione con SPOTlight, che mostrano la composizione proporzionale dei principali tipi cellulari in ciascun punto per i campioni A1 (A) e B1 (B). (C) Distribuzione spaziale rappresentativa delle cellule B nei campioni A1 (sinistra) e B1 (destra), che illustra i modelli di localizzazione risolti spazialmente di una specifica popolazione di cellule immunitarie identificata tramite deconvoluzione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig4large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Analisi dell'espressione genica spaziale, diagramma che mostra i tipi cellulari e i gruppi di pixel nella sezione di tessuto." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Analisi interattiva delle regioni di interesse e confronto della deconvoluzione non supervisionata. (A) Interfaccia dello strumento personalizzato "Seleziona punti spaziali" che mostra la selezione interattiva di regioni corrispondenti al colon prossimale, colon distale e altri domini del tessuto. (B) Visualizzazione spaziale a grafico a torta (scatterpie) dei risultati della deconvoluzione non supervisionata (STdeconvolve) per il campione A1, con i punti colorati in base alle regioni annotate manualmente in (A), che illustra la corrispondenza tra annotazione basata sull'istologia e distribuzioni computazionali dei topic cellulari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig5large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Grafico di comunicazione cellula-cellula con interazioni ligando-recettore e valori log2fc; diagramma a bolle." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6: Reti spazialmente informate di comunicazione cellula-cellula. (A,B) Reti di interazione ligando-recettore inferite da Giotto per i campioni A1 (A) e B1 (B). I nodi rappresentano i tipi cellulari, gli archi rappresentano coppie significative di ligando-recettore (FDR &lt; 0,05) e lo spessore degli archi corrisponde all'intensità dell'interazione. Per garantire confrontabilità e chiarezza visiva, è stata applicata una soglia di significatività uniforme (FDR &lt; 0,05) su tutti i campioni, e vengono mostrate le prime 20 interazioni ordinate per log2FC per ciascuna condizione. Le reti evidenziano schemi di comunicazione specifici per tipo cellulare nel contesto spaziale del tessuto del colon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig6large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Valutazione quantitativa dell'ottimizzazione dei parametri per la riduzione della dimensionalità. Il grafico del gomito illustra l'approccio automatizzato del flusso di lavoro per selezionare dinamicamente il numero ottimale di componenti principali (PC). La selezione viene calcolata in base alle soglie di deviazione standard cumulativa e di varianza marginale, rappresentate dalla linea verticale rossa, al fine di catturare la varianza biologica riducendo al contempo il rumore tecnico prima del raggruppamento successivo.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS1.tif" target="_blank">Cliccare qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 2: Convalida del raggruppamento spaziale mediante marcatori specifici dei layer canonici del colon. (A) Diagramma a punti che mostra l'espressione arricchita di marcatori epiteliali, stromali e del muscolo liscio nei diversi cluster computazionali. (B) Rappresentazioni spaziali di caratteristiche relative a marcatori rappresentativi (Epcam, Col1a1, Acta2) riportati alle coordinate del tessuto.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS2.tif" target="_blank">Cliccare qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro riproducibile per l'analisi di dati di transcriptomica spaziale, guidando l'utente dall'acquisizione di dati pubblici e dal controllo di qualità basato su Seurat, attraverso integrazione, rilevamento di caratteristiche spaziali, deconvoluzione del tipo cellulare, annotazione di regioni di interesse e analisi della comunicazione cellula-cellula, con punti di controllo pratici che supportano un'esecuzione trasparente.

Un flusso di lavoro pratico per l'analisi dei dati di transcriptomica spaziale: dall'acquisizione dei dati alle analisi avanzate

La trascrittomica spaziale (ST) profila l'espressione genica su scala genomica preservando il contesto spaziale bidimensionale delle molecole di mRNA all'interno del tessuto...

Ciao a tutti. In questo video, illustreremo una pipeline pratica per l'analisi di dati di transcriptomica spaziale, partendo dall'acquisizione e dal caricamento dei dati, passando per un'analisi di base, fino ad arrivare all'analisi avanzata. Nel complesso, il flusso di lavoro comprende tre passaggi principali.Prima, scaricare i dati; secondo, ottenere il codice di analisi; terzo, eseguire la pipeline per generare i risultati. Passo uno, acquisizione dei dati e preparazione della struttura delle directory. Per prima cosa, ottenere set di dati pubblici di trascrittomica spaziale.Scaricare l'archivio dei dati grezzi ed estrarre l'archivio. Organizzare i file in una struttura di directory standardizzata.Per prima cosa, creare una directory principale per i dati, quindi creare una sottodirectory dedicata per ciascun campione. Trasferire i seguenti file essenziali per ciascun campione nella rispettiva sottodirectory. Successivamente, creare una sottocartella spaziale all'interno della directory di ogni campione.Collocare i seguenti file nella sottocartella spatial. Inserire il file S1 delle metriche PC delle caratteristiche filtrate nella sottodirectory principale del campione. Decomprimere i file gzip nella cartella spatial.Assicurarsi che i nomi originali dei file rimangano esattamente come richiesti dalla funzione di caricamento 10X spatial. Secondo passaggio, configurazione dell'ambiente software. In questo caso si omette l'installazione del linguaggio R e il flusso di dati inizia ottenendo lo script di analisi nel repository GitHub.Installare i pacchetti R richiesti da Graham nel file conductor eseguendo lo script setup R. Installare auto suit eseguendo i comandi di installazione forniti nel foglio del documento ufficiale. Accedere all'URL ufficiale di installazione per recuperare gli script di configurazione. Inizializzare l'ambiente Python richiesto e le dipendenze di sistema secondo le istruzioni riportate nella pagina di configurazione.Acquisire lo strumento personalizzato accedendo al repository GitHub e scaricare il codice sorgente. Accedere alla directory TOS e installare le dipendenze Python. Passo tre: caricamento dei dati spaziali e controllo di qualità.Leggere i dati spaziali in un oggetto Seurat. Utilizzare la funzione di lettura dell'immagine 10X per caricare manualmente l'immagine tissutale ad alta risoluzione. Specificare lì l'immagine e il nome dell'immagine.Utilizzare il carico 10X spatial con il parametro immagine impostato sull'oggetto immagine creato nel passaggio precedente e creare l'oggetto Seurat. Calcolare le metriche di controllo qualità. Calcolare la percentuale di letture mitocondriali utilizzando l'insieme di funzionalità percentuale con il modello mt.Visualizzare e interpretare i dati in base alle metriche di controllo qualità (QC). Generare grafici a violino di nCount_Spatial, nFeature_Spatial e percent. mt utilizzando la funzione per grafici a violino.Crea grafici delle caratteristiche spaziali di queste metriche utilizzando grafici delle caratteristiche spaziali. E identifica i punti al di fuori dell'area del tessuto. Facoltativo: applica filtri per rimuovere i punti di bassa qualità.Dopo l'esecuzione dello script, è possibile ottenere questi risultati, inclusi i parametri di controllo qualità (QC) e il grafico spaziale delle caratteristiche. Passaggio quattro: pre-elaborazione dei dati, integrazione e raggruppamento. Normalizzare durante la pre-elaborazione dei singoli campioni.Applicare una normalizzazione SC transform separatamente a ciascun campione con il test Spatial. Integrare più campioni. Preparare l'elenco degli oggetti normalizzati con SCTransform per l'integrazione.Assicurarsi che ogni oggetto disponga di un saggio RNA copiando il saggio spaziale. Utilizzare le funzionalità di integrazione selezionate nell'integrazione PREP SCT per identificare le caratteristiche variabili condivise. Individuare gli ancoraggi di integrazione mediante la funzione trova ancoraggi di integrazione con il metodo di normalizzazione SCT.Integrare i dati utilizzando IntegrateData. Eseguire la riduzione della dimensionalità nel clustering sul saggio integrato. Eseguire l'analisi PCA sui dati integrati utilizzando runPCA.Determinare il numero ottimale di componenti principali per l'analisi successiva calcolando la varianza cumulativa spiegata. Identificare il punto del gomito mediante analisi del programma. Eseguire UMap utilizzando il numero determinato di CP.Raggruppare le cellule utilizzando FindNeighbors e FindClusters. Specificare i PC determinati nell'impostazione di risoluzione 0,5. Eseguire l'analisi di espressione differenziale tra i gruppi di interesse utilizzando la funzione FindWorkers.Identificare i geni variabili nello spazio. Per ogni campione originale, eseguire la ricerca di caratteristiche variabili nello spazio utilizzando il metodo di Moran's I sull'assay SCT per calcolare l'autocorrezione spaziale. Dopo aver eseguito questo script, è possibile ottenere il grafico del gomito, il grafico UMap, il grafico dei cluster, la mappa termica dei marcatori dei cluster, il diagramma a volano, i geni differenzialmente espressi per caratteristica spaziale, i geni spazialmente affidabili e i marcatori dei livelli del colon.E il grafico a punti dei marcatori del colon, insieme ai marcatori nel grafico delle caratteristiche spaziali. Passo cinque, pre-elaborazione dei dati di riferimento a singola cellula. Leggere la matrice di conteggio dell'RNA-seq a singola cellula utilizzando read 10X e creare un oggetto Seurat.Eseguire la normalizzazione QC standard e la rimozione dei cluster. Calcolare la percentuale di letture mitocondriali nelle cellule filtrate. Normalizzare i dati utilizzando la trasformazione SC.Impostare una vara.to. per eseguire una regressione della percentuale.mt. Eseguire PCA e UMap e raggruppare le cellule utilizzando il metodo di selezione dinamica dei PC descritto nei passaggi precedenti, quindi annotare i tipi cellulari.Calcola i punteggi dei moduli per i geni marcatore dei tipi cellulari canonici utilizzando AddModuleScore. Annota i cluster in base ai punteggi dei moduli e alla biologia nota. In alternativa, importa annotazioni pre-calcolate dai metadati.Dopo aver appreso questo script, è possibile ottenere le metriche di controllo qualità. Sono stati caricati l'UMap per cluster, l'UMap per campione e i punteggi dei tipi cellulari. Passo sei: deconvoluzione guidata da riferimento con SPOTlight.Preparare innanzitutto i dati per SPOTlight. Convertire l'oggetto Seurat di singola cellula annotato e l'oggetto Seurat spaziale in un oggetto di esperimento di singola cellula. Effettuare la normalizzazione logaritmica dei dati di singola cellula utilizzando LogMoreCounts.Eseguire quindi la deconvoluzione SPOTlight. Per prima cosa, identificare i geni ad alta variabilità nei dati single-cell utilizzando ModelGeneVar. Calcolare i marcatori dei tipi cellulari utilizzando score markers e filtrare i marcatori di alta qualità.Ridurre il numero di cellule di riferimento monocellulare per ogni tipo cellulare a una quantità gestibile al fine di diminuire il tempo computazionale. Eseguire la deconvoluzione utilizzando la funzione SPOTlight, fornendo il riferimento monocellulare, i dati spaziali, l'elenco dei marcatori e i geni altamente variabili (HVGs), quindi visualizzare ed esportare i risultati. È possibile ottenere il risultato della deconvoluzione in questo modo, mostrato come un diagramma a dispersione.Passaggio sette, deconvoluzione non supervisionata con Stdeconvolve. Per prima cosa, preparare i dati spaziali. Estrarre le metriche del conteggio delle righe dall'oggetto spaziale Seurat utilizzando GetAssayData con lo slot counts.Rimuovere i punti e i geni di bassa qualità utilizzando i conteggi puliti di STdeconvolve. Identificare i tipi cellulari latenti per i filtri che comprendono quattro geni espressi in una frazione minima di punti, utilizzando LDA rigoroso limitato mediante raggiungimento di tale modello di allocazione su un intervallo di numeri di argomenti potenziali tramite fitLDA. Selezionare il modello ottimale in base alla complessità minima utilizzando il modello ottimale con opt min.Analizzare e visualizzare i risultati. Estrarre la proporzione di sierotipo, Theta, e i profili genici Beta per il modello ottimale utilizzando getBetaTheta. Per aggiungere l'interpretazione biologica degli argomenti di corrosione, importare le annotazioni delle regioni di interesse generate dallo strumento di selezione delle posizioni spaziali.Utilizzare queste annotazioni come parametro del gruppo nella funzione con tutti gli argomenti. Al progetto, riportare le proporzioni dei tipi cellulari deconvolute sulle coordinate spaziali e codificare a colori i punti in base alla loro area di interesse (ROI). Dopo aver eseguito lo script, si otterrà un risultato di questo tipo, un carico di tubo su scala, simile a quelli prodotti da SPOTlight.Passaggio otto, comunicazione spaziale tra cellule utilizzando Giotto. In primo luogo, convertire l'oggetto Seurat in un oggetto Giotto. Utilizzare la funzione createGiottoObject, fornendo le metriche a basso conteggio e le coordinate spaziali.Preelaborare l'oggetto Giotto e aggiungere il risultato della deconvoluzione. Normalizzare i dati utilizzando Giotto normalizzato, aggiungendoli come annotazioni di sierotipo. Scegliere i metadati cellulari utilizzando addCellmetadata.Crea una rete spaziale utilizzando createSpatialNetwork. Carica un database di recettori ligandi nel nostro ambiente. Esegui explore CellCellcom per identificare interazioni significative tra ligandi e recettori tra tipi cellulari che sono in prossimità spaziale.È possibile ottenere il grafico a punti della comunicazione tra cellule in questo modo. Il passaggio nove è facoltativo. Selezione interattiva dei punti con SelectSpatialSpot.Preparare i dati per lo strumento interattivo utilizzando lo script six. Estrarre le coordinate spaziali dall'oggetto Seurat utilizzando GetTissueCoordinates. Formattare ed esportare i dati.Esportare il frame di dati formativo in un file CSV. Quindi eseguire l'analisi della regione di interesse. Avviare il personalizzato.Selezionare le applicazioni punti spaziali e caricare il file CSV. Selezionare interattivamente i punti in base alla posizione spaziale. Quindi esportare l'elenco dei punti selezionati e del loro gruppo assegnato, etichettato come un nuovo file CSV.Controlliamo semplicemente cosa possiamo ottenere eseguendo lo script uno alla volta. Tutti i risultati vengono salvati nella cartella risultati suddivisa in cinque parti. E come potete vedere, possiamo ottenere le metriche di controllo qualità e dividerle.E puoi verificare il grafico delle caratteristiche spaziali qui. Inoltre, il processo di deconvoluzione è stato eseguito sia in modo supervisionato che non supervisionato. I risultati di SPOTlight sono qui.Come si può vedere, tutti i punti contengono l'informazione sulle proporzioni. Qui vengono inoltre generati i risultati della deconvoluzione non supervisionata ottenuti con STdeconvolve. E questo è il risultato dei cluster di Seurat per il punto nei dati spaziali.È inoltre possibile visualizzarli nel grafico spaziale dei team, come questo. Inoltre, è possibile ottenere il risultato della comunicazione tra spot mediante Giotto. Questo intero flusso di lavoro è al 100% open source.Analisi di spotting dalle metriche di espressione alla modellizzazione spaziale avanzata. Tutti i passaggi vengono eseguiti su una macchina con 16 GB di RAM. La base del codice è modulare, un singolo script per ogni attività.Si noti che questa pipeline non copre l'elaborazione preliminare a partire dal prezzo FASTQ. L'attenzione è focalizzata sui dati spaziali 2D e attualmente include soltanto i downloader di Visium. È tutto, grazie per aver guardato.

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