Sviluppo di nanovescicole mesenchimali avvolte nella membrana delle cellule staminali per un migliorato apporto genico

In questo protocollo, introduciamo un metodo per preparare nanovescicole derivate da cellule staminali mesenchimatici, che assomigliano a vescicole extracellulari e incapsulano gli AAV per migliorare la somministrazione genica. Chiamiamo queste nanovescicole contenenti AAV CME-AAV. Rispetto al vettore emergente di somministrazione genica EV-AAV, I CME-AAV offrono maggiore flessibilità nelle fonti cellulari e una resa più elevata.

Per cominciare, rimuovere il mezzo da una piastra di coltura contenente cellule staminali mesenchimali umane con una confluenza del 70-90%. Utilizzando un raschiettore per cellule, stacca le cellule dalla ciotola di coltura e trasferiscile in un tubo conico contenente PBS. Centrifuga le cellule raccolte a 300g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per pelletare le cellule.

Poi, lava il pellet cellulare due volte con PBS e centrifuga di nuovo. Risospendere la pellet cellulare finale in PBS integrata con un cocktail di inibitori della proteasi. Successivamente, sottoporre la sospensione cellulare a tre cicli di congelamento-disgelo per disturbare la membrana plasmatica e generare un lisato grezzo.

Usando una pipetta, omogeneizzare accuratamente il lisseto. Poi, centrifugare a 1.000g per 20 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Trasferisci il soprandanante in un nuovo tubo.

Centrifugare a 18.000g per un'ora a quattro gradi Celsius per pelletare la frazione di membrana. Scartare il soprantantante e risospendere la pellet di membrana in PBS per ottenere la frazione grezza della membrana delle cellule staminali mesenchimate. Ora, omogeneizzare la sospensione a membrana passandola sequenzialmente attraverso siringhe dotate di aghi calibro 20-27.

Determinare la concentrazione proteica della sospensione omogeneizzata tramite un saggio con acido bicinconinico. Ali quota la sospensione e conserva a meno 80 gradi Celsius fino a quando non serve. Riomogeneizzare la sospensione usando una siringa calibro 27 dopo ogni ciclo di scongelamento.

Mescola la sospensione di membrana preparata con virus adenoassociato, o AAV, in un rapporto di 150 microgrammi di proteina per uno per 10 e la potenza di 10 copie genomiche. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti con una lieve agitazione. Carica la membrana e la miscela di virus in un mini estrusore dotato di una membrana in policarbonato da 400 nanometri.

Fai passare la miscela attraverso l'estrusore 20 volte per favorire l'incapsulamento. Sostituire la membrana da 400 nanometri con una da 200 nanometri e ripetere l'estrusione. Raccogli il virus incapsulato con sospensione di processo, insieme al virus non incapsulato e alle vescicole vuote.

Raccogli più lotto, se necessario, e procedi immediatamente alla purificazione. Diluire la soluzione di iodixanolo con 10 copie di PBS e acqua sterile deionizzata per preparare soluzioni al 40 e 25%. Usando una pipetta, aggiungi un millilitro di iodixanolo al 40% sul fondo di un tubo ultra-trasparente sottile aperto da 13,2 millilitri da 13,2 millilitri.

Poi, sovrappongi tre millilitri di iodixanolo al 25% sopra lo strato al 40% per formare un gradiente discontinuo. Sovrapponi delicatamente sette millilitri della sospensione lavorata sulla sommità del gradiente. Bilancia i tubi e caricali in un rotore oscillante di un'ultracentrifuga a secchio.

Centrifugare a 150.000g per tre ore a quattro gradi Celsius, usando accelerazione rapida e decelerazione lenta. Poi, rimuovi con attenzione i tubi senza disturbare il gradiente. Raccogli frazioni di un millilitro dall'alto verso il basso in tubi microcentrifughe da 1,5 millilitri etichettati.

Tieni tutte le frazioni sul ghiaccio. Ora, identificare e raccogliere le frazioni sette e otto contenenti CME-AAVV purificati in un nuovo tubo ultracentrifuga aperto. Riempi il volume a 11 millilitri con PBS.

Poi, mescola delicatamente con una pipetta da un millilitro. Utilizzando accelerazioni e decelerazioni rapide, centrifugare le frazioni accumulate a 150.000g per tre ore a quattro gradi Celsius. Scartate con attenzione il soprantantante.

Risospendere il pellet in 50-200 microlitri di PBS sterile, a seconda della concentrazione desiderata. Aliquot la preparazione purificata. Poi, conserva a 80 gradi Celsius fino a un nuovo utilizzo.

Prepara soluzioni operative di virus incapsulato e virus di controllo in PBS sterile. Aggiungere copie genomiche uguali del virus incapsulato o del virus di controllo direttamente al mezzo di coltura in ciascun pozzo. Includere pozzi di controllo negativi con un volume equivalente di PBS o particelle virali vuote.

Fai ruotare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme e incubare per 24-72 ore, a seconda del disegno sperimentale. Successivamente, aspira delicatamente il mezzo di coltura. Lava le cellule due volte con PBS senza spostarle.

Nuclei di colorazione con Hoechst 33342 secondo le istruzioni del produttore. Eseguire immagini di fluorescenza a cellule vive utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita con set di filtri appropriati per proteine fluorescenti verdi potenziate e Hoechst. Seleziona obiettivi 10x o 20x per la quantificazione e obiettivi 63x per immagini ad alta risoluzione, se necessario.

Acquisire almeno cinque campi visivi per pozzo, utilizzando parametri di imaging identici. Salva tutte le immagini in formato raw e in scala di grigi per l'analisi quantitativa. La microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato che le CME-AAV presentavano dimensioni e strutture legate alla membrana simili alle vescicole extracellulari.

I marcatori della membrana delle cellule staminali mesenchimatici, CD73 e CD90, sono stati rilevati nella CME-AAV tramite analisi Western blot. Le tre principali proteine della capside virale adeno-associata, VP1, VP2 e VP3, sono state identificate nella CME-AAV tramite SDS-PAGE. L'analisi NanoSight ha mostrato che CME-AAV9.

L'EGFP aveva un diametro medio di 128,6 nanometri e una concentrazione totale di particelle di 1,32 per 10 alla potenza di 10 particelle per millilitro. La microscopia a fluorescenza ha dimostrato che CME-AAV9. L'EGFP ha prodotto un livello nettamente più alto di espressione di proteine fluorescenti verdi nelle cellule HEK293T.

Il virus avvolto nella membrana ha raggiunto un'espressione genica circa 2,5 volte superiore, suggerendo una maggiore assorbimento cellulare e potenzialmente un miglioramento del traffico intracellulare. L'imaging bioluminescente in vivo ha mostrato che il fegato ha mostrato il segnale luminescente più forte dopo la somministrazione di CME-AAV. L'analisi quantitativa delle regioni epatiche ha rivelato che la somministrazione di CME-AAV ha portato a livelli di espressione genica significativamente più elevati.

Questi protocolli descrivono i passaggi per ottenere AAVA purificati avvolti nella membrana cellulare, o CME-AAV, tramite estrusione e ultracentrifugazione a gradiente di densità. Due fattori chiave richiedono un'attenta considerazione: preelaborazione dei frammenti cellulari per l'estrusione e ottimizzazione del rapporto di miscelazione frammenti di membrana/AAV per controllare il rapporto particella-genoma CME-AAV. Studi futuri potranno approfondire ulteriormente l'inclusione della membrana cellulare per migliorare la protezione immunitaria e le proprietà funzionali della superficie, ottimizzando la CME-AAV come piattaforma versatile per la somministrazione dell'AAV.