Cella singola elettroporazione in vivo all'interno del cervello intatto in via di sviluppo

L'elettroporazione di singole cellule è una tecnica specializzata che consente la somministrazione di DNA o altre macromolecole in singole cellule con un tessuto intatto, comprese le preparazioni in vivo se combinate con tecniche avanzate di imaging in vivo. L'elettroporazione di marcatori fluorescenti su singola cellula consente la visualizzazione diretta della morfologia cellulare, della crescita cellulare e degli eventi intercellulari su scale temporali che vanno da secondi a giorni. In questo video, abbiamo dettagliato la procedura per l'elettroporazione di una singola cellula di un colorante fluorescente o di DNA plasmatico in neuroni all'interno del cervello intatto del girino XUS e mostriamo esempi di imaging dal vivo di neuroni marcati in fluorescenza.

Oh, ciao. Mi chiamo Eth Haa e lavoro nel laboratorio del Dr.Kurt Haass nel Brain Research Center dell'Università della British Columbia. Oggi dimostrerò come eseguire l'elettroporazione mirata di neuroni a singola cellula all'interno del cervello intatto del girino albino XUS Lavis.

Il vantaggio distinto di questa tecnica è che le manipolazioni sperimentali possono essere eseguite su singole cellule lasciando inalterato il tessuto circostante, distinguendo così gli effetti autonomi delle cellule da quelli derivanti dai trattamenti globali. La prima fase prevede la fabbricazione di micropipette con diametro del puntale e angolo di conicità appropriati, seguita dal caricamento del materiale di trasferimento nella micropipetta. Quindi le piscine di TA devono essere anestetizzate e trasferite nella camera di azione, quindi inserite la micropipetta nel cervello e applicate una serie di impulsi di tensione.

Infine, i neuroni ati vengono visualizzati utilizzando la microscopia a due fotoni. Ti mostreranno questa tecnica nei girini. La singola cellula può essere utilizzata in altri sistemi modello e in preparazioni ex vivo.

Quindi, con questo in mente, iniziamo. L'elettroporazione a singola cellula si rivolge a una singola cellula mediante l'uso di un elettrodo per micropipette in vetro estratto che limita il campo elettrico a una singola cella a contatto con il puntale della pipetta. La geometria fisica del puntale della pipetta è una caratteristica critica che influisce direttamente sul successo della tecnica.

Un estrattore a saldare modello P 97 viene utilizzato per generare micro pipette in vetro silicato bo con un diametro esterno di 1,5 millimetri e un diametro interno di 0,75 millimetri contenenti un filamento interno per facilitare il riempimento del puntale senza bolle d'aria. I puntali per pipette che si sono rivelati più efficaci per l'elettroporazione a singola cellula sono quelli con un diametro del puntale compreso tra 0,5 e un micron e angoli di conicità superiori a 10 gradi. Dopo aver estratto una micropipetta di vetro, il materiale di trasferimento in soluzione può essere caricato nella pipetta mediante riempimento posteriore o utilizzando una siringa di caricamento.

Per questa dimostrazione, etichetteremo in fluorescenza singoli neuroni con un colorante fluorescente visto qui o con una codifica plasmidica. Le soluzioni proteiche fluorescenti verdi GFP devono essere centrifugate brevemente ad alta velocità per ridurre la quantità di detriti di particolato che entrano nella pipetta. Poiché ciò aumenterà le possibilità di intasamento della punta per i nuovi utenti, è consigliabile iniziare con coloranti fluorescenti poiché possono essere facilmente visti sotto epifluorescenza.

Ciò consente la visualizzazione del puntale all'interno del campione e fornisce un feedback diretto sul fatto che l'apparecchiatura sia stata configurata correttamente e se il puntale della pipetta sia appropriato. Ottimo lavoro. Ora che abbiamo preparato la micro pipetta, possiamo passare all'esecuzione della procedura per l'elettroporazione a singola cellula.

Le apparecchiature elettriche necessarie per questa tecnica sono uno stimolatore e un oscilloscopio e il portapipetta dotato di un filo d'argento da inserire nella pipetta. Qui stiamo usando il separatore d'ascia 800 A di uno strumento di assone, tuttavia possono essere utilizzati anche stimolatori comuni come un SD nine per erba. Il separatore d'ascia è collegato allo stadio di testa, che si interfaccia tra il separatore d'ascia e l'elettrodo a filo d'argento.

La massa esterna del girino è semplicemente un filo d'argento che rimane un contatto elettronico con il girino. Durante l'elettroporazione, lo stadio principale, il cavo di terra e la massa esterna del girino sono entrambi collegati all'ingresso dell'oscilloscopio. Una volta installata l'apparecchiatura elettrica, la pipetta può essere inserita nel portapipetta.

Il portapipetta deve essere montato su un micromanipolatore a tre assi che consenta un movimento preciso. L'elettroporazione a singola cellula richiede un microscopio con una buona distanza di lavoro. Poiché ciò offre più spazio di manovra e consente di portare la pipetta con un angolo di circa 30-45 gradi.

Una volta che l'apparecchiatura è stata collegata correttamente, possiamo iniziare con una procedura di elettroporazione a cella singola. I primi girini vengono anestetizzati mediante immersione in 0,02% MS 2, 2 2, i girini sono solitamente completamente anestetizzati. Dopo circa cinque minuti, un singolo girino viene trasferito nella camera di elettroporazione.

Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, la camera può essere facilmente realizzata internamente intagliando una cavità a forma di girino in un piccolo blocco di silicone e inserendo un filo di terra d'argento in modo che sia a contatto con la pelle del girino quando si trova nella camera. Successivamente, l'uso di un pennello per posizionare il girino si assicurerà che sia con il lato dorsale rivolto verso l'alto. La micropipetta viene quindi abbassata fino a quando non è a contatto con la pelle direttamente adiacente alla regione di interesse.

L'abbassamento continuo della pipetta inizialmente farà increspare la pelle e poi passerà attraverso il tessuto sottostante. Qui sto prendendo di mira il tum ottico del cervello del polo della marea. Sto mirando specificamente alla regione dello strato del corpo cellulare.

Se si utilizza un xi, è possibile monitorare la resistenza della pipetta nel tessuto. Generalmente, la resistenza è compresa tra 10 e circa 40. I mega ohm funzionano bene.

La resistenza della pipetta è un buon indicatore del diametro del puntale troppo piccolo o se il puntale è ostruito, nel qual caso la resistenza sarà elevata. D'altra parte, se il diametro del puntale è troppo grande o se il puntale è rotto, la resistenza della pipetta sarà bassa. Nonostante la resistenza assoluta, la pipetta non può essere misurata quando si utilizza uno stimolatore convenzionale.

La lettura dell'oscilloscopio è una misura indiretta della resistenza della pipetta per le matrici di destrano fluorescente. Lo stimolo consiste in un treno di 10 millisecondi di impulsi d'onda quadra positivi applicati a una frequenza di 300 hertz. I singoli impulsi hanno una durata di 300 microsecondi e vengono erogati a una tensione di 50 volt.

Utilizzando queste impostazioni, il colorante fluorescente viene espulso dalla punta, come si può vedere dopo l'applicazione di uno stimolo dopo l'elettrosonda. In un sito, la pipetta viene retratta e il processo viene ripetuto in diversi siti all'interno del tessuto per migliorare la resa. Durante l'erogazione di un treno di impulsi di tensione, è necessario monitorare l'ampiezza degli impulsi risultanti sull'oscilloscopio e regolare l'ampiezza tra uno e 1,5 microampere, se necessario.

Se l'ampiezza dell'impulso rimane bassa dopo un aumento sostanziale della tensione o scende durante il corso della procedura, ciò suggerisce fortemente che la punta è ostruita o che il diametro della punta è troppo piccolo. Questo può essere piuttosto frustrante quando succede. D'altra parte, se l'ampiezza è ancora elevata dopo aver ridotto sostanzialmente la tensione applicata o aumenta nel corso della procedura, ciò indica fortemente che la punta è troppo larga o che è rotta o che le punte si rompono.

Spesso divento molto emotivo e triste. Come accennato in precedenza, il vantaggio dell'utilizzo di coloranti fluorescenti è che si può verificare immediatamente se le singole cellule sono state elettroporate utilizzando i parametri di stimolo dati. Se le cellule appaiono molto deboli o nessuna cellula è etichettata, si dovrebbe iniziare aumentando gradualmente ogni parametro di stimolo in modo indipendente fino a quando le cellule etichettate sembrano essere etichettate in modo brillante in questo modo, vedere celle ben etichettate rende la mia giornata.

D'altra parte, se numerose cellule sembravano essere etichettate, si diminuivano gradualmente i parametri di stimolo fino a quando non sembrava che una singola cellula fosse etichettata in modo brillante come questa. Vedere le celle etichettate in modo brillante è davvero soddisfacente. Nel caso del DNA plasmidico, i treni di impulsi utilizzati sono impulsi negativi della durata di un millisecondo erogati a 300 hertz e la durata del treno è di 500 millisecondi.

Dopo l'elettroporazione, i pali TA vengono posti in una soluzione di allevamento fresca dove si riprendono rapidamente dall'anestesia. In genere, dopo aver elettro da 50 a un centinaio di poli TA, possiamo procedere alla loro screening, che vi mostrerò in seguito. Prima di iniziare gli esperimenti di imaging, è utile eseguire rapidamente lo screening degli elettrogirini utilizzando un microscopio a epifluorescenza verticale.

Al fine di determinare quali girini contengono neuroni adatti per l'imaging, i girini vengono anestetizzati e quindi posti in una camera per sigari e coperti i singoli girini vengono quindi rapidamente osservati sotto luce epi fluorescente per determinare se sono presenti singoli neuroni marcati in fluorescenza. Si noti che un'eccessiva esposizione alla luce fluorescente epi provocherà fototossicità che potrebbe uccidere la cellula etichettata. Pertanto, cerca di ridurre al minimo la quantità di tempo in cui le cellule sono esposte alla luce fluorescente.

Nel caso dei coloranti destrano, lo screening può avvenire già 30 minuti dopo l'elettroporazione. Tuttavia, troviamo che intervalli più lunghi sono associati a livelli di fluorescenza di fondo più bassi. Nel caso del plasmide, lo screening del DNA viene in genere eseguito almeno 12 ore dopo l'elettroporazione.

Usiamo abitualmente l'elettroporazione a singola cellula per marcare in modo fluorescente i neuroni all'interno del tectum ottico del girino. Il nostro microscopio a due fotoni è costruito su misura, a partire da un microscopio confocale Olympus FV 300 e da una sorgente di luce laser Chameleon XP. In genere utilizziamo una lunghezza d'onda di 910 nanometri per visualizzare la forza del pavimento verde.

Una volta trovato un girino con un singolo neurone AL etichettato e posizionato sul nostro impianto a due fotoni, procediamo a eseguire il time lapse per l'imaging dei fotoni dei neuroni tattili su diversi intervalli di tempo. Questo ci permette di osservare i modelli di crescita dinamica degli alberi dendritici delle cellule AL. Qui vediamo un esempio di un neurone che esprime GFP che è stato marcato utilizzando l'elettroporazione a singola cellula.

Questa immagine è stata catturata utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo per quantificare la crescita neuronale. Tipicamente vengono generate ricostruzioni tridimensionali scheletrizzate di ciascuna immagine neuronale. L'imaging time-lapse con intervalli prolungati fornisce informazioni sulle conseguenze a lungo termine di una manipolazione sperimentale.

Qui vediamo un neurone immaturo che esprime GFP che è stato ripreso quotidianamente nel corso di quattro giorni, durante l'elaborazione del suo pergolato dendritico. Queste immagini sono state catturate utilizzando la microscopia a due fotoni e sono presentate come proiezioni Z. L'imaging rapido in time-lapse ci consente di osservare la natura dei processi più dinamici di crescita neuronale, tra cui la formazione e la retrazione dei filopodi dendritici.

Questo video mostra un neurone che esprime GFP relativamente maturo che è stato ripreso in tre dimensioni ogni due minuti per un'ora. Questo è un esempio di un neurone immaturo che esprime GFP che è stato ripreso ogni cinque minuti nel corso di un'ora. I neuroni più giovani sono altamente dinamici e mostrano un'ampia crescita e retrazione dei rami.

Una vista zoom di questo neurone che esprime GFP mostra la costante aggiunta e retrazione di filopodi dendritici che è tipica dei neuroni in via di sviluppo in questo sistema. La trasparenza del girino albino e l'accessibilità del suo cervello rendono questo sistema modello ideale per visualizzare la crescita neuronale e gli eventi intracellulari all'interno di un organismo vivo. L'elettroporazione di una singola cellula ci permette di visualizzare la crescita di un singolo neurone e di eseguire manipolazioni autonome cellulari all'interno di un cervello altrimenti inalterato.

Quindi vi abbiamo appena mostrato come condurre l'elettroporazione a singola cellula in poli zap lavis tat, anche se qui ci concentriamo sull'elettroporazione in poli TA. Questa tecnica è stata utilizzata in altri organismi ed è stata utilizzata anche in fette di ippocampo e colture cellulari dissociate. Quando si esegue questa procedura, è importante assicurarsi di modificare costantemente i puntali delle pipette e i parametri di stimolazione per mantenere un'elevata resa.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.