Cella singola elettroporazione in vivo all'interno del cervello intatto in via di sviluppo

L'elettroporazione a singola cellula è una tecnica specializzata che consente il trasferimento di DNA o altre macromolecole in singole cellule all'interno di un tessuto integro, inclusi preparati in vivo quando combinata con avanzate tecniche di imaging in vivo. L'elettroporazione a singola cellula di marcatori fluorescenti permette la visualizzazione diretta della morfologia cellulare, della crescita cellulare e degli eventi intercellulari su scale temporali che vanno da pochi secondi a diversi giorni. In questo video, descriviamo dettagliatamente la procedura per l'elettroporazione a singola cellula di un colorante fluorescente o di DNA plasmidico in neuroni all'interno del cervello integro della rana XUS allo stadio di girino, mostrando esempi di imaging in tempo reale di neuroni marcati con fluorescenza.

Oh, ciao. Mi chiamo Eth Haa e lavoro nel laboratorio del Dottor Kurt Haass presso il Centro di Ricerca sul Cervello dell'Università della British Columbia. Oggi, mostrerò come eseguire l'elettroporazione mirata di singole cellule neuronali all'interno del cervello integro della rana pescatrice albina XUS Lavis.

Il vantaggio distintivo di questa tecnica è che manipolazioni sperimentali possono essere eseguite su singole cellule lasciando inalterato il tessuto circostante, permettendo così di distinguere effetti autonomi della cellula da quelli derivanti da trattamenti globali. Il primo passaggio consiste nella fabbricazione di micropipette con diametro della punta e angolo di affusolatura appropriati, seguito dal caricamento del materiale da trasferire nella micropipetta. Successivamente, i pool di TA devono essere anestetizzati e trasferiti nella camera di registrazione, quindi la micropipetta viene inserita nel cervello e applicata una serie di impulsi di tensione.

Infine, i neuroni attivati vengono analizzati mediante microscopia a due fotoni. Questa tecnica verrà mostrata nei girini. L'attivazione di singole cellule può essere utilizzata anche in altri sistemi modello e in preparazioni ex vivo.

Pertanto, tenendo presente questo, iniziamo. L'elettroporazione a singola cellula mira a una cellula individuale mediante l'uso di un elettrodo micropipetta di vetro tirato che limita il campo elettrico a una singola cellula a contatto con la punta della pipetta. La geometria fisica della punta della pipetta è una caratteristica fondamentale che influisce direttamente sul successo della tecnica.

Viene utilizzato un estrattore modello P 97 a saldatura per generare micropipette in vetro borosilicato con un diametro esterno di 1,5 millimetri e un diametro interno di 0,75 millimetri, contenente un filamento interno per facilitare il riempimento della punta senza bolle d'aria. Le punte di pipetta risultate più efficaci per l'elettroporazione singola cellulare sono quelle con un diametro della punta compreso tra 0,5 e 1 micron e angoli di affusolatura superiori a 10 gradi. Dopo l'estrazione di una micropipetta di vetro, il materiale in soluzione può essere caricato nella pipetta mediante riempimento retrogrado o utilizzando una siringa di carico.

Per questa dimostrazione, etichetteremo fluorescentemente singoli neuroni con un colorante fluorescente, visibile qui, o con un plasmide codificante. Le soluzioni di proteina verde fluorescente GFP devono essere centrifugate brevemente ad alta velocità per ridurre la quantità di detriti particolati che entrano nella pipetta. Poiché ciò aumenterebbe la probabilità di occlusione della punta per gli utenti alle prime armi, si consiglia di iniziare con i coloranti fluorescenti, poiché sono facilmente visibili in fluorescenza episcopica.

Questo consente la visualizzazione della punta all'interno del campione e fornisce un riscontro diretto sull'effettiva corretta configurazione dell'equipaggiamento e sull'idoneità della punta della pipetta. Ben fatto. Ora che abbiamo preparato la micropipetta, possiamo passare all'esecuzione della procedura di elettroporazione singola cellula.

Le attrezzature elettriche necessarie per questa tecnica sono un stimolatore e un oscilloscopio e un supporto per pipetta munito di un filo d'argento da inserire nella pipetta. Qui stiamo utilizzando un axon instrument's ax separator 800 A, tuttavia possono essere utilizzati anche stimolatori comuni come un grass SD nine. L'ax separator è collegato allo stadio di testa, che funge da interfaccia tra l'ax separator e l'elettrodo di filo d'argento.

Il contatto esterno sulla rana è semplicemente un filo d'argento che mantiene un contatto elettronico con la rana. Durante l'elettroporazione, lo stadio della testa, il cavo di massa e il contatto esterno sulla rana sono entrambi collegati all'ingresso dell'oscilloscopio. Una volta configurata l'apparecchiatura elettrica, la pipetta può essere posizionata nel supporto per pipetta.

Il supporto per micropipetta deve essere montato su un micromanipolatore a tre assi che permetta movimenti fini. L'elettroporazione singola richiede un microscopio con una buona distanza di lavoro. Questo consente infatti maggiore spazio di manovra e permette di avvicinare la pipetta con un angolo compreso tra 30 e 45 gradi.

Dopo aver collegato correttamente l'equipaggiamento, possiamo iniziare la procedura di elettroporazione su singola cellula. Innanzitutto, i girini vengono anestetizzati immergendoli in MS 0,02%, di solito i girini risultano completamente anestetizzati. Dopo circa cinque minuti, un singolo girino viene trasferito nella camera di elettroporazione.

Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, la camera può essere facilmente realizzata in laboratorio incidendo una cavità a forma di girino in un piccolo blocco di silicone e inserendo un filo di rame argentato in modo che entri in contatto con la pelle del girino quando si trova all'interno della camera. Successivamente, utilizzando un pennello per posizionare il girino, si garantisce che esso sia rivolto con il lato dorsale verso l'alto. La micropipetta viene quindi abbassata fino a quando entra in contatto con la pelle direttamente adiacente alla regione di interesse.

L'ulteriore abbassamento della pipetta inizialmente provoca una fossetta nella cute e successivamente penetra nel tessuto sottostante. In questo caso, sto prendendo di mira il tubercolo ottico del cervello del pesce zebra. In particolare, mirerò alla regione del corpo cellulare.

Se si utilizza un elettrodo xi, è possibile monitorare la resistenza della pipetta nel tessuto. In generale, la resistenza varia da 10 a circa 40 megaohm, valore che funziona bene.

La resistenza della pipetta è un buon indicatore per verificare se il diametro della punta è troppo piccolo o se la punta è ostruita, in tal caso la resistenza sarà elevata. D'altro canto, se il diametro della punta è troppo grande o se la punta è rotta, la resistenza della pipetta sarà bassa. Tuttavia, non è possibile misurare la resistenza assoluta della pipetta quando si utilizza uno stimolatore convenzionale.

La lettura dell'oscilloscopio è una misura indiretta della resistenza della pipetta per i coloranti al destrano fluorescente. Lo stimolo consiste in una serie di impulsi quadri positivi della durata di 10 millisecondi, applicati a una frequenza di 300 hertz. Ogni singolo impulso ha una durata di 300 microsecondi ed è erogato a una tensione di 50 volt.

Utilizzando queste impostazioni, il colorante fluorescente viene espulso dalla punta, come si può osservare applicando uno stimolo dopo l'elettroporazione. In un sito, la pipetta viene ritratta e il processo viene ripetuto in diversi siti all'interno del tessuto per migliorare il rendimento. Mentre viene erogata una serie di impulsi di tensione, si deve monitorare l'ampiezza degli impulsi risultanti sull'oscilloscopio e regolare l'ampiezza tra uno e 1,5 microampere, se necessario.

Se l'ampiezza dell'impulso rimane bassa dopo un notevole aumento della tensione o diminuisce nel corso della procedura, ciò suggerisce fortemente che la punta sia ostruita o che il diametro della punta sia troppo piccolo. Questa situazione può risultare particolarmente frustrante quando si verifica. D'altra parte, se l'ampiezza rimane elevata dopo una notevole riduzione della tensione applicata o aumenta nel corso della procedura, ciò indica chiaramente che la punta è troppo larga, oppure che si è rotta, o che le punte si rompono.

Spesso divento molto emotivo e triste. Come accennato in precedenza, il vantaggio dell'uso di coloranti fluorescenti è che si può verificare immediatamente se le singole cellule sono state elettroporate utilizzando i parametri di stimolo forniti. Se le cellule appaiono molto deboli o nessuna cellula è marcata, si inizierebbe ad aumentare gradualmente ciascun parametro di stimolo in modo indipendente finché le cellule marcate non appaiono ben illuminate come in questo caso; vedere cellule ben marcate mi rende felice.

D'altra parte, se numerose cellule apparivano marcate, si sarebbero ridotti gradualmente i parametri dello stimolo fino a quando sembrava che una singola cellula fosse marcata in modo intenso come questa. Osservare cellule marcate in modo intenso è davvero soddisfacente. Nel caso del DNA plasmidico, gli impulsi utilizzati sono negativi, della durata di un millisecondo, erogati a 300 hertz e la durata del treno di impulsi è di 500 millisecondi.

Dopo l'elettroporazione, i girini TA vengono posizionati in una soluzione di allevamento fresca, dove si riprendono rapidamente dall'anestesia. Di solito, dopo aver elettroporato da 50 a cento girini TA, possiamo procedere alla loro selezione, come vi mostrerò tra breve. Prima di iniziare gli esperimenti di imaging, è utile esaminare rapidamente i girini elettroporati utilizzando un microscopio ad epifluorescenza eretto.

Per determinare quali girini contengono neuroni adatti all'immagine, i girini vengono anestetizzati e quindi posizionati in una camera a sigaro e coperti con un vetrino; singoli cervelli di girino vengono quindi esaminati rapidamente sotto luce epifluorescente per verificare la presenza di neuroni singoli marcati con fluorescenza. Si noti che un'eccessiva esposizione alla luce epifluorescente provocherà fototossicità, che potrebbe uccidere la cellula marcata. Pertanto, cercare di minimizzare il tempo di esposizione delle cellule alla luce fluorescente.

Nel caso dei coloranti al destrano, lo screening può essere effettuato già 30 minuti dopo l'elettroporazione. Tuttavia, osserviamo che intervalli più lunghi sono associati a livelli di fluorescenza di fondo più bassi. Nel caso del plasmide, lo screening del DNA viene tipicamente eseguito almeno 12 ore dopo l'elettroporazione.

Utilizziamo regolarmente l'elettroporazione a singola cellula per etichettare in modo fluorescente i neuroni all'interno del tetto ottico del girino. Il nostro microscopio a due fotoni è su misura, costruito a partire da un microscopio confocale Olympus FV 300 e da una sorgente luminosa laser Chameleon XP. Utilizziamo tipicamente una lunghezza d'onda di 910 nanometri per visualizzare la fluorescenza verde.

Dopo aver individuato una girino con un singolo neurone AL marcato e averlo posizionato sul nostro sistema a due fotoni, procediamo con l'acquisizione di immagini a intervalli di tempo per visualizzare i neuroni tattili in diversi intervalli temporali. Ciò ci consente di osservare i modelli dinamici di crescita degli alberi dendritici delle cellule AL. Qui vediamo un esempio di un neurone che esprime GFP ed è stato marcato mediante elettroporazione a singola cellula.

Questa immagine è stata acquisita utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo al fine di quantificare la crescita neuronale. Di norma vengono generate ricostruzioni tridimensionali scheletrizzate di ciascuna immagine neuronale. L'acquisizione di immagini in time-lapse con intervalli prolungati fornisce informazioni sulle conseguenze a lungo termine di una manipolazione sperimentale.

Qui osserviamo un neurone immaturo che esprime GFP, ripreso quotidianamente nell'arco di quattro giorni, durante i quali si è assistito allo sviluppo del suo albero dendritico. Queste immagini sono state acquisite mediante microscopia a due fotoni e sono presentate come proiezioni Z. L'acquisizione rapida di immagini in time-lapse ci consente di osservare la natura di processi più dinamici della crescita neuronale, inclusa la formazione e il ritrarsi dei filopodi dendritici.

Questo video mostra un neurone relativamente maturo che esprime GFP e che è stato ripreso in tre dimensioni ogni due minuti per un'ora. Questo è un esempio di un neurone immaturo che esprime GFP e che è stato ripreso ogni cinque minuti nell'arco di un'ora. I neuroni più giovani sono altamente dinamici e mostrano una notevole crescita e retrazione dei rami.

Una vista ingrandita di questo neurone che esprime GFP mostra l'aggiunta e il ritrarsi costante di filopodi dendritici, caratteristici dei neuroni in via di sviluppo in questo sistema. La trasparenza del girino albino e la facile accessibilità del suo cervello rendono questo sistema modello particolarmente adatto per visualizzare la crescita neuronale e gli eventi intracellulari all'interno di un organismo vivente. L'elettroporazione a singola cellula ci permette di osservare la crescita di un singolo neurone e di effettuare manipolazioni autonome a livello cellulare all'interno di un cervello altrimenti inalterato.

Abbiamo appena illustrato come eseguire l'elettroporazione a singola cellula nei tentacoli di zap lavis, anche se in questo caso ci siamo concentrati sull'elettroporazione nei tentacoli TA. Questa tecnica è stata utilizzata in altri organismi ed è stata applicata anche in fette di ippocampo e colture cellulari dissociate. Durante questa procedura, è fondamentale modificare costantemente le punte delle pipette e i parametri di stimolazione per mantenere un'elevata resa.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.