Un metodo HPLC-QQQ-MS efficiente e rapido per la quantificazione degli alcaloidi tropani nelle piante medicinali

Abbiamo sviluppato un metodo HPLC-QQQ-MS per quantificare rapidamente tre principali alcaloidi tropani in Anisodus tanguticus. L'HPLC convenzionale manca di sensibilità agli alcaloidi tropani. Questo metodo utilizza la spettrometria di massa altamente sensibile per risolvere questo problema.

Per cominciare, pesa con precisione 10,0 milligrammi di standard di riferimento di iosciamina, anisodamina idrobromuro e scopolamina idrobromuro. Mettili in una fiaschetta volumetrica separata da 10 millilitri. Aggiungi metanolo di grado cromatografico alla linea segnata in ogni fiaschetta volumetrica.

Sciogliere accuratamente gli standard con trattamento ultrasonico per preparare soluzioni standard singole con una concentrazione di 1,0 milligrammo per millilitro. Poi, trasferisci le soluzioni di base in bottiglie di reagente marrone e conservale a quattro gradi Celsius al buio. Per preparare una soluzione intermedia standard mista di 10 microgrammi per millilitro, si pipeteranno 100 microlitri di ciascuna soluzione di stocco precedentemente preparata in una fiaschetta volumetrica da 10 millilitri.

Poi, aggiungere metanolo di grado cromatografico alla linea contrassegnata per diluire la soluzione. Successivamente, effettua la liofilizzazione del materiale fresco di Sophora flavescens. Poi, usando un macinacaffè ad alta velocità, polverizza il materiale essiccato in una polvere omogenea.

Setaccia la polvere attraverso un setaccio standard da 0,25 millimetri. Pesa con precisione 20 milligrammi di polvere setacciata. Trasferiscilo in una fiaschetta volumetrica da 100 millilitri e aggiungi metanolo di grado cromatografico appena sotto la linea segnata.

Successivamente, esegui l'estrazione ultrasonica a temperatura ambiente per 30 minuti. Poi, rimuovi la fiaschetta volumetrica e lascia raffreddare fino a 25 gradi Celsius a temperatura ambiente. Aggiungi metanolo di grado cromatografico alla linea segnata da 100 millilitri e al vortice per mescolare per due minuti.

Poi, pipettare un millilitro dell'estratto preparato in una fiaschetta volumetrica da 100 millilitri. Aggiungi metanolo alla linea segnata. Agita bene per mescolare bene e ottieni la soluzione madre per l'iniezione di HPLC.

Per la filtrazione del campione, preparare una siringa usa e getta senza ago da un millilitro e una membrana microporosa in fase organica da 0,22 micrometri. Aspirare 1,2 millilitri della soluzione madre per l'iniezione nella siringa e filtrare la soluzione spingendola lentamente attraverso la membrana. Raccogli il filtrato in una fiala campione da due millilitri con un inserto interno e sigilla bene la fiala con un tappo.

Prepara la fase mobile A misurando 1000 millilitri di acqua ultrapura. Aggiungi 1,0 millilitri di acido formico di grado cromatografico e mescola uniformemente con un mescolatore magnetico per 10 minuti. Successivamente, prepara la fase mobile B utilizzando direttamente metanolo di grado cromatografico senza trattamenti aggiuntivi.

Degassare le fasi mobili A e B a 40 kilohertz per 15 minuti utilizzando unità di degassaggio ultrasonico separate. Collegare le fasi mobili degassate in bottiglie di solvente separate alle corrispondenti linee A e B del sistema HPLC. Usa una colonna C18 per la separazione cromatografica.

Bilanciare la colonna con metanolo e acqua in un rapporto di 80-20 per 30 minuti con una portata di 0,3 millilitri al minuto. Imposta la temperatura del forno a colonna a 30 gradi Celsius e preriscalda per 10 minuti di anticipo. Poi, imposta la portata a 0,60 millilitri al minuto, il volume di iniezione a due microlitri e la lunghezza d'onda di rilevamento a 210 nanometri.

Successivamente, imposta il programma di eluzione del gradiente con le condizioni presentate. Eseguire la rilevazione spettrometrica di massa utilizzando uno spettrometro di massa a quadrupolo triplo dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray che opera in modalità ionizzazione positiva. Imposta la pressione del nebulizzatore a 15 libbre per pollice quadrato, la tensione capillare a 4.000 volt, la temperatura del gas a 300 gradi Celsius e il flusso di gas a 11 litri al minuto.

Poi, imposta i parametri per più coppie di ioni di monitoraggio della reazione. Per identificare ioni precursori, infondere direttamente le singole soluzioni standard in modalità scansione MS2. Dopo la validazione del metodo, eseguire l'acquisizione dati in modalità di monitoraggio a reazioni multiple.

Utilizzare i parametri ottimizzati, inclusi ioni precursori, transizioni ioniche prodotto, tensione del frammentatore ed energia di collisione per ciascun analita come presentato qui. Lancia il software di analisi qualitativa. Seleziona file e seleziona importa dati per importare tutti i file di dati raccolti.

Controlla la simmetria di picco e la consistenza temporale dei picchi target in ogni cromatogramma ionico estratto. Nel modulo di quantificazione, seleziona la transizione MRM. Inserire le coppie di ioni precursori e ioni prodotto per ciascun componente ed estrarre i corrispondenti cromatogrammi ionici estratti.

Calcola l'area di picco per l'analisi quantitativa. Tutti e tre gli alcaloidi tropani bersaglio sono stati separati con successo entro 20 minuti nelle condizioni ottimizzate dell'HPLC. La risoluzione tra scopolamina e anisodamina era di 8,67.

Mentre quella tra anisodamina e iosciamina ha raggiunto 11,58, tutti i valori di risoluzione hanno superato significativamente il criterio di separazione di base di 1,5. Tutti gli analiti hanno mostrato buona linearità su un intervallo di concentrazione da 0,014 a 0,320 microgrammi per millilitro con coefficienti di correlazione superiori a 0,99. I recuperi medi sono stati del 101,44% per scopolamina, 100,25% per l'anisodamina e 99,56% per l'iosciamina, con deviazioni standard relative rispettivamente dell'1,85%, 2,35% e 1,9%.

La quantificazione di tre alcaloidi tropani in 10 campioni di Anisodus tanguticus ha mostrato che il contenuto di scopolamina variava da 0,3667 milligrammi per grammo nel campione sei a 1,0356 milligrammi per grammo nel campione sette. Il contenuto di anisodamina variava da 0,0269 milligrammi per grammo nel campione sei a 0,3590 milligrammi per grammo nel campione 10. Il contenuto di iosciamina variava da 0,2930 milligrammi per grammo nel campione due a 1,4989 milligrammi per grammo nel campione 10, con livelli più elevati osservati nei campioni quattro, sette, nove e dieci.

Questo protocollo consente una quantificazione rapida e accurata di tre principali alcaloidi tropani. La sfida principale è garantire la procedura strumentale e la preparazione standardizzata del campione per una misurazione accurata. Questo metodo può essere esteso per esplorare e quantificare altri metaboliti in Anisodus tanguticus.