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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011278), dal Progetto autofinanziato dell'Istituto di Ricerca in Biotecnologia della Provincia di Guangdong (GDBRI-ZL202602) e dall'Interscambio e Cooperazione Accademica Cina-Canada sui Modelli e la Patogenesi delle Malattie Cardiovascolari (MS202500058).

<ol>
	<li>Fauconnier, J., Meli, A. C., Thireau, J., Roberge, S., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+leak+mediated+by+caspase-8+activation+leads+to+left+ventricular+injury+after+myocardial+ischemia-reperfusion.">Ryanodine receptor leak mediated by caspase-8 activation leads to left ventricular injury after myocardial ischemia-reperfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13258-13263 (2011).</li><li>Cohn, J. 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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

In questo studio, abbiamo generato un topo privo del gene Cracd mediante tecnologia CRISPR/Cas9 e abbiamo messo a punto un protocollo per fenotipizzarlo dopo infarto miocardico (MI) utilizzando ecocardiografia convenzionale, imaging ecocardiografico con speckle-tracking strain e istologia. Il protocollo ha prodotto topi knock-out con perdita confermata della proteina CRACD. I topi deficienti di Cracd hanno mostrato una minore dilatazione ventricolare, una migliore frazione di eiezione (EF) e una ridotta fibrosi rispetto ai controlli wild-type (WT) dopo l'infarto miocardico, confermando l'utilità del modello nello studio del rimodellamento cardiaco.
Il successo di questo modello dipende da diversi passaggi critici. La progettazione dell'gRNA e la relativa validazione in vitro influenzano direttamente l'efficienza della modifica nei zigoti23. Utilizziamo CRISPick o Benchling per selezionare gRNA con punteggi CRISPRater ≥ 0,5 e successivamente testiamo l'efficienza di scissione mediante un saggio Cas9/gRNA in vitro. Solo gli gRNA che raggiungono una scissione &#62; 50% vengono microiniettati. Anche la legatura corretta dell'arteria discendente anteriore (LAD) è fondamentale: il punto di sutura con filo 7‑0 deve essere posizionato a 2–3 mm dall'origine della LAD e a una profondità di 0,5–1 mm, per evitare di perforare il ventricolo destro (troppo profondo) o di non occludere adeguatamente il vaso (troppo superficiale); la comparsa immediata di un'area bianca sulla parete anteriore conferma l'occlusione. Anche il controllo della frequenza cardiaca durante l'ecocardiografia è essenziale24: mantenere la frequenza tra 450 e 550 bpm regolando l'isoflurano (tipicamente 1–2%) migliora la riproducibilità delle misurazioni convenzionali e delle misure di deformazione (strain). Infine, per l'analisi mediante speckle-tracking, la valutazione visiva della mesh codificata a colori è fondamentale25. La mesh deve seguire i bordi miocardici senza movimenti irregolari; in caso contrario, è necessario un aggiustamento manuale; se la qualità rimane scadente dopo tre tentativi, il topo viene escluso.
Anche quando il protocollo viene seguito meticolosamente, possono insorgere alcune difficoltà tecniche. La risoluzione sistematica dei problemi può risolvere la maggior parte di essi. Bassi tassi di trasmissione germinale (inferiori al 10%) indicano solitamente un'integrazione scadente dell'oligonucleotide donatore o un'attività debole della gRNA26. Di conseguenza, aumentare l'oligo donatore a 20 ng/µL, estendere le braccia di omologia a 120–200 bp e verificare nuovamente il taglio della gRNA (&#62; 50%) può migliorare la trasmissione. Un'elevata mortalità post-IM (superiore al 30%) è spesso causata da pneumotorace, emorragia e un'ampia infarto27. Pertanto, mantenere i topi sotto ossigeno continuo fino al risveglio e utilizzare un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea riduce in modo evidente i tassi di mortalità. Se la parete anteriore non diventa pallida dopo la legatura, probabilmente la CAD è stata identificata in modo errato o il punto di sutura è troppo superficiale. In questo caso, ridefinire la posizione della CAD (un vaso diagonale di colore rosso brillante) e ripassare l'ago a una profondità di 0,5–1 mm, talvolta con l'ausilio di un microscopio stereoscopico, risolve il problema. Per una scarsa qualità del tracciamento del contrasto, i sospetti abituali sono una bassa frequenza di acquisizione, bordi sfocati o artefatti dovuti al movimento28. Di conseguenza, aumentare la frequenza di acquisizione, regolare finemente il guadagno, correggere manualmente il tracciato endocardico ed escludere i cicli con aritmie aiutano a migliorare i risultati.
Oltre a queste considerazioni operative, il metodo presenta chiare limitazioni. Il knockout di Cracd è globale, quindi CRACD manca in tutti i tessuti. Di conseguenza, la protezione osservata non può essere attribuita esclusivamente ai cardiomiociti, poiché potrebbero intervenire anche fattori sistemici. Sarebbe necessario un knockout condizionale per distinguere i ruoli specifici per tipo cellulare. Un'altra limitazione è rappresentata dall'unico punto temporale analizzato al giorno 7; in tal modo non si ottiene alcuna informazione sul rimodellamento cronico. Pertanto, per studi a lungo termine dovrebbero essere inclusi punti temporali successivi (4 o 8 settimane). Anche la riproducibilità risente della dipendenza dalla qualità delle immagini: non tutti i sistemi ecografici sono in grado di fornire contorni endocardici nitidi, e l'esperienza dell'operatore è determinante. Per questo motivo, si raccomanda che tutte le chirurgie e le misurazioni siano eseguite da personale professionalmente addestrato.
Alla luce di questi limiti, è utile confrontare il nostro approccio con strategie alternative per lo studio della funzione genica nel rimodellamento post-infarto miocardico. La manipolazione genica mediata da AAV e gli oligonucleotidi antisenso (ASO) rappresentano due alternative comuni29,30. L'AAV9 può indurre un'overespressione o un silenziamento transitorio specifico per il tessuto cardiaco senza necessità di incroci, ma presenta svantaggi come il limite di confezionamento (~4,7 kb), un'efficienza di trasduzione variabile e effetti fuori bersaglio31. Al contrario, il nostro modello di knockout mediante CRISPR/Cas9 offre una perdita di funzione permanente e completa, vantaggio utile per studi a lungo termine. Gli ASO consentono un silenziamento reversibile, dipendente dalla dose e con insorgenza rapida, risultando adatti a interventi acuti; tuttavia, richiedono somministrazioni ripetute e mancano di specificità tissutale32. Pertanto, il knockout costitutivo descritto in questo studio è il più indicato per la scoperta iniziale e la fenotipizzazione cronica.
Infine, il protocollo può essere esteso ben oltre il CRACD. Lo stesso flusso di lavoro — la generazione di topi knock-out mediante CRISPR/Cas9 combinata con ecocardiografia, imaging della deformazione e istologia — può valutare qualsiasi gene candidato nel rimodellamento post-infarto miocardico. Il quadro fenotipico si adatta anche ad altri modelli di malattie cardiovascolari, come la costrizione aortica trasversa (sovraccarico da pressione) o il danno da ischemia-riperfusione. Inoltre, i campioni di tessuto ottenuti con questo protocollo possono essere utilizzati per analisi multi-omiche (transcrittomica, proteomica, metabolomica) al fine di individuare i meccanismi molecolari. Il modello deficitario per Cracd può fungere da strumento per la sperimentazione di farmaci: composti il cui meccanismo d'azione è sospettato di coinvolgere la via CRACD possono essere valutati. Pertanto, questo protocollo fornisce una piattaforma adattabile a un'ampia gamma di studi meccanicistici e traslazionali nella ricerca cardiovascolare.

L'infarto miocardico (IM) rimane una delle principali cause di morbilità e mortalità a livello mondiale, contribuendo in modo significativo al carico globale per la salute cardiovascolare1La prognosi a lungo termine dopo infarto miocardico è determinata principalmente dal processo di rimodellamento del ventricolo sinistro (VS).2, che comporta dilatazione ventricolare, assottigliamento della parete e fibrosi interstiziale3,4, che sono fattori chiave nella progressione verso lo scompenso cardiaco (HF). L'incidenza globale di HF derivante dal rimodellamento cardiaco post-infarto miocardico aggrava ulteriormente il carico della malattia cardiovascolare5Nonostante queste osservazioni cliniche ben consolidate, mancano studi sistematici che utilizzino modelli in vivo sensibili e riproducibili per valutare il ruolo di geni specifici nel rimodellamento post-infarto miocardico. Attualmente non esiste un protocollo che combini un modello knock-out ingegnerizzato con CRISPR/Cas9 con tecniche avanzate di imaging della deformazione tissutale per valutare un regolatore citoscheletrico come CRACD. È pertanto urgentemente necessario un metodo che consenta una manipolazione genetica precisa e un fenotipaggio cardiaco ad alta risoluzione.
Il regolatore dell'inibizione della polimerizzazione dell'actina (CRACD), noto anche come KIAA1211, è un regolatore della polimerizzazione dell'actina localizzato principalmente nel citosol che svolge un ruolo fondamentale nella dinamica del citoscheletro6. Regola positivamente la polimerizzazione dell'actina legandosi alle proteine di cappuccio dell'actina (CAPZA1, CAPZA2, CAPZB) e impedendo loro di legarsi alle estremità barbate dei filamenti di actina7. Nei tessuti epiteliali, CRACD svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della morfologia cellulare e della trasduzione del segnale preservando l'integrità del citoscheletro di actina8,9. In cellule tumorali, la sua disregolazione è associata a un aumento della metastasi e della proliferazione cellulare6,10. Il ruolo di CRACD nel cuore non è ancora stato completamente chiarito. Studi sul trascrittoma cardiaco e interventi sperimentali mostrano che l'espressione genica di Cracd risponde allo stress patologico e potrebbe regolare geni coinvolti nella dinamica del citoscheletro durante il rimodellamento ventricolare9,11. Inoltre, la sua proteina inibitrice CapZ è strettamente associata alla patologia cardiaca: la fosforilazione di CapZ regola la crescita dei miofibrilli durante l'ipertrofia indotta dalla fenilefrina12. Le nostre ricerche precedenti indicano che una moderata riduzione dell'espressione di CRACD conferisce protezione contro i danni miocardici e preserva la contrattilità dei miofilamenti dopo un'ischemia acuta13. Questi risultati suggeriscono che CRACD potrebbe essere coinvolto nel rimodellamento ventricolare maladattativo dopo infarto miocardico (MI). Tuttavia, mancano studi sistematici in vivo di perdita di funzione che verifichino se la carenza di Cracd moduli il rimodellamento post-MI, principalmente a causa dell'assenza di un protocollo validato passo dopo passo per generare e fenotipizzare un topo carente di Cracd sotto stress ischemico.
Esistono diversi approcci per generare topi knock-out costitutivi. La ricombinazione omologa tradizionale nelle cellule staminali embrionali (ES) è precisa ma costosa, richiede molto tempo (12–18 mesi) ed è limitata a determinati ceppi murini14. La mutagenesi con ENU (N-etil-N-nitrosourea) produce mutazioni puntiformi casuali che richiedono un ampio numero di incroci ripetuti e sequenziamento15. Al contrario, la tecnologia CRISPR/Cas9 offre vantaggi pratici distinti per questo studio: (i) l'iniezione diretta nei zigoti riduce il tempo necessario a 4–6 mesi; (ii) permette l'eliminazione di un ampio frammento genomico (3153 pb) per garantire una perdita completa della funzione; (iii) funziona direttamente sul ceppo C57BL/6N senza necessità di conversione del ceppo; e (iv) evita l'uso di un marcatore selezionabile, minimizzando interferenze trascrizionali indesiderate. Pertanto, CRISPR/Cas9 rappresenta la scelta più efficiente per generare una linea priva di Cracd, adatta a fenotipizzazioni cardiovascolari di routine. Questa tecnologia è stata ampiamente utilizzata per condurre studi precisi in vivo di perdita di funzione16,17.
L'imaging della deformazione con tracciamento del "speckle" è una tecnica di post-elaborazione che segue il movimento dei "speckle" acustici naturali all'interno del miocardio fotogramma per fotogramma, consentendo il calcolo di parametri di deformazione miocardica come la deformazione (variazione frazionaria della lunghezza) e la velocità di deformazione (velocità di variazione della deformazione)18. A differenza dell'ecocardiografia in modo M convenzionale o bidimensionale, che fornisce indici funzionali globali (frazione di eiezione, accorciamento frazionario, diametro interno del ventricolo sinistro) ed è relativamente insensibile alle anomalie regionali del movimento parietale, l'imaging della deformazione può quantificare la funzione contrattile segmentaria. Questo aspetto è particolarmente importante nel periodo immediatamente successivo all'infarto, in cui l'ipercinesia compensatoria dei segmenti non infartuati può mantenere invariata la frazione di eiezione globale nonostante una disfunzione regionale significativa. Il tracciamento del "speckle" offre diversi vantaggi rispetto agli endpoint standard: fornisce valori segmentari di deformazione e velocità di deformazione, spostamento e velocità, consentendo così di rilevare cambiamenti subclinici sottili19; può identificare la disincronia e i deficit contrattili precoci prima che si verifichi un rimodellamento irreversibile; e analizza direttamente la sottosierosa, lo strato più vulnerabile all'ischemia20. In questo studio, CRACD è un regolatore dello scheletro cellulare che potrebbe influenzare la contrattilità delle miofibrille a livello microscopico. Misurazioni basate sulla cavità cardiaca potrebbero facilmente trascurare tali effetti meccanici locali. Pertanto, l'integrazione dell'analisi con tracciamento del "speckle" in questo protocollo migliora la capacità di rilevare precocemente gli effetti protettivi della carenza di Cracd. Di conseguenza, l'inclusione del tracciamento del "speckle" in questo protocollo fornisce uno strumento sensibile e quantitativo per valutare il rimodellamento post-infartuale, in particolare durante la prima settimana dopo l'infarto miocardico, quando emergono la dilatazione precoce e la disfunzione contrattile21,22.
Questo protocollo è stato progettato per ricercatori che studiano l'impatto funzionale della delezione di un gene specifico sul rimodellamento acuto (a 7 giorni) post infarto miocardico, utilizzando una combinazione di knockout costitutivo e imaging ad alta risoluzione. È adatto a studi di generazione di ipotesi in cui la perdita globale del gene bersaglio è accettabile e il principale endpoint riguarda la funzione sistolica precoce e i cambiamenti strutturali. Tuttavia, è necessario considerare diversi limiti. In primo luogo, il topo privo di Cracd è un knockout globale; pertanto, gli effetti cardioprotettivi osservati non possono essere attribuiti esclusivamente alla perdita di CRACD nei cardiomiociti, poiché potrebbero intervenire anche fattori sistemici. Studi futuri che impieghino strategie di knockout condizionale saranno necessari per ottenere una delezione specifica per il tessuto cardiaco. In secondo luogo, il protocollo si concentra su un singolo punto temporale (giorno 7) e non affronta il rimodellamento cronico né la progressione della insufficienza cardiaca. Saranno richiesti studi longitudinali che vadano oltre la fase acuta. In terzo luogo, l'analisi mediante speckle-tracking richiede immagini di alta qualità (bordi endocardici ben definiti) e software dedicato, che potrebbero non essere disponibili in tutte le strutture centralizzate. Nonostante questi limiti, il protocollo fornisce una piattaforma solida e riproducibile per la caratterizzazione funzionale iniziale di geni coinvolti nel rimodellamento cardiaco post infarto miocardico.
Questo studio ha avuto lo scopo di utilizzare il sistema CRISPR/Cas9 per generare e validare un modello murino carente di Cracd (C57BL/6N-Cracdem1 (c.538-83 to c.3352+255 del)) al fine di indagare l'impatto della carenza di Cracd sul rimodellamento cardiaco post-infarto miocardico e sul movimento della parete ventricolare. L'infarto miocardico (MI) è stato indotto sia in topi wild-type (WT, C57BL/6N) che in topi carenti di Cracd, e sono state effettuate valutazioni complete una settimana dopo l'infarto. Le valutazioni hanno incluso parametri ecocardiografici convenzionali, analisi della deformazione mediante speckle-tracking e valutazione istopatologica. Ci siamo concentrati specificamente sulla fase precoce post-MI (giorno 7) per rilevare i primi eventi di rimodellamento e per determinare se la carenza di Cracd influisca sulla dilatazione ventricolare e sulla funzione sistolica durante la fase acuta dell'infarto miocardico. I risultati ottenuti sono attesi per fornire informazioni preziose sul ruolo di CRACD nella modulazione del rimodellamento cardiaco avverso dopo l'infarto miocardico.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ACRISPR/Cas9&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Trizma Cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T2663</td><td>Utilizzata per la preparazione del buffer di estrazione del DNA</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>539480</td><td>Utilizzata per la digestione della coda del topo</td></tr><tr><td>Green Taq Mix</td><td>Vazyme, Cina</td><td>P131</td><td>Utilizzata per l'amplificazione PCR</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>BioFroxx, Germania</td><td>1110GR500</td><td>Utilizzato per l'elettroforesi su gel del DNA a concentrazione 1&amp;ndash;2%</td></tr><tr><td>Marcatore di DNA</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>SM0242</td><td>Utilizzato come scala di DNA per determinare la dimensione dei prodotti PCR</td></tr><tr><td>TIANamp Genomic DNA Kit</td><td>Tiangen Biotech, Cina</td><td>DP304</td><td>Utilizzato per l'estrazione del DNA genomico dal tessuto della coda del topo</td></tr><tr><td>MEGAshortscript&amp;trade; T7 transcription kit</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>AM1354</td><td>Utilizzato per la trascrizione in vitro dell'gRNA</td></tr><tr><td>Kit di purificazione dell'RNA</td><td>Zymo Research, USA</td><td>R1016</td><td>Utilizzato per la purificazione dell'gRNA trascritto</td></tr><tr><td>BeyoCRISPR&amp;trade; sgRNA Screening Kit</td><td>Beyotime, Cina</td><td>D8412S</td><td>Utilizzato per la valutazione in vitro dell'attività di scissione dell'gRNA</td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi</td><td>NEB, USA</td><td>M0314</td><td>Utilizzato per prevenire la degradazione dell'RNA durante la trascrizione in vitro</td></tr><tr><td>TaKaRa Taq</td><td>Takara Bio, Giappone</td><td>R001A</td><td>Utilizzato per il genotipaggio PCR del DNA della coda del topo</td></tr><tr><td>FERTIUP&amp;reg; Mouse Sperm Preincubation Medium: PM</td><td>Cosmo Bio, Giappone</td><td>KYD-002-EX</td><td>Utilizzato per la capacitazione degli spermatozoi prima della fecondazione in vitro</td></tr><tr><td>T7 ARCA mRNA Kit</td><td>NEB, USA</td><td>E2060</td><td>Utilizzato per la trascrizione in vitro dell'mRNA di Cas9</td></tr><tr><td>Gonadotropina di siero di cavalla gravida</td><td>MCE, USA</td><td>9002-70-4</td><td>Utilizzata per la superovulazione, somministrata per iniezione intraperitoneale</td></tr><tr><td>Gonadotropina corionica umana</td><td>ProSpec, Israele</td><td>HOR-250</td><td>Utilizzata per indurre l'ovulazione, somministrata per iniezione intraperitoneale</td></tr><tr><td>Acqua priva di RNasi</td><td>Aladdin, Cina</td><td>R665526</td><td>Utilizzata per la solubilizzazione dell'RNA e l'allestimento delle reazioni PCR</td></tr><tr><td>Primer</td><td>Sangon Biotech, Cina</td><td>/</td><td>Utilizzati per il genotipaggio</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chirurgia&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD Life Science, Cina</td><td>R510-22-10</td><td>Utilizzato per l'induzione e il mantenimento dell'anestesia durante l'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Veet, Francia</td><td>1000207</td><td>Applicata sulla zona toracica per rimuovere il pelo prima dell'intervento chirurgico e dell'ecografia</td></tr><tr><td>Chirurgia 7-0</td><td>Lingqiao, Cina</td><td>LQ7022380206</td><td>Utilizzato per la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore (LAD)</td></tr><tr><td>Chirurgia 4-0</td><td>Lingqiao, Cina</td><td>LQ4022380412</td><td>Utilizzato per la chiusura dell'incisione cutanea dopo l'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>Respiratore per anestesia</td><td>Harvard Apparatus, USA</td><td>Tabletop</td><td>Utilizzato per somministrare isoflurano e supportare la respirazione</td></tr><tr><td>Respiratore per piccoli animali</td><td>Taimeng, Cina</td><td>HX-101E</td><td>Utilizzato per fornire ventilazione a pressione positiva durante l'intervento chirurgico a torace aperto</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante a temperatura costante</td><td>TigerGene, USA</td><td>TG-TP-GS</td><td>Utilizzata per mantenere la temperatura corporea del topo durante l'intervento chirurgico e il recupero</td></tr><tr><td>Retrattore costale</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, Cina</td><td>LN-18-4101</td><td>Utilizzato per separare le costole ed esporre il cuore per la legatura della LAD</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, Cina</td><td>18-0551</td><td>Utilizzate per effettuare incisioni cutanee e tagliare i tessuti</td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>Nikon, Giappone</td><td>SMZ 745</td><td>Utilizzato per ottenere una visione ingrandita durante l'intervento chirurgico di legatura dell'arteria LAD</td></tr><tr><td>Pinza microscopica per ago</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, Cina</td><td>18-2211</td><td>Utilizzata per manipolare l'ago sottile da 7-0 sotto il microscopio</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Prodotti chimici e reagenti&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agenti accoppianti per ultrasuoni</td><td>Tianjin Jinya Technology Development, Cina</td><td>TM-100</td><td>Applicati sul torace per l'ecocardiografia, garantiscono un contatto adeguato della sonda</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>V900894</td><td>Utilizzata per la fissazione del tessuto cardiaco dopo il prelievo</td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Macklin, Cina</td><td>1330-20-7</td><td>Utilizzato per la rimozione della paraffina e la chiarificazione del tessuto prima della colorazione</td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H3136</td><td>Colorante nucleare, utilizzato nella colorazione ematossilina-eosina (HE)</td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E4009</td><td>Colorante citoplasmatico, utilizzato nella colorazione ematossilina-eosina (HE)</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P3504</td><td>Utilizzato nella colorazione di Masson per la colorazione del citoplasma</td></tr><tr><td>Acido fosfomolibdico</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>221856</td><td>Utilizzato nella colorazione di Masson come mordente e per la differenziazione</td></tr><tr><td>Soluzione di blu di anilina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>415049</td><td>Utilizzata nella colorazione di Masson per la colorazione delle fibre collagene (blu)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CRACD</td><td>Absea, Cina</td><td>KC-35356</td><td>Anticorpo primario per la rilevazione della proteina CRACD mediante Western Blot, diluizione 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GAPDH</td><td>CST, USA</td><td>2118S</td><td>Anticorpo di controllo del carico per Western Blot, diluizione 1:5000</td></tr><tr><td>Etilene</td><td>Macklin, Cina</td><td>64-17-5</td><td>Utilizzato per la disidratazione e la preparazione dei reagenti (gradi 70%, 80%, 95%, 100%)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Attrezzature di laboratorio&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Sorvall&amp;trade; Legend&amp;trade; Micro 17</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>75002541</td><td>Utilizzata per la preparazione abituale dei campioni</td></tr><tr><td>Ciclatore termico PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories, USA</td><td>1861096</td><td>Utilizzato per l'amplificazione del DNA</td></tr><tr><td>Sistema di microiniezione</td><td>Eppendorf, Germania</td><td>5193000020</td><td>Utilizzato per la microiniezione dei reagenti CRISPR/Cas9 negli zigoti</td></tr><tr><td>Sistema di imaging Vevo 2100</td><td>VisualSonics, Canada</td><td>Vevo2100</td><td>Sistema di imaging ad alta frequenza per la valutazione non invasiva della funzione e della struttura cardiaca dopo infarto miocardico (MI)</td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Leica, Germania</td><td>DM2500</td><td>Utilizzato per osservare sezioni cardiache colorate con ematossilina-eosina (HE) e Masson</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software di analisi&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>/</td><td>Utilizzato per l'analisi delle immagini, inclusa la misurazione delle aree, la quantificazione del segnale e l'elaborazione delle immagini istologiche (colorazioni HE e Masson)</td></tr><tr><td>VevoLab 3.2.0 / VevoStrain</td><td>VisualSonics, Canada</td><td>/</td><td>Software VevoLab per l'analisi della funzione cardiaca; modulo VevoStrain utilizzato per l'analisi della deformazione miocardica al fine di valutare le prestazioni cardiache dopo infarto miocardico (MI)</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software, USA</td><td>/</td><td>Utilizzato per l'analisi statistica e la preparazione dei grafici</td></tr></tbody></table>

generazione e caratterizzazione fenotipica di un modello murino deficiente per cracd, modificato con crispr/cas9, per studi sul rimodellamento post-infarto miocardico

Generation and Phenotypic Characterization of a CRISPR/Cas9-Engineered Cracd-Deficient Mouse Model for Post-Myocardial Infarction Remodeling Studies

Myocardial infarction (MI) remains a major cause of morbidity and mortality worldwide. This protocol describes a method for generating and characterizing a Cracd-deficient mouse line on the C57BL/6N background using CRISPR/Cas9 technology. Zygotes were co-injected with Cas9 mRNA, a gRNA construct, and a donor template designed to generate a 3153-bp genomic deletion. The edited allele was confirmed by PCR genotyping and Sanger sequencing. To assess the functional role of CRACD in post-MI remodeling, Cracd-deficient and wild-type (WT, C57BL/6N) mice underwent MI induced by permanent ligation of the left anterior descending coronary artery. On postoperative day 7, cardiac function and left ventricular wall motion were assessed using transthoracic echocardiography and speckle-tracking strain imaging, followed by histopathological evaluation with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Representative results showed that Cracd-deficient mice exhibited reduced ventricular dilation and preserved systolic function compared to WT controls. This protocol provides a reliable experimental platform for mechanistic studies of CRACD in cardiac pathophysiology.

Generation of Cracd-deficient mice
A heritable mouse model carrying a targeted deficiency in the Cracd gene was generated using CRISPR/Cas9-mediated genome editing (Figure 1A, Figure 1B). To distinguish WT, heterozygous, and homozygous genotypes, a multiplex PCR was performed using three primers (F1, F2, R1) in a single reaction. Mice homozygous for the deletion (Cracd&#8209;deficient) displayed only the 421 bp band, WT mice showed only the 357 bp band (Figure 1C). Sanger sequencing of genomic DNA from Cracd-deficient mice confirmed the predicted deletion in the target gene compared to WT controls (Figure 1D). Western blot analysis further demonstrated a marked reduction in CRACD protein levels in cardiac tissues from Cracd-deficient mice compared with WT controls (Figure 1E). Together, these data confirm the successful establishment of the Cracd-deficient mouse line.
Echocardiography
Echocardiographic assessment on postoperative day 7 revealed pronounced pathological cardiac remodeling in WT mice after MI (WT-MI) compared with sham-operated controls (Figure 2A). The WT-MI group showed thinning of the interventricular septum (Figure 2B, C), significant left ventricular (LV) dilation as reflected by increased LVIDd (Figure 2D) and LVIDs (Figure 2E), and thinning of the posterior wall (Figure 2F, G). These structural alterations were associated with a pronounced decline in global systolic function, as demonstrated by significantly reduced EF (Figure 2H) and FS (Figure 2I). In contrast, Cracd-deficient mice displayed a cardioprotective phenotype following MI. LV dilation was significantly attenuated, with notably smaller LVIDd and LVIDs compared with the WT-MI group. Furthermore, these mice exhibited improved systolic thickening of the posterior wall and maintained significantly higher EF and FS values. These findings indicate that Cracd deficiency effectively attenuates post-infarction LV dilation and preserves global systolic function.
Speckle-tracking strain analysis
Left ventricular myocardial motion and deformation were further evaluated by speckle&#8209;tracking echocardiography using only parasternal long&#8209;axis views (Figure 3A). To ensure data reliability, we defined pragmatic criteria for acceptable output based on the capabilities of the VevoStrain software. Acceptable strain analysis required: (i) a clear parasternal long&#8209;axis view with endocardial borders visible throughout the cardiac cycle; (ii) a stable heart rate between 450&#8211;550 bpm during acquisition; (iii) after automatic tracking, the colour&#8209;coded mesh (activated via &#8220;toggle contour/vector/orbit line/B mode&#8221;) had to closely follow the endocardial and epicardial borders without jerking or losing contact; and (iv) strain curves had to be smooth, show consistent waveforms across segments, and lack sudden spikes or arrhythmic interruptions. Suboptimal output&#8212;most commonly erratic strain curves or inability to visualise clear motion trajectories&#8212;led to manual adjustment of endocardial or epicardial contours and re&#8209;analysis. If quality remained poor after three attempts, the mouse was excluded. Using these criteria, we obtained reliable strain data in WT&#8209;MI mice and Cracd&#8209;deficient MI mice.
Compared with the sham group, WT-MI mice exhibited significantly reduced radial velocity (Figure 3B) and longitudinal velocity (Figure 3C), as well as radial displacement (Figure 3D) and longitudinal displacement (Figure 3E), indicating impaired global myocardial motion. The absolute values of radial strain (Figure 3F), radial strain rate (Figure 3G), longitudinal strain (Figure 3H), and longitudinal strain rate (Figure 3I) were also markedly decreased, reflecting severely compromised regional myocardial deformation and function. In contrast, Cracd-deficient mice showed significant improvement in these parameters. Compared with the WT-MI group, they displayed better recovery of radial and longitudinal displacements. Furthermore, radial velocity, radial strain, and radial strain rate were maintained at higher levels, while longitudinal strain and longitudinal strain rate were significantly improved. These results suggest that Cracd deficiency not only preserves global systolic function but also enhances regional LV myocardial deformation after MI.
The speckle&#8209;tracking imaging analysis also included visualization of segmental strain distribution and cardiac motion trajectories. Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images with segmented six regions (BA, MA, AA, AP, MP, BP) and color gradient mapping are displayed in Figure 4A. Cardiac motion trajectories, time&#8209;to&#8209;peak curves for radial and longitudinal strain, parametric distribution maps of strain synchrony, and three&#8209;dimensional reconstructions are presented in Figure 4B. These data further support the functional improvements observed in Cracd&#8209;deficient mice.
Histological examination
To assess the protective effect of Cracd deficiency against MI, histopathological examination was performed on heart sections from WT and Cracd-deficient mice at 7 days post-MI using H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Whole&#8209;heart longitudinal sections are shown in Figure 5A, with quantitative analysis of infarct size and collagen content presented in Figure 5B and Figure 5C, respectively. High&#8209;magnification views of the infarct zone, border zone, and remote zone are displayed in Figure 5D. In WT-MI hearts, H&#38;E staining showed pronounced left ventricular wall thinning and a well-demarcated infarct zone. Within the infarct region, extensive inflammatory cell infiltration, myocardial necrosis, and marked fibrosis with scar formation were observed. In the border zone, inflammatory infiltration, myocardial necrosis, fibrosis and cardiomyocyte hypertrophy were evident, while the remote zone displayed prominent hypertrophic changes. Corresponding Masson&#39;s trichrome staining further demonstrated extensive interstitial fibrosis within both the infarct and border zones of WT hearts following MI. In contrast, Cracd-deficient mice exhibited substantially attenuated pathological alterations, including reduced wall thinning, diminished inflammatory infiltration and myocardial necrosis, less pronounced cardiomyocyte hypertrophy, and markedly decreased interstitial fibrosis compared with WT-MI hearts. These histological findings indicate that Cracd deficiency mitigates post-infarction myocardial damage and adverse remodeling.
Successful protocol execution should yield: (i) a well&#8209;demarcated infarct zone with extensive collagen deposition in WT-MI hearts; (ii) clear cellular morphology without staining artifacts; and (iii) significantly attenuated pathology in Cracd&#8209;deficient MI hearts. Although infarct size may vary with ligation precision, the genotype&#8209;dependent difference is a reliable indicator of successful performance.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig1c1.jpg" /> 
Figure 1: Generation of Cracd-deficient mice. (A) Construction of Cracd-deficient mice. (B) Schematic of the Cracd gene modification strategy. (C) PCR genotyping of tail genomic DNA. WT mice show a single 357 bp band, while homozygous (Cracd&#8209;deficient) mice show a single 421 bp band. (D) Sanger sequencing of genomic DNA confirmed the predicted deletion in the Cracd locus of deficient mice compared to WT controls. (E) Western blot analysis showed significantly reduced CRACD protein levels in the hearts of Cracd-deficient mice compared to WT controls. n = 6 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was calculated with a two-tailed unpaired Student&#39;s t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig2c1.jpg" /> 
Figure 2: Echocardiographic assessment of cardiac function. (A) Representative B-mode and M-mode echocardiographic images of mouse hearts at diastole and systole. Quantitative analysis of (B) interventricular septum thickness at diastole (IVSd) and (C) systole (IVSs), (D) left ventricular internal diameter at diastole (LVIDd) and (E) systole (LVIDs), (F) left ventricular posterior wall thickness at diastole (LVPWd) and (G) systole (LVPWs), (H) ejection fraction (EF), and (I) fractional shortening (FS). n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig2largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig3c1.jpg" /> 
Figure 3: Speckle-tracking strain analysis. (A) Representative images of left ventricular wall motion and deformation at diastole and systole. Quantitative analyses of the following parameters: (B) radial velocity, (C) longitudinal velocity, (D) radial displacement, (E) longitudinal displacement, (F) radial strain, (G) radial strain rate, (H) longitudinal strain, and (I) longitudinal strain rate. n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig4d1.jpg" /> 
Figure 4: Speckle-tracking imaging in WT-Sham, WT-MI, Cracd-deficient Sham, and Cracd-deficient MI groups at 7 days post-MI. (A) Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images. Left ventricular wall was segmented into six regions: BA (basal anterior), MA (mid anterior), AA (apical anterior), AP (apical posterior), MP (mid posterior), and BP (basal posterior). Color gradient from blue to red represents increasing strain magnitude. (B) Cardiac motion trajectories; time-to-peak curves for radial and longitudinal strain values along with corresponding peak times. Parametric distribution maps of strain synchrony (blue/red indicate direction: radial &#8211; away from/toward center; longitudinal &#8211; away from/toward apex). White dots = highest velocity regions, black dots = lowest velocity. Three-dimensional reconstructions (X: time, Y: spatial position, Z: strain magnitude). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig4larged1.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig5c1.jpg" /> 
Figure 5: Histopathological analysis of cardiac remodeling after MI. (A) Whole-heart longitudinal sections with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Scale bars: 2 mm. (B) Quantitative analysis of infarct size and (C) collagen content. (D) High&#8209;magnification views of infarct zone (IZ), border zone (BZ), and remote zone (RZ). H&#38;E: yellow circles = inflammatory infiltration; black arrows = myocardial necrosis; green stars = fibrosis; blue arrows = hypertrophy. Masson&#8217;s trichrome:&#160;blue indicates collagen deposition. Scale bar: 50 &#956;m. n = 5 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig5largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Questo protocollo descrive la generazione e la caratterizzazione fenotipica di un modello murino C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mediante l'uso della tecnologia CRISPR/Cas9 per studiare il ruolo di CRACD nel rimodellamento cardiaco successivo all'infarto miocardico.

Generazione e Caratterizzazione Fenotipica di un Modello Murino Deficiente per Cracd, Modificato con CRISPR/Cas9, per Studi sul Rimodellamento Post-Infarto Miocardico

L'infarto del miocardio (IM) continua a rappresentare una delle principali cause di morbilità e mortalità a livello mondiale. Questo protocollo descrive un metodo per la generazione e la caratterizzazione di...

We study how Cracd-deficiency influences heart remodeling and function after myocardial infarction using a Cracd-deficient mouse model. This protocol can be applied to study gene functions in post-MI cardiac remodeling by combining CRISPR knockout with vivos during imaging. To begin, use CRISPR-Cas9 gene editing technology to generate Cracd-deficient mice on a C57BL/6N background.Place the anesthetized mice in a supine position on a surgical platform and confirm deep anesthesia by the absence of the pedal withdrawal reflex. Then perform orotracheal intubation using a 20 gauge intravenous catheter sheath. Place a small tuft of cotton wool at the opening of the tube to confirm successful intubation as it moves rhythmically with the mouse's breathing.Connect the tube to a mechanical ventilator upon successful intubation to maintain ventilation and anesthesia with 2%isoflurane. Apply ophthalmic ointment to both eyes to prevent corneal drying. Then remove the hair from the anterior chest using a depilatory cream and disinfect the surgical area by applying povidone iodine and 70%alcohol multiple times.After fully exposing the skin, make a 1 to 1.5 centimeter incision in the left chest wa

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Si introduce un metodo chirurgico per indurre sperimentale ischemia / riperfusione (I / R) pregiudizio per simulare infarto del miocardio (MI) in modelli murini che consente una maggiore chiarezza posizionamento della legatura sulla discendente anteriore sinistra (LAD) per migliorare la riproducibilità di esperimenti MI nei topi.

Un modello murino di ischemia miocardica e riperfusione lesioni da legatura della arteria discendente anteriore sinistra

L'insufficienza cardiaca è la principale causa di ospedalizzazione e una delle principali cause di mortalità. Un modello di legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra nei topi è stato applicato per studiare il rimodellamento ventricolare e la disfunzione cardiaca post-infarto del miocardio. Viene presentata la tecnica delle misurazioni emodinamiche invasive nei topi.

Legatura permanente dell&#39;arteria discendente anteriore sinistra coronarica nei topi: un modello di post-infarto rimodellante miocardico e insufficienza cardiaca

Qui forniamo un protocollo dettagliato per effettuare in vivo gene cardiaco editing nei topi utilizzando Virus ricombinante Adeno-Associated (rAAV)-mediate consegna di CRISPR. Questo protocollo offre una strategia terapeutica di promessa per il trattamento di cardiomiopatia distrofica nella distrofia muscolare di Duchenne e può essere utilizzato per generare specifico knockout in topi postnatali.

Adeno-associato Virus-mediate consegna di CRISPR per Gene cardiaco nei topi di Editing

Qui descriviamo una procedura chirurgica che mostra come ottenere una legatura permanente dell'arteria coronaria discendente sinistra-anteriore nei topi. Questo modello è di grande rilevanza per studiare la fisiofisiologia dell'infarto miocardico e i processi biologici concomitanti.

Modello di infarto miocardico Murine utilizzando la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

Questo articolo dimostra un modello per studiare il rimodellamento cardiaco dopo la crioinfortuni miocardica nei topi.

Un modello di criolesionismo per studiare l'infarto miocardico nel mouse

Questo protocollo presenta un modo semplice e coerente per eseguire l'upregolazione transitoria di un gene di interesse usando modRNA dopo l'infarto miocardico nei topi.

Consegna di mRNA modificato in un modello di topo di infarto miocardico

Descriviamo qui, l'istituzione e l'applicazione di una linea di reporter del mouse Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J (indicata come αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito) per la valutazione della riprogrammazione cardiaca. I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) isolati dal ceppo murino vengono convertiti in cardiomiociti indotti (iCM), consentendo una valutazione comoda ed efficiente dell'efficienza di riprogrammazione e della maturazione funzionale...

Valutazione in vitro della riprogrammazione cardiaca mediante misurazione del flusso di calcio specifico cardiaco con un GCaMP3 Reporter

Ci sono diverse differenze tra i ventricoli destro e sinistro. Tuttavia, la fisiopatologia dell'infarto ventricolare destro (RVI) non è stata chiarita. Nel presente protocollo viene introdotto un metodo riproducibile per la generazione di modelli murini RVI, che può fornire un mezzo per spiegare il meccanismo di RVI.

Generazione e caratterizzazione dell'infarto miocardico ventricolare destro indotto dalla legatura permanente dell'arteria coronaria destra nei topi

Questo protocollo descrive un approccio per facilitare modifiche precise knock-in negli embrioni di zebrafish utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Viene presentata una pipeline di fenotipizzazione per dimostrare l'applicabilità di queste tecniche per modellare una variante genetica associata alla sindrome del QT lungo.

Modifiche precise mediate da CRISPR-Cas9 nei cuori di zebrafish

Photothrombosis è una tecnica rapida, mini-invasiva per indurre le piccole e ben delimitate del miocardio in aree di interesse in modo altamente riproducibile. È particolarmente adatto per studiare risposte cellulari e molecolari alla base della plasticità cerebrale in topi transgenici.

Ischemia Photothrombotic: un modello fotochimico lesione corticale minimamente invasiva e riproducibile per mouse Studi Stroke

Guangdong Provincial Biotechnology Research Institute (Guangdong Provincial Laboratory Animals Monitoring Center).  This protocol describes the generation and phenotypic characterization of a C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mouse model using CRISPR/Cas9 technology to study the role of CRACD in cardiac remodeling following myocardial infarction.

Generazione e Caratterizzazione Fenotipica di un Modello Murino Deficiente per Cracd, Modificato con CRISPR/Cas9, per Studi sul Rimodellamento Post-Infarto Miocardico

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