Name: Dal MEF per Matrigel I: hESC Passaging in presenza di MEF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-04T23:27:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Impara a coltivare cellule staminali embrionali umane (hESC) su fibroblasti embrionali di topo (MEF) e in condizioni senza feeder su matrigel. Questo metodo mantiene la pluripotenza per applicazioni in medicina rigenerativa.

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Embrionali umane studi sulle cellule staminali in laboratorio Teitell sono supportati da una California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) sementi concedere RS1-00313. Ringraziamo i membri del Centro di Medicina Rigenerativa Broad e ricerca sulle cellule staminali presso la UCLA, in particolare il Dott. Amander Clark, il Dr. Jerome Zack, e membri del Fondo per la UCLA Stem Cell Institute Broad core per il loro sostegno dei nostri studi.

Dividere le cellule staminali embrionali umane (hESC) placcato al passaggio del mouse fibroblasti embrionali (MEF) Di solito un piatto hESC confluenti possono essere divisi 1:06-1:10, a seconda della linea hESC particolare. Il piatto sarà diviso confluenti ancora 5-7 giorni dopo la divisione. <ol><li> Due giorni prima della scissione, gelatinizzare piatti utilizzando una soluzione 0,1% di gelatina. Per un 6-pozzetti, aggiungere 2 ml in ogni piatto e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 colture di tessuti incubatore durante la notte. </li><li> Piastra MEF sul gelatinizzato 6-pozzetti il ​​giorno prima si pensa di dividere la hESC. (NOTA: MEF può essere placcato fino a 3 giorni prima, se necessario, dopo ~ 3 giorni, MEF si appiattiscono e più diffusa-out e non possono sostenere hESC e più fresca MEF può..) Prendere un flacone di g-irradiati o mitomicina C trattati CF1 MEF, contenente 5-6 x 10 6 cellule, da azoto liquido e scongelare per 2 minuti in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Lavare le cellule una volta con Media caldo Cultura MEF in un tubo da 50 ml falco e risospendere nel volume finale di Media caldo Cultura MEF. A 5-6 x 10 6 cellule, questo è sufficiente per due o tre piastre da 6 pozzetti. </li><li> Mentre il MEF sono stati lavati, togliere i piatti gelatinizzati, rimuovere tutti soluzione dai pozzetti e aggiungere 2,5 ml di Media Cultura MEF per bene. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di sospensione MEF per bene per ottenere 3 ml come un volume finale di ogni bene. Assicurarsi MEF non è completamente disperso e piastre posto indietro nella notte per risolvere incubatrice. </li><li> Il giorno della scissione hESC, preparare freschi o utilizzare &lt;2 settimane di età soluzione sterile collagenasi IV a 1mg/ml. Rimuovere tutti i media dai pozzetti hESC si desidera dividere, lavare una volta con 2 ml per pozzetto di caldo 1 × PBS, pH 7,4, e aggiungere 1 ml di soluzione di collagenasi IV. Incubare a 37 ° C per 5-10 min. Prendere il 6-pozzetti hESC fuori dell&#39;incubatore e aggiungere 1 ml di ES media (senza bFGF) in ciascun pozzetto. Utilizzando la soluzione in ogni pozzetto, con una pipetta 1 ml aspirare i media e far saltare le cellule staminali al largo della piastra. Per ogni bene ci vorranno circa 5 a 10 ripetizioni. Poi, il trasferimento hESC sospeso in un tubo da 50 ml falco. Fate questo per tutti i pozzi di essere per tagliare e unire in un unico tubo falcon da 50ml. Agglomerare le hESC a temperatura ambiente a 200 g per 5 minuti e lavare una volta con i media ES manca bFGF. </li><li> Mentre i hESC vengono lavati, togliere i piatti MEF, rimuovere tutti i supporti dai pozzetti e lavare una volta con sterile, caldo 1 × PBS, pH 7,4 quindi aggiungere 2,5 ml di ES media (ora integrato con 10 ng / ml bFGF) per bene. </li><li> Risospendere il pellet hESC in un volume adeguato di mezzi di ES, integrato con 10ng/ml bFGF. (NOTA:.. Quando le hESC sono risospesi, dovrebbero essere di dimensioni della colonia o meno uniforme e la forma, il volume risospensione dipende dal rapporto di splittaggio) pipetta con attenzione la sospensione hESC su e giù per un paio di volte a rendere le colonie più piccole e più uniformi, ma non così tanto che le singole cellule o colonie molto piccole sono generati. Aggiungere 0,5 ml di sospensione hESC per bene le piastre MEF per ottenere 3 ml come un volume finale di ogni bene. Controllare visivamente per assicurarsi che le hESC sono distribuiti in modo uniforme prima di mettere le piastre indietro nell&#39;incubatore durante la notte per risolvere. Dopo la placcatura, di solito necessari alcuni giorni per le colonie ad assumere la loro forma caratteristica e l&#39;aspetto di confine. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science . 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology+%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) sulle cellule dei fibroblasti del mouse (MEF) le cellule di alimentazione. Nell&#39;ultimo passaggio prima della placcatura, quando le hESC sono risospesi, dovrebbero essere di dimensioni della colonia o meno uniforme e la forma. Con attenzione pipetta la sospensione hESC su e giù per un paio di volte a fare le colonie più piccole e più uniformi, ma non così tanto che le singole cellule o colonie sono molto piccole macchie generated.Immunofluorescence e citome...

<table><tbody><tr><td>Sostituto del siero per knockout (KSR)</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagente</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispasi</td><td>Reagente</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina / Stretomicina </td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reagente</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Oct-4</td><td>Reagente</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo IgG3 coniugato con fito&amp;#8211;eritrina anti-h/mSSEA-4</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anticoniglio IgG coniugato con FITC</td><td>Reagente</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

dal mef per matrigel i: hesc passaging in presenza di mef

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) sulle cellule dei fibroblasti del mouse (MEF) le cellule di alimentazione.

Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) sulle cellule dei fibroblasti del mouse (MEF) le cellule di alimentazione. Parte 1 di 3.

Dal MEF per Matrigel I: hESC Passaging in presenza di MEF

Questo video dimostra come coltivare cellule staminali embrionali umane (hESC) su cellule feeder di fibroblasti embrionali di topo (MEF).

A causa del loro notevole potenziale nella medicina rigenerativa, l'attenzione si sta concentrando sempre di più sulla biologia e sulle manipolazioni delle cellule staminali embrionali umane. In questo video, vi mostreremo come coltivare e mantenere le cellule staminali embrionali umane in uno stato pluripotente utilizzando cellule fibroblastiche embrionali di topo come colture di supporto e condizioni senza colture di supporto su matrigel. Ciao, sono Jinjiang di un laboratorio micro titolo del Dipartimento di Anatomia Patologica e Medicina di Laboratorio dell'Università della California di Los Angeles.Oggi vi mostreremo un procedimento per la coltura di cellule staminali embrionali umane su fibroblasti embrionali murini, cellule nutritizie di origine sanguigna e in condizioni libere da cellule nutritizie su metrigel. Questo procedimento comprende la preparazione di fibroblasti embrionali murini, la generazione di mezzo condizionato metilico per la crescita su metrigel, la preparazione del piatto di Magel e delle masse per l'alimentazione e la crescita delle cellule staminali embrionali umane nel tempo. Cominciamo dunque.Per iniziare la procedura di coltura, le cellule staminali em

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In questo video ci dimostra come il nostro laboratorio passaggi di routine RIFLESSI embrionali umane linee di cellule staminali con tripsina.

RIFLESSI Passaging sulle cellule staminali embrionali umane-linee con tripsina

Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 2 di 3.

Dal MEF per Matrigel 2: hESC scissione dal MEF sul Matrigel

Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 3 di 3.

Dal MEF per Matrigel 3: hESC Passaging da Matrigel su Matrigel

Regia di hESC differenziazione in cellule specifiche, ha generato molto interesse nella medicina rigenerativa. Forniamo un conciso, passo-passo il protocollo per la determinazione...

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

La qualità di fibroblasti embrionali di topo (MEF) è dettata dal ceppo destro del mouse, ad esempio CF-1. Pluripotenza-solidale MEF e mezzi condizionati (CM) ottenuti da questi dovrebbe contenere le concentrazioni ottimali di Activin A, Gremlin e Tgfβ1 necessari per la Activin / Nodale FGF e percorsi di co-operativamente mantenere il self-renewal e la pluripotenza.

Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

Nonostante gli sforzi volti a culture di transizione a feeder liberi condizioni, la derivazione e la cultura di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimangono in gran parte dipendente dal co-colture con alimentatori embrionali di topo (MEF). Qui vi mostriamo una nuova metodologia per la rapida rimozione di alimentatori da culture hESC prima della sperimentazione.

Fibroblast rimozione veloce da alta densità Culture staminali embrionali umane

Qui, descriviamo un protocollo basato su riprogrammazione epigenetica di cellule staminali embrionali umane (hESCs) verso generare una popolazione omogenea di progenitori muscolari scheletriche che in condizioni di coltura permissive formano cluster tridimensionali delle miofibre contrattili (myospheres), che ricapitolano caratteristiche biologiche umana muscoli scheletrici.

Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

Qui, presentiamo protocolli di coltura di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), basati sulla crescita di singole cellule dissociate in monostrato (NCM) di tipo non coloniale. Questo nuovo metodo, che utilizza inibitori della chinasi Rho-associati o l'isoforma 521 della laminina (LN-521), è adatto per la produzione di grandi quantità di hPSC omogenee, la manipolazione genetica e la scoperta di farmaci.

Le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica

Linee cellulari Reporter offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse da popolazioni eterogenee. Tuttavia,-gene targeting utilizzando convenzionale ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali umane è estremamente inefficiente. Qui, descriviamo il targeting CNS mesencefalo specifico PITX3 locus fattore di trascrizione con EGFP utilizzando zinc-finger nucleasi avanzata ricombinazione omologa.

Zinc-finger nucleasi avanzata gene targeting in cellule staminali embrionali umane

Qui, presentiamo un protocollo per generare in modo efficiente cellule trofoblastiche umane da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando la proteina morfogenica ossea 4 e inibitori delle vie Activina/Nodale. Questo metodo è adatto per la differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane e può generare grandi quantità di cellule per la manipolazione genetica.

La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

Impara a coltivare cellule staminali embrionali umane (hESC) su fibroblasti embrionali di topo (MEF) e in condizioni senza feeder su matrigel. Questo metodo mantiene la pluripotenza per applicazioni in medicina rigenerativa.

Dal MEF per Matrigel I: hESC Passaging in presenza di MEF

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