Name: Una piattaforma per la coltura continua di cellule endoteliali in condizioni di flusso fisiologico in microgravità simulata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-11T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Scopri un sistema microfisiologico con trappola per bolle indipendente dall'orientamento per la coltura continua di cellule endoteliali in microgravità simulata. Questa piattaforma avanzata supporta esperimenti di lunga durata nelle missioni spaziali.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento NASA Space Biology n. 80NSSC21K0272.

1. Elettronica del sistema
<ol>
	<li>Collegare il driver della pompa al microcontrollore nei connettori designati contrassegnati con “mp-Highdriver4.”&#160;</li>
	<li>Collegare un cavo della pompa nella posizione designata al lato del driver della pompa contrassegnato con “CH1 CH2.”&#160;</li>
	<li>Collegare una micropompa a una delle porte del cavo della pompa. Assicurarsi che il connettore bianco venga delicatamente allontanato dai fili colorati per inserire completamente la micropompa. Una volta inserita completamente la micropompa nel connettore, spingere delicatamente il connettore bianco nuovamente verso i fili colorati per bloccare la micropompa in posizione.</li>
	<li>Utilizzare un cavo da USB macro a mini per collegare la scheda Nano&#160;a un computer su cui è installata l'applicazione del microcontrollore.</li>
	<li>Fissare due raccordi filettati con barbetta alle estremità di un sensore di flusso liquido. Utilizzare il sensore di flusso liquido per monitorare e registrare i dati della portata del liquido. Il sistema assemblato è mostrato in Figura 1. 
	NOTA: Tutti i componenti della Sezione 1 devono essere sostituiti solo quando necessario, ad esempio in caso di danni o quando le prestazioni iniziano a deteriorarsi.</li>
</ol>
2. Collegamenti del sistema per le fluidiche
<ol>
	<li>Riempire la cavità della trappola per bolle indipendente dall'orientamento fino a circa l'80% della capacità massima con il fluido operativo sperimentale durante la fase di priming. 
	NOTA: Questo livello di riempimento permette tassi di intrappolamento delle bolle più elevati pur mantenendo i porti di ingresso e di uscita immersi nel fluido operativo. La trappola per bolle indipendente dall'orientamento dispone di due porti laterali vicino al suo centroide che fungono da collegamenti diretti al sistema di flusso in circuito chiuso, e di un porto superiore compatibile con connettore Luer che permette un ulteriore riempimento della cavità quando viene aperto. Prima dell'inizio dell'esperimento, è fondamentale che il porto superiore della trappola per bolle indipendente dall'orientamento sia completamente sigillato utilizzando nastro in teflon e un tappo Luer, per garantire un sistema completamente chiuso.</li>
	<li>Tagliare quattro spezzoni di tubo in PVC lunghi 10 cm (1,59 mm di diametro interno × 3,18 mm di diametro esterno) per collegare tra loro tutti i componenti del circuito di flusso.&#160;</li>
	<li>Collegare un pezzo di tubo in PVC all'uscita della micropompa (la freccia indica il senso del flusso dall'ingresso all'uscita). Utilizzare un distanziatore rotondo in nylon nero da 3 mm (3,2 mm di diametro interno) attorno al tubo in PVC per fissarlo saldamente alla micropompa. Collegare l'altro estremo del tubo a uno dei due porti laterali della trappola per bolle indipendente dall'orientamento.&#160;</li>
	<li>Utilizzare il secondo pezzo&#160;di tubo in PVC per collegare l'altro porto laterale della trappola per bolle indipendente dall'orientamento all'adattatore a barbetta di ingresso del sensore di flusso liquido (la freccia indica il senso del flusso dall'ingresso all'uscita).&#160;</li>
	<li>Utilizzare il terzo pezzo di tubo in PVC per collegare l'adattatore a barbetta di uscita del sensore di flusso liquido (ovvero il lato verso cui punta la freccia) a un connettore Luer ad angolo.&#160;</li>
	<li>Collegare l'ultimo pezzo di tubo in PVC all'ingresso della stessa micropompa (la freccia indica il senso del flusso dall'ingresso all'uscita). Utilizzare un distanziatore rotondo in nylon nero da 3 mm (3,2 mm di diametro interno) attorno al tubo in PVC per fissarlo saldamente alla micropompa. Collegare l'altro estremo del tubo a un connettore Luer ad angolo. 
	NOTA: Tutti i tubi devono essere sostituiti tra un esperimento e l'altro.</li>
</ol>
3. Preparazione sperimentale e sterilizzazione del sistema
<ol>
	<li>Preparare un armadio a sicurezza biologica per il processo di sterilizzazione al fine di garantire la massima sterilità e sicurezza per la coltura cellulare.&#160;</li>
	<li>Preparare un tubo da centrifuga autosostenuto da 50 mL contenente etanolo al 70% e un altro tubo da centrifuga autosostenuto da 50 mL contenente acqua sterile per colture cellulari.</li>
	<li>Posizionare il microcontrollore in un piccolo sacchetto di plastica, lasciando uscire dal sacchetto il cavo della pompa e la micropompa. Utilizzare un fascetta stringicavo per sigillare il sacchetto di plastica e proteggere i componenti elettronici.&#160;</li>
	<li>Utilizzare un flacone spray contenente etanolo al 70% e tovaglioli di carta per sterilizzare l'esterno di tutti i componenti del circuito di flusso e di tutti gli altri materiali sperimentali. NON utilizzare lo spray di etanolo al 70% su alcun connettore elettrico. Posizionare immediatamente ogni componente e materiale all'interno dell'armadio a sicurezza biologica dopo averlo pulito con etanolo al 70%.&#160;</li>
	<li>Collegare una stazione informatica mobile al microcontrollore mediante un cavo USB da maschio a mini-USB e aprire l'applicazione informatica del microcontrollore per impostare la frequenza e la tensione delle due micropompe rispettivamente a 100 Hz e 240 V. Mantenere la micropompa&#160;spenta.</li>
	<li>Immergere direttamente il connettore Luer ad angolo collegato alla micropompa in un tubo da centrifuga autosostenuto da 50 mL contenente etanolo al 70%. Collegare una siringa da 12 mL, dotata di un raccordo Luer femmina-femmina, all'altro connettore Luer ad angolo dello stesso circuito di flusso.&#160;</li>
	<li>Pinzare manualmente il tratto di tubo in PVC che collega la micropompa al connettore Luer ad angolo e assicurarsi che il portello superiore del trappolabolle indipendente dall'orientamento sia sigillato con nastro in politetrafluoroetilene (Teflon) e&#160;un tappo Luer. Utilizzare l'altra mano per tirare la siringa da 12 mL di circa 5 mL per creare un vuoto sufficiente in tutto il sistema.&#160;</li>
	<li>Accendere la micropompa e rilasciare la pinza del passaggio precedente. Far passare 5 mL di etanolo al 70% fino alla siringa per garantire una sterilizzazione completa del sistema.&#160;</li>
	<li>Aprire il portello superiore del trappolabolle indipendente dall'orientamento per consentirne il riempimento con etanolo al 70%. Una volta che il trappolabolle indipendente dall'orientamento ha raggiunto una capacità di circa l'80% con etanolo al 70%, spegnere la pompa e sigillare completamente il portello superiore con nastro in Teflon e un tappo Luer. Agitare delicatamente il trappolabolle indipendente dall'orientamento per assicurarsi che l'interno sia completamente sterilizzato.&#160;</li>
	<li>Rimuovere il connettore Luer ad angolo dal tubo da centrifuga contenente etanolo al 70% e accendere la micropompa per svuotare il sistema. Una volta che tutto l'etanolo al 70% è stato aspirato nella siringa da 12 mL, scollegare il trappolabolle indipendente dall'orientamento dal sistema, rimuovere il tappo Luer e svuotare direttamente il trappolabolle indipendente dall'orientamento in un contenitore per rifiuti al fine di eliminare l'etanolo al 70%.&#160;</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.6 a 3.10 utilizzando il tubo da centrifuga autosostenuto da 50 mL&#160;contenente acqua sterile per colture cellulari al posto dell'etanolo al 70% e far passare 15 mL di acqua sterile per colture cellulari in ciascun circuito di flusso.</li>
</ol>
4. Prime del sistema e integrazione del canale microfluidico per cellule
<ol>
	<li>Al termine della sterilizzazione, mantenere il sistema all'interno della cappa a sicurezza biologica per la messa a vuoto con il fluido operativo.&#160;</li>
	<li>Immergere il connettore Luer ad angolo collegato alla micropompa direttamente in un contenitore di plastica (dimensioni approssimative 80 mm × 50 mm × 25 mm) riempito con 30 mL di mezzo di coltura cellulare. Collegare la siringa da 12 mL all'altro connettore Luer ad angolo dello stesso circuito di flusso utilizzando un raccordo Luer femmina-femmina.&#160;</li>
	<li>Utilizzare l'indice e il pollice della mano sinistra per bloccare il tratto di tubo in PVC Tygon che collega la micropompa al connettore Luer ad angolo, e con la mano destra estrarre la siringa da 12 mL di circa 5 mL per creare un vuoto sufficiente in tutto il sistema. Assicurarsi che il porto superiore del trappolabbie indipendente dall'orientamento sia sigillato con nastro in politetrafluoroetilene (Teflon) e&#160;un tappo Luer.&#160;</li>
	<li>Accendere la micropompa e rilasciare il morsetto del passaggio precedente. Far passare 5 mL di mezzo di coltura cellulare fino alla siringa per garantire una completa messa a punto del sistema.</li>
	<li>Aprire il porto superiore del trappolabbie indipendente dall'orientamento per consentirne il riempimento con il mezzo di coltura cellulare. Una volta che il trappolabbie indipendente dall'orientamento ha raggiunto circa l'80% della capacità con il mezzo di coltura cellulare, spegnere la pompa e sigillare completamente il porto superiore con nastro in Teflon e un tappo Luer.</li>
	<li>Posizionare il microcanale con coltura cellulare direttamente nel contenitore di plastica di dimensioni 80 mm × 50 mm × 25 mm e posizionare la barretta magnetica al centro del microcanale con coltura cellulare per impedirne il galleggiamento. Riempire il contenitore di plastica con ulteriore mezzo di coltura cellulare finché l'intero vetrino non risulti completamente immerso. 
	NOTA: Le cellule endoteliali sono state coltivate nello ibidi µ-Slide VI0.4 fino a una confluenza dell'80% seguendo protocolli standard prima dell'inserimento nel circuito di flusso16.</li>
	<li>Mantenendo immersi in mezzo di coltura cellulare i connettori Luer ad angolo di un circuito di flusso, accendere la micropompa relativa a quel circuito. Collegare con attenzione i connettori Luer ad angolo a uno dei microcanali e assicurarsi che non si formino bollicine d'aria nei punti di connessione. Al termine, spegnere la micropompa.</li>
</ol>
5.&#160;Alloggiamento per microcontrollore e micropompe (Opzionale)
<ol>
	<li>Utilizzare due viti in acciaio inossidabile M3 × 8, due rondelle in acciaio inossidabile M3 e due dadi in acciaio inossidabile M3 per fissare il supporto del traversino su misura alla piastra di montaggio inferiore su misura.&#160;</li>
	<li>Utilizzare quattro viti in acciaio inossidabile M3 × 12, quattro rondelle in acciaio inossidabile M3 e quattro dadi in acciaio inossidabile M3 per fissare la base dell'involucro in policarbonato alla piastra di montaggio inferiore su misura. Utilizzare otto rondelle in nylon M3 (due per ogni vite M3 × 12) per lasciare uno spazio ridotto tra la base dell'involucro e la piastra di montaggio inferiore.&#160;</li>
	<li>Utilizzare quattro viti M3, quattro distanziali esagonali in nylon maschio-femmina M3 e quattro dadi in acciaio inossidabile M3 per fissare il microcontrollore alla piastra di montaggio interna in acrilico su misura. Posizionare i distanziali esagonali in nylon tra la base del microcontrollore e la piastra di montaggio in acrilico.&#160;&#160;</li>
	<li>Utilizzare due viti in acciaio inossidabile testa cilindrica M3 × 8, due rondelle in acciaio inossidabile M3 e due dadi in acciaio inossidabile M3 per fissare il supporto del micropompa su misura alla parte superiore della piastra di montaggio interna in acrilico.&#160;</li>
	<li>Posizionare le micropompe nel supporto su misura in modo che la freccia sulle micropompe sia rivolta verso il driver della pompa.&#160;</li>
	<li>Utilizzare quattro viti in acciaio inossidabile testa cilindrica M3 × 8 e quattro rondelle in acciaio inossidabile M3 per fissare la piastra di montaggio interna in acrilico all'interno dell'involucro in policarbonato.&#160;</li>
	<li>Inserire quattro guarnizioni in gomma in un lato dell'involucro in policarbonato che presenta quattro fori consecutivi. Ripetere l'operazione sul lato opposto con quattro fori consecutivi.&#160;</li>
	<li>Utilizzare un etichettatrice per numerare le guarnizioni da 1 a 4 da sinistra a destra su entrambi i lati dell'involucro in policarbonato.</li>
	<li>Fissare due anelli O intorno alla parte filettata del cavo mini-USB maschio-femmina. Una volta completato, inserire l'estremità femmina del cavo mini-USB maschio-femmina attraverso il foro nell'involucro in policarbonato sullo stesso lato delle frecce delle micropompe. Fissare il lato femmina del cavo mini-USB maschio-femmina serrando un ulteriore anello O intorno alla parte filettata all'esterno dell'involucro in policarbonato.&#160;</li>
	<li>Chiudere ermeticamente il foro rimanente sul lato dell'involucro in policarbonato con del nastro adesivo universale. Il sistema assemblato è mostrato in Figura 2.&#160;</li>
</ol>
6. Piastra di montaggio del ponte superiore (Opzionale)
<ol>
	<li>Utilizzare quattro viti in acciaio inossidabile M2 × 8 e quattro dadi in acciaio inossidabile M2 per fissare due morsetti di montaggio del sensore di flusso alla piastra di montaggio superiore in acrilico su misura.&#160;</li>
	<li>Utilizzare quattro viti in acciaio inossidabile M3 × 12 e quattro dadi in acciaio inossidabile M3 per fissare due supporti per trappole a bolle indipendenti dall'orientamento, realizzati su misura, alla piastra di montaggio superiore in acrilico su misura.&#160;</li>
	<li>Utilizzare delle pinze per tagliare una barra filettata in acciaio M4 in quattro pezzi di circa 110 mm di lunghezza. Utilizzare questi quattro pezzi come montanti verticali per fissare la piastra di montaggio superiore sopra l'involucro in policarbonato.&#160;</li>
	<li>Utilizzare delle forbici per tagliare quattro pezzi di tubo in poliuretano di 40 mm di lunghezza (diametro esterno 6,35 mm). Far passare i pezzi della barra filettata in acciaio M4 attraverso questi tratti di tubo per garantire un'adeguata distanza tra la piastra di montaggio superiore e il coperchio dell'involucro in policarbonato.&#160;</li>
	<li>Con i supporti per trappole a bolle indipendenti dall'orientamento e i morsetti di montaggio rivolti verso l'alto, far passare uno dei quattro pezzi della barra filettata M4 a metà lunghezza attraverso ciascun angolo della piastra di montaggio superiore in acrilico su misura. All'estremità superiore di ciascun pezzo filettato, fissare un dado alato M4, un dado M4 e una rondella.&#160;</li>
	<li>Fare passare ciascun pezzo della barra filettata M4 attraverso un distanziale tondo in nylon nero da 6 mm (diametro interno 3,2 mm) e un pezzo di tubo in poliuretano da 40 mm di lunghezza. Infine, fissare un dado alato M4 alla base di ciascun pezzo della barra filettata M4. Disporre i componenti nell'ordine seguente: dado alato in acciaio M4, dado in acciaio inossidabile M4, rondella in acciaio inossidabile M4, piastra di montaggio superiore, distanziale tondo in nylon nero, tubo in poliuretano e un altro dado alato in acciaio M4.&#160;</li>
	<li>Utilizzare del nastro universale per fissare due semilavorati in acrilico da 75 mm di lunghezza × 25 mm di larghezza uno all'altro, faccia contro faccia, in modo che le lunghezze delle lastre di acrilico siano parallele tra loro.&#160;</li>
	<li>Utilizzare delle forbici per tagliare un tratto di nastro adesivo bicomponente in schiuma di 75 mm di lunghezza (25 mm di larghezza × 1,6 mm di spessore). Incollare un lato del nastro adesivo bicomponente in schiuma al semilavorato in acrilico da 75 mm × 25 mm in modo che la lunghezza del nastro in schiuma e la lunghezza del semilavorato in acrilico siano parallele tra loro.&#160;</li>
	<li>Utilizzare questo semilavorato in acrilico con nastro in schiuma come cuscinetto appoggiato sui connettori Luer a gomito del microslide per impedire che si allentino durante esperimenti di microgravità simulata. Tenere insieme il cuscinetto in acrilico con nastro in schiuma e il microslide mediante un supporto per microslide su misura.</li>
</ol>
7. Montaggio sulla macchina a posizionamento casuale (RPM)
<ol>
	<li>Utilizzare nastro adesivo doppia faccia in schiuma per fissare tutti i componenti del sistema di flusso sulla piastra di montaggio del RPM. Evitare di applicare il nastro direttamente sotto i microcanali per la coltura cellulare, in modo da consentire lo scambio gassoso cellulare durante l'esperimento. Assicurarsi che la microvetrina sia fissata al centro della piastra di montaggio, in modo che rimanga sugli assi di rotazione del RPM durante l'esperimento.&#160;</li>
	<li>Inserire la piastra di montaggio nella fessura più alta del telaio a U del RPM e fissare la piastra al telaio a U del RPM utilizzando la vite e la rondella fornite con il RPM.&#160;</li>
	<li>Utilizzare un connettore di uscita DB15 cablato in precedenza per collegare direttamente la stazione informatica al RPM, che a sua volta verrà collegato al microcontrollore e ai sensori di flusso del liquido mediante un secondo connettore di uscita DB15 già cablato.&#160; 
	NOTA: L'anello rotante del RPM collega i due connettori DB15, collegando in modo efficace la stazione informatica al microcontrollore e al sensore di flusso.</li>
	<li>Collegare i cavi di alimentazione per il microcontrollore e il sensore di flusso e fissare le lunghezze di cavo in eccesso con fascette stringicavo. I cavi devono essere fissati saldamente, ma assicurarsi che i collegamenti elettrici non siano sottoposti a tensione. Il sistema assemblato è mostrato in Figura 3.&#160;</li>
</ol>
8. Raccolta dei dati di flusso
<ol>
	<li>Aprire il software del sensore di flusso sulla stazione informatica per monitorare la portata.&#160;</li>
	<li>Utilizzare l'applicazione informatica del microcontrollore per regolare la tensione della pompa finché il sensore di flusso non indica la portata desiderata.</li>
	<li>Una volta impostata la portata, iniziare a registrare i dati di flusso per 24 h.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Di X, et al. Cellular mechanotransduction in health and diseases: from molecular mechanism to therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:282.</li>
	<li>Krittanawong C, et al. Human health during space travel: state-of-the-art review. Cells. 2023;12(1):40.</li>
	<li>Parafati M, et al. Human skeletal muscle tissue chip autonomous payload reveals changes in fiber type and metabolic gene expression due to spaceflight. NPJ Microgravity. 2023;9:77.</li>
	<li>Mair DB, Tsui JH, Higashi T, Kim D. Spaceflight-induced contractile and mitochondrial dysfunction in an automated heart-on-a-chip platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(40):e2404644121.</li>
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	<li>He X, et al. How to prevent bubbles in microfluidic channels. Langmuir. 2021;37(6):2187-2194.</li>
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</ol>

La trappola per bolle omnidirezionale è protetta dalla domanda di brevetto US 18634723. Non ci sono interessi concorrenti aggiuntivi.

È stato sviluppato un sistema microfluidico in ciclo chiuso, indipendente dall'orientamento, in grado di funzionare in assenza di gravità, dimostrandosi idoneo alla coltura di cellule endoteliali in condizioni fisiologiche di flusso. I componenti principali del sistema sono un microcontrollore, una micropompa, un sensore di flusso liquido, una microslitta per coltura cellulare e un intrappolatore di bolle personalizzato stampato in 3D, indipendente dall'orientamento.
Le trappole per bolle util...

È ormai ben consolidato, attraverso meccanismi ancora in fase di studio, che le forze meccaniche svolgono un ruolo fondamentale nella funzione cellulare e nel mantenimento dell'equilibrio tra salute e malattia1. Tra tutti gli stress ambientali, la forza di gravità è unica e giustamente considerata una grandezza costante e invariabile nella stragrande maggioranza delle ricerche biomediche. Tuttavia, il volo spaziale presenta un ambiente di microgravità unico, in cui il comportamento degli organismi può differire da quello osservato sulla Terra. Esperimenti nello spazio che coinvolgono animali e soggetti umani mostrano cambiamenti fisiologici significativi, evidenziando il ruolo della gravità nell'omeostasi cellulare e organica2.
Recentemente, la NASA e altre agenzie private hanno mostrato un notevole interesse nello sviluppo di chip per tessuti (o organi-su-un-chip) da impiegare nelle missioni spaziali3. I chip di tessuto sono progettati per imitare il in vivo architettura, permettendo loro di modellare con elevata fedeltà l'impatto fisiologico e meccanicistico della microgravità e delle radiazioni spaziali4Utilizzando cellule derivate da donatori, i chip tessutali possono anche essere impiegati per studiare la sensibilità dell'astronauta alla microgravità e alla radiazione spaziale e sviluppare contromisure preventive5Negli ultimi cinque anni, diversi sistemi organici, tra cui cervello, fegato, intestino, vasi sanguigni, cuore, rene e polmoni, sono stati modellati mediante tissue chip e lanciati a bordo della ISS6. in vivo, gli organi sono perfusi in misura variabile dalla vascolarizzazione, il che determina la loro fisiologia; ad esempio, il fegato è altamente vascolarizzato, mentre la cartilagine lo è molto meno. Pertanto, per riprodurre accuratamente la funzione organica in vitro, un aspetto fondamentale nello sviluppo dei sistemi organo-su-chip è l'integrazione del flusso di fluidi nei tessuti e nelle cellule.
La microfluidica è stata utilizzata per perfondere cellule e tessuti in sistemi organ-on-chip7,8. Livelli adeguati di flusso del fluido non solo favoriscono il trasporto dei nutrienti all'interno del sistema e l'eliminazione dei prodotti di scarto, ma mantengono anche lo stress fisiologico da taglio cui sono sottoposte le cellule. Tuttavia, su piccole scale, le bolle rappresentano una sfida persistente ai confini di fase, causando misurazioni inaccurate, danni e ostruzioni9. Per mitigare questo problema, sono stati impiegati trappole per bolle con design attivi (ad esempio, degasaggio a vuoto o campi esterni come quelli acustici o termici) e passivi (ad esempio, una membrana semipermeabile che dipende dalle proprietà superficiali)10,11. Tuttavia, questi design di debubber microfluidici aumentano la complessità di fabbricazione del dispositivo, compromettono l'integrità del campione e causano intasamenti e rotture della barriera. I problemi si aggravano nello spazio, dove la nucleazione e la formazione di bolle sono molto più pronunciate e le strategie di mitigazione delle bolle efficaci sulla Terra diventano largamente inefficaci12. Analoghi terrestri di microgravità possono essere generati mediante dispositivi come un reattore a parete rotante (RWV) o una macchina per posizionamento casuale (RPM)13,14. In particolare, nella RPM, il vettore gravitazionale viene continuamente riorientato, azzerando così quasi del tutto lo stimolo gravitazionale netto mediato nel tempo sul campione. Di recente, abbiamo descritto la progettazione, la fabbricazione e l'applicazione di una trappola per bolle indipendente dall'orientamento per la coltura in perfusione di cellule endoteliali sotto microgravità simulata mediante un RPM15. In questo articolo, descriviamo il montaggio e il funzionamento passo dopo passo di un sistema di perfusione in circuito chiuso che utilizza la trappola per bolle indipendente dall'orientamento e ne dimostriamo l'applicabilità nella coltura di cellule endoteliali venose umbilicali umane come modello per la coltura cellulare continua in microgravità simulata.
Il sistema a ciclo chiuso è costituito da un microcontrollore con un driver del motore per il funzionamento della micropompa controllato in frequenza e tensione, un sensore di flusso del liquido, un trappola per bolle15 e un canale microfluidico contenente cellule endoteliali aderenti. I componenti specifici sono descritti nella Tabella dei Materiali. I protocolli riportati di seguito descrivono il montaggio dell'elettronica del sistema (Passo 1), il montaggio della parte fluidica (Passo 2), la sterilizzazione e l'azionamento iniziale (Passo 3 e 4), l'integrazione della coltura cellulare microfluidica (Passo 4), il montaggio delle micropompe e del controllore (Passo 5) e l'assemblaggio dell'intero sistema all'interno di un contenitore (Passo 6). Il sistema di flusso a ciclo chiuso è stato montato sopra il RPM per simulare la microgravità utilizzando un contenitore appositamente progettato (Passo 7).

<table><tbody><tr><td>Etilene al 100%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4094&amp;nbsp;</td><td>Utilizzato per preparare una soluzione di etanolo al 70% per la sterilizzazione del sistema (Quantità minima necessaria: 35 mL)</td></tr><tr><td>Distanziale rotondo in nylon nero da 6 mm, diametro esterno 7 mm, diametro interno 3,2 mm</td><td>Exqutoo</td><td>ZH-0050</td><td>Fissa il supporto superiore all'involucro (Quantità minima necessaria: 4)</td></tr><tr><td>Piastra in acrilico, lunga 75 mm e larga 25 mm</td><td>Polymersan</td><td>ACRCS</td><td>Fissa gli adattatori Luer a gomito alla microcamera (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Cavo USB 2.0 da maschio A a mini-B</td><td>Ugreen Group Limited</td><td>10355</td><td>Per collegare il computer al microcontrollore (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Trappola per bolle</td><td>(Personalizzato)</td><td></td><td>Impedisce il passaggio di bolle alla microcamera (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Supporto per trappola per bolle</td><td>Personalizzato</td><td></td><td>Supporto stampato in 3D per mantenere fissa la trappola per bolle (Quantità minima necessaria: 2)</td></tr><tr><td>Acqua per colture cellulari</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25055CI</td><td>Utilizzata per rimuovere ogni traccia di etanolo dopo la sterilizzazione (Quantità minima necessaria: 30 mL)</td></tr><tr><td>Supporto per controller, pompa e involucro (supporto interno)</td><td>Personalizzato</td><td></td><td>Piastra di montaggio interna all'involucro (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Supporto barra trasversale</td><td>Personalizzato</td><td></td><td>Barra trasversale montata sulla piastra di fissaggio dell'involucro (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Connettori maschio e femmina DB15 con breakout</td><td>ANMBEST</td><td>ANMBEST_MDDB15</td><td>Per collegare il computer alla macchina a posizionamento casuale e poi al microcontrollore (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Connettore Luer a gomito da maschio a barb</td><td>ibidi</td><td>10802</td><td>Collega la microcamera al circuito di flusso (Quantità minima necessaria: 2)</td></tr><tr><td>Nastro adesivo doppio foglio in schiuma</td><td>3M</td><td>4026</td><td>Per comprimere gli adattatori Luer a gomito sulla microcamera (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Involucro (60 mm x 140 mm x 140 mm)</td><td>Hammond</td><td>1554Q2GYCL</td><td>Contiene il microcontrollore e le micropompe (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Supporto per involucro (supporto inferiore)</td><td>Personalizzato</td><td></td><td>Piastra di montaggio sotto l'involucro (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Coppia Luer femmina-femmina</td><td>Boao</td><td>Boao-Syringes-WAD2354</td><td>Utilizzata per collegare la siringa al connettore Luer a gomito per l'irrorazione del mezzo di coltura cellulare (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Mezzo di coltura cellulare Gibco RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875093</td><td>Utilizzato per coltivare le cellule endoteliali (Quantità minima necessaria: 50 mL)</td></tr><tr><td>Guarnizioni, diametro foro 9/16", spessore 1/8", diametro interno 1/8"</td><td>McMaster-Carr</td><td>9307K863</td><td>Per far passare i tubi dentro e fuori dall'involucro (Quantità minima necessaria: 8)</td></tr><tr><td>Adattatore IDEX P-646, da barb 1/16" a 1/4-28</td><td>IDEX</td><td>P-646</td><td>Collega il sensore di flusso al circuito di flusso (Quantità minima necessaria: 2)</td></tr><tr><td>Sensore di flusso liquido</td><td>Sensirion</td><td>SLF3-1300F</td><td>Per la raccolta dei dati di flusso (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Pinza di fissaggio per sensore di flusso liquido</td><td>Sensirion</td><td>SLF3x Mounting Clamp</td><td>Supporto SLF3x (Quantità minima necessaria: 2)</td></tr><tr><td>Siringa con blocco Luer (12 mL)</td><td>McKesson</td><td>414624</td><td>Per l'irrorazione sotto vuoto (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Chiusino Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-50110-33</td><td>Per sigillare le trappole per bolle indipendenti dall'orientamento (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Dado in acciaio inossidabile M2</td><td>VIGRUE</td><td>B07PJQC7T6</td><td>Fissa i sensori di flusso liquido al supporto superiore (Quantità minima necessaria: 4)</td></tr><tr><td>Vite in acciaio inossidabile M2&amp;times;8</td><td>VIGRUE</td><td>B07PJQC7T6</td><td>Fissa i sensori di flusso liquido al supporto superiore (Quantità minima necessaria: 4)</td></tr><tr><td>Distanziale esagonale in nylon maschio-femmina M3</td><td>Meijubol</td><td>B0GC6GN9S7</td><td>Fissa la mp-Multiboard al supporto interno (Quantità minima necessaria: 4)</td></tr><tr><td>Guarnizione in nylon M3</td><td>Sutemribor</td><td>7.81573E+11</td><td>Fissa l'involucro al supporto inferiore (Quantità minima necessaria: 16)</td></tr><tr><td>Dado in acciaio inossidabile M3</td><td>VIGRUE</td><td>B07PJQC7T6</td><td>Fissa l'involucro al supporto inferiore, la barra trasversale al supporto inferiore, il supporto pompa al supporto interno (Quantità minima necessaria: 16)</td></tr><tr><td>Guarnizione in acciaio inossidabile M3</td><td>VIGRUE</td><td>B07PJQC7T6</td><td>Fissa la barra trasversale al supporto inferiore, l'involucro al supporto inferiore e interno, il supporto interno al supporto pompa (Quantità minima necessaria: 12)</td></tr><tr><td>Vite a testa bombata in acciaio inossidabile M3&amp;times;12</td><td>VIGRUE</td><td>B07PJQC7T6</td><td>Fissa l'involucro al supporto inferiore (Quantità minima necessaria: 4)</td></tr><tr><td>Vite a testa cilindrica in acciaio inossidabile M3&amp;times;12</td><td>Fgruh</td><td>FG001-3</td><td>Fissa il supporto per trappola per bolle al supporto superiore (Quantità minima necessaria: 2)</td></tr><tr><td>Vite a testa piana Phillips M3&amp;times;6</td><td>Meijubol</td><td>B0GC6GN9S7</td><td>Fissa la mp-Multiboard al supporto interno (Quantità minima necessaria: 4)</td></tr><tr><td>Vite in acciaio inossidabile M3&amp;times;8</td><td>VIGRUE</td><td>B07PJQC7T6</td><td>Fissa la barra trasversale al supporto inferiore, l'involucro al supporto interno, il supporto pompa al supporto interno (Quantità minima necessaria: 8)</td></tr><tr><td>Dado in acciaio inossidabile M4</td><td>VIGRUE</td><td>B07PJQC7T6</td><td>Fissa il supporto superiore all'involucro (Quantità minima necessaria: 4)</td></tr><tr><td>Guarnizione in acciaio inossidabile M4</td><td>VIGRUE</td><td>B07PJQC7T6</td><td>Fissa il supporto superiore all'involucro (Quantità minima necessaria: 4)</td></tr><tr><td>Barra filettata in acciaio M4-0,7</td><td>Arwnnklo</td><td>AR01</td><td>Da tagliare in pezzi di circa 6 pollici (Quantità minima necessaria: 4)</td></tr><tr><td>Cavo mini USB da maschio a femmina</td><td>Plinkwirekb</td><td>PCM-0725-L</td><td>Per collegare il computer al microcontrollore (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Connettore angolare mini USB da maschio a femmina</td><td>UCEC</td><td>4326453558</td><td>Per collegare il computer al microcontrollore (opzionale) (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Supporto per microcanale</td><td>Personalizzato</td><td></td><td>Supporto stampato in 3D per mantenere centrato il microcanale (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Microcamera, &amp;micro;-slide VI 0,4</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>Per saggi cellulari in condizioni di flusso (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Micropompa</td><td>Bartels</td><td>MP6-HYB</td><td>Per generare flusso (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Supporto per micropompa</td><td>Personalizzato</td><td></td><td>Fissaggio per mantenere ferma la micropompa (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>mp-Multiboard con mp-Highdriver4</td><td>Bartels</td><td>BM-E-0005</td><td>Per controllare frequenza e tensione delle micropompe (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Cavo mp-pompa</td><td>Bartels</td><td>BM-A-0055</td><td>Utilizzato per collegare elettricamente la mp-Multiboard alle micropompe (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Distanziale rotondo in nylon, diametro esterno 7 mm, diametro interno 3,2 mm</td><td>Harfington</td><td>2037015</td><td>Per fissare i tubi alla micropompa (Quantità minima necessaria: 2)</td></tr><tr><td>O-ring</td><td>ZDBB</td><td>7.17327E+11</td><td>Fissa il cavo mini USB da maschio a femmina all'involucro (opzionale)&amp;nbsp; (Quantità minima necessaria: 3)</td></tr><tr><td>Contenitore in plastica</td><td>Herdusa</td><td>HDS10 PLASTIC BOX</td><td>Utilizzato come serbatoio aperto per il mezzo di coltura cellulare (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Tubo in poliuretano, diametro interno 1/8", diametro esterno 1/4"</td><td>PARKER</td><td>95U-4-062-BLU-0100</td><td>Fissa il supporto superiore all'involucro (Quantità minima necessaria: 1,6 cm)</td></tr><tr><td>Macchina a posizionamento casuale</td><td>AIRBUS</td><td></td><td>Macchina a posizionamento casuale 2.0 (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Cavo SCC1-USB</td><td>Sensirion</td><td>SCC1-USB 2M</td><td>Collega i sensori di flusso liquido al computer (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Provetta per centrifuga autosostenuta</td><td>PEKYBIO</td><td>B0C13GZVD6</td><td>Utilizzata per contenere acqua per colture cellulari/etanolo al 70% (Quantità minima necessaria: 2)</td></tr><tr><td>Distanziale in alluminio, diametro esterno 8 mm, lunghezza 20 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td>94669A062</td><td>Quantità minima necessaria: 4</td></tr><tr><td>Tubo in PVC Tygon da 1/16" di diametro interno x 1/8" di diametro esterno</td><td>Saint-Gobain</td><td>B-44-3</td><td>Collega tutti i componenti del circuito di flusso (Quantità minima necessaria: 40 cm)</td></tr><tr><td>Supporto superiore</td><td>Personalizzato</td><td></td><td>Piastra di montaggio collegata ai sensori di flusso e alla trappola per bolle (Quantità minima necessaria: 1)</td></tr><tr><td>Dado a farfalla, M4 x 0,7 mm, in acciaio zincato</td><td>Siptenk</td><td>S-TH-DLM-002</td><td>Fissa il supporto superiore all'involucro (Quantità minima necessaria: 4)</td></tr><tr><td>Fascetta stringitubo</td><td>HAVE ME TD</td><td>7.32073E+11</td><td>Fissa i cavi durante il montaggio del sistema sulla macchina a posizionamento casuale (Quantità minima necessaria: 4)</td></tr></tbody></table>

una piattaforma per la coltura continua di cellule endoteliali in condizioni di flusso fisiologico in microgravità simulata

A Platform for the Continuous Culture of Endothelial Cells Under Physiological Flow Conditions in Simulated Microgravity

I sistemi microfisiologici (MPS) sono modelli in vitro preziosi che ricreano la struttura e la funzione dei tessuti umani. In particolare, i modelli di tessuto o organo-su-cip che incorporano la tecnologia microfluidica riproducono l'ambiente meccanico e biochimico in vivo, consentendo al contempo il monitoraggio in tempo reale della crescita e dello sviluppo cellulare. Questi sistemi possono essere particolarmente utili per studi in condizioni di volo spaziale, poiché possono essere inviati nello spazio, ad esempio sulla Stazione Spaziale Internazionale (ISS), per indagare l'impatto del viaggio spaziale sul corpo umano. Un ostacolo significativo al successo degli MPS è la formazione di bolle, che può risultare accentuata in microgravità. Questo articolo descrive la progettazione, l'assemblaggio e il funzionamento di un sistema microfisiologico per la coltura cellulare da utilizzare in condizioni di microgravità simulata (ad esempio, operato su una macchina a posizionamento casuale o clinostato). L'inserimento di un trappolabolle indipendente dall'orientamento nel circuito fluidico si è dimostrato altamente efficace nella rimozione delle bolle d'aria in microgravità e nella realizzazione di colture a lungo termine di cellule endoteliali. Questo sistema microfluidico chiuso e indipendente dall'orientamento può essere impiegato per l'operazione priva di bolle di chip tessutali o organi-su-cip, al fine di simulare gli effetti combinati di microgravità e flusso, oppure per il loro impiego in missioni spaziali.

Prima di raccogliere dati su fluidica o colture cellulari, come descritto in seguito, l'integrità del sistema deve essere verificata a ogni punto critico del protocollo durante le fasi di assemblaggio e di prime. Le connessioni elettroniche possono essere facilmente controllate collegando il microcontrollore e il sensore di flusso liquido a un computer e comunicando con ciascun componente tramite il relativo software applicativo. Le connessioni dei tubi sui raccordi a barbetta sono considerate adeguate quando il tubo è s...

Qui presentiamo un protocollo per la progettazione, l'assemblaggio e il funzionamento di un dispositivo microfluidico in circuito chiuso, privo di bolle, per la coltura di cellule endoteliali in condizioni di flusso fisiologico sotto microgravità simulata.

Una piattaforma per la coltura continua di cellule endoteliali in condizioni di flusso fisiologico in microgravità simulata

I sistemi microfisiologici (MPS) sono preziosi modelli in vitro che ricreano la struttura e la funzione dei tessuti umani. Nello specifico, i sistemi a base di tessuti o...

Sviluppiamo sistemi microfluidici per la coltura endoteliale continua al fine di studiare come la microgravità simulata e il flusso fisiologico influenzino la funzione cellulare. I sistemi esistenti presentano difficoltà nello studio del flusso venoso in microgravità e con formazione di bolle. Questa piattaforma consente una coltura continua senza bolle in entrambe le condizioni.Collegare innanzitutto il driver della pompa e il cavo della pompa al microcontrollore e fissare la micropompa al cavo della pompa. Collegare la scheda nano e il sensore di flusso del liquido a un computer che contenga le rispettive applicazioni. Prima di iniziare la preparazione sterile, collegare la stazione informatica mobile al microcontrollore utilizzando il cavo mini USB, mantenendo i cavi USB e della pompa accessibili all'esterno della borsa protettiva. Impostare la frequenza e l'ampiezza di ciascuna micropompa secondo le indicazioni del produttore o secondo valori calibrati noti per le condizioni di pompaggio desiderate.Preparare quattro tratti di tubo in PVC lunghi 10 centimetri per i collegamenti. Lasciare il trappolabolle vuoto durante il montaggio a secco. Riempirlo fino a circa l'80% con il flu

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Un metodo per la cultura un monostrato di cellule endoteliali durante l'intera superficie interna 3D di un dispositivo a microfluidi con microvascolare canali di dimensioni (&lt;30 micron) è descritta.

Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

Una piattaforma microcanali-on-a-chip è stato sviluppato dalla combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica. La piattaforma microcanali endothelialized imita il tridimensionale (3D) geometria in vivo microvasi, corre sotto flusso perfusione continua controllato, permette l'imaging di alta qualità e in tempo reale e può essere applicato per la ricerca microvascolare.

Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

Le cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state coltivate fino alla confluenza all'interno di un dispositivo di rete microfluidica. Sono state illustrate le distribuzioni della giunzione delle cellule endoteliali e della F-actina e sono stati quantificati in tempo reale a livello di singola cellula le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio e della produzione di ossido nitrico in risposta all'adenosina trifosfato (ATP).

Sviluppo e caratterizzazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E ossido nitrico Produzione

Questo manoscritto presenta un metodo di stampaggio ad iniezione di progettare microvasi che ricapitolano le proprietà fisiologiche di endotelio. Il processo di microfluidica-based crea reti vascolari brevetto 3D con condizioni tailorable, come il flusso, composizione cellulare, la geometria, e gradienti biochimici. Il processo di fabbricazione ed esempi di possibili applicazioni sono descritte.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

Il protocollo descrive come progettare una rete vascolare perfusable in uno sferoide. Microambiente circostante di sferoide è inventato per indurre l'angiogenesi e collegare la sferoide a microcanali in un dispositivo microfluidico. Il metodo consente la perfusione della sferoide, che è una tecnica tanto atteso nelle culture tridimensionale.

Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico

Questo studio descrive il monitoraggio microscopico dell'aderenza allo pneumococco alle stringhe del fattore von Willebrand prodotte sulla superficie di cellule endoteliali primarie umane differenziate sotto stress da taglio in condizioni di flusso definite. Questo protocollo può essere esteso alla visualizzazione dettagliata di specifiche strutture cellulari e alla quantificazione dei batteri applicando procedure di immunostaining differenziale.

Infezione da pneumococco delle cellule primarie endoteliali nel flusso costante

Questo protocollo presenta un metodo per la coltura e la crescita 3D di cellule simili agli ameloblasti in microgravità per mantenere la loro forma allungata e polarizzata e l'espressione proteica specifica dello smalto. Sono inoltre descritte le condizioni di coltura per la coltura dei costrutti di ingegneria parodontale e degli organi polmonari in microgravità.

Propagazione di cellule e organi dentali e respiratori in microgravità

Questo protocollo descrive una piattaforma di coltura cellulare riconfigurabile basata su membrana che integra il formato a pozzetto aperto con capacità di flusso del fluido. Questa piattaforma è compatibile con i protocolli standard e consente transizioni reversibili tra le modalità di coltura a pozzetto aperto e microfluidica, soddisfacendo le esigenze dei laboratori di ingegneria e bioscienze.

Trasformazione di modelli di tessuto barriera statico in sistemi microfisiologici dinamici

Abbiamo sintetizzato e caratterizzato un substrato sintonizzabile a base di gelatina per la coltura di cellule endoteliali vascolari (EC) in condizioni di flusso vascolare rilevanti. Questa superficie biomimetica replica sia le condizioni fisiologiche che quelle patologiche, consentendo lo studio delle forze meccaniche sul comportamento EC e facendo progredire la nostra comprensione della salute vascolare e dei meccanismi delle malattie.

Modello in vitro che integra la rigidità e il flusso del substrato per studiare le risposte delle cellule endoteliali

Qui presentiamo un protocollo per fabbricare e operare un sistema microfluidico che espone le cellule endoteliali a iperglicemia oscillatoria sincronizzata e a stress di taglio pulsatile. Questo approccio fornisce un modello in vitro fisiologicamente rilevante per lo studio della disfunzione endoteliale diabetica. Questo protocollo consente la misurazione quantitativa dello stress ossidativo e delle risposte delle cellule endoteliali.

Un sistema microfluidico per modellare la disfunzione endoteliale sotto stress fisiologico di taglio pulsatile combinato e iperglicemia oscillatoria

Scopri un sistema microfisiologico con trappola per bolle indipendente dall'orientamento per la coltura continua di cellule endoteliali in microgravità simulata. Questa piattaforma avanzata supporta esperimenti di lunga durata nelle missioni spaziali.

Una piattaforma per la coltura continua di cellule endoteliali in condizioni di flusso fisiologico in microgravità simulata

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