Name: Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Scopri come analizzare i complessi della catena respiratoria mitocondriale nelle cellule staminali embrionali umane utilizzando saggi di attività in gel. Questo metodo consente di studiare la funzione mitocondriale in vitro.

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Embrionali umane studi sulle cellule staminali in laboratorio Teitell sono attualmente supportati da un Istituto della California per medicina rigeneratrice (CIRM) sementi concedere RS1-00313. Ringraziamo il Dott. Carla Koehler (UCLA) e membri del laboratorio Koehler per fornire consigli e approfondimenti in questi e altri studi.

Alta Electophoresis risoluzione nativa gel trasparente (hrCNE) per complessi mitocondriale In-Gel Attività saggi Cellule staminali embrionali umane (hESC) sono stati mantenuti su un monostrato di ˠ-irradiati o mitomicina C trattati con fibroblasti embrionali di topo (MEF), poi passati a una crescita su Matrigel per 5 giorni in MEF condizionata media con condizioni standard. Per rimuovere i contaminanti MEF, hESC sono stati ri-placcato su Matrigel e cresciuto in MEF condizionata medio per altri 3 giorni. Microscopia di immunofluorescenza per i marcatori pluripotenza Oct-4 e SSE-4 è stato utilizzato per confermare la mancanza di differenziazione hESC. <ol><li> Lavare le cellule con caldo 1x PBS, pH 7,4, seguita da tripsinizzazione (1x 1 ml di tripsina per bene in un 6-pozzetti) per 5 min. </li><li> Aggiungere un uguale volume di fresca inibitore della tripsina (1mg/ml in 1x PBS, pH 7,4). Celle di raccolta e centrifugare a 200g, 5 min, temperatura ambiente. </li><li> Eliminare le cellule surnatante e risospendere pellet in 0,8 - 1.7ml (in base alle dimensioni del pellet) di tampone di ghiaccio freddo isolamento dei mitocondri (83mm saccarosio; 6,6 mm imidazolo / HCl, pH 7,0) con appena preparato 1 &#39;Cocktail di inibitori della proteasi. Incubare in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Dounce cellule con un omogeneizzatore (~ 40 - 50 colpi). Macchia una aliquota di cellule dounced con trypan blu per verificare la completezza di omogeneizzazione utilizzando un microscopio ottico. </li><li> Centrifugare a 20.000 g per 10 minuti a 4 ° C per ottenere un grezzo mitocondriale pellet che contiene anche i nuclei e frammenti di cellule più grandi. Decantare e scartare il surnatante e pesare il greggio precipitato a pellet mitocondriale. Il pellet può essere conservato a -80 ° C a seguito immediato congelamento in azoto liquido, se questo è un punto di arresto. NOTA: centrifugazione differenziale o altri gradiente basato su procedure possono essere utilizzate per l&#39;isolamento e la raccolta di una frazione pura membrana mitocondriale. Vedi rif. 4 per i dettagli. Questo approccio alternativo produrrà l&#39;attività mitocondriale complesso per mg di proteina mitocondriale invece di complessa attività per mg di peso cellulare o numero di cellulare. La concentrazione di proteine ​​mitocondriali dovrà essere determinato dopo la purificazione per fare questo confronto. Inoltre, un buffer di isolamento diversi possono essere richiesti per questo approccio. Per la solubilizzazione della frazione pura membrana mitocondriale, vedere la nota seguente punto 6. </li><li> Solubilizzare il greggio mitocondriale pellet su ghiaccio con il vortex con il tampone di solubilizzazione ghiaccio freddo (50 mM NaCl, 50 mM imidazolo / HCl pH 7.0, 1mM EDTA, 2mM 6-aminohexanoic acido). L&#39;acido 6-aminohexanoic può essere sostituito con il Cocktail 1x inibitore della proteasi. L&#39;uso 35μl di tampone solubilizzazione per 20 mg di peso a pellet. Aggiungere 20μl del 10% w / v digitonina per 20 mg di peso a pellet e mescolare muovendo il tubo. Incubare per 5-10 minuti sul ghiaccio. Dodecil-BD-maltoside o Triton X-100 può essere sostituito per digitonina per solubilizzare le proteine. La scelta del detersivo e la sua quantità può influenzare la formazione di supercomplexes o forme multimerica di complessi mitocondriali. Per ulteriori informazioni, vedere rif.1. NOTA: La quantità di detersivo necessaria per solubilizzare una frazione pura membrana mitocondriale corrisponde ad un detergente / proteine ​​di peso che varia dai 2-6g / g. Il rapporto ottimale per solubilizzare le membrane mitocondriali è 2.5g / g per dodecil-BD-maltoside, 3g / g per Triton X-100, e 6 g / g per digitonina. </li><li> Centrifugare il pellet solubilizzato a 100.000 g per 15 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante. </li><li> Aggiungi il caricamento del buffer ad una finale del 5% w / v glicerolo e 0,01% w / v Ponceau S (uso un 50% w / v glicerolo, 0,1% w / v tampone Ponceau S soluzione di carico magazzino). </li><li> Carico pozzi gel con un volume che contiene i 20-40mg del greggio mitocondriale pellet per corsia. Utilizzare un gel gradiente di acrilammide (4 -13%) con un 3,5% stacking gel. NOTA: preparazione gel elettroforesi e condizioni: Per la preparazione di gel, utilizzare un acrilamide / bis-acrilamide (AA / bisAA) 3 miscela come segue: 48 g di acrilamide e 1,5 g di bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Se T è la concentrazione totale di AA e bisAA e C è la percentuale di reticolante (bisAA) per monomero totale). Gel tampone (3 &#39;): 1,5 M 6-aminohexanoic acido; 75mm imidazolo, pH 7,0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;" border="0"><tbody><tr><td> Gradiente di gel: </td><td> 4% </td><td> 13% </td><td> Stacking gel: </td><td> 3,5% </td></tr><tr><td> AA / bisAA 3 mix </td><td> 2 ml </td><td> 6,5 ml </td><td></td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td> Gel tampone 3 &#39; </td><td> 8,3 ml </td><td> 8,3 ml </td><td></td><td> 2,7 ml </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td></td><td> 5 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14,7 ml </td><td> 5 ml </td><td></td><td> 4,7 ml </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td></td><td> 8 ml </td></tr><tr><td> 10% di APS </td><td> 139 microlitri </td><td> 125 microlitri </td><td></td><td> 67 microlitri </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 microlitri </td><td> 12,5 microlitri </td><td></td><td> 6,7 microlitri </td></tr></tbody></table> Anodo buffer: 25mM imidazolo / HCl, pH 7,0 Catodo buffer: Tricine 50mm, 7.5mm imidazolo / HCl, 0,02% w / v dodecil-BD-maltoside, 0,05% w / v desossicolato, pH 7,0 Versare ed eseguire gel in una stanza fredda (4-7 ° C). La tensione iniziale utilizzato è 100V. Quando il campione è entrato nel gel impilati, la tensione è aumentata a 500V con la corrente limitata a 15mA (per 0,15 &#39;14&#39; 14 cm di gel). Elettroforesi viene arrestata dopo 3-4 ore quando la linea netta di colorante rosso del Ponceau S si avvicina alla parte anteriore gel. In alternativa, un gel può essere eseguito durante la notte con tensione costante a 70-100V. <ol><li> In-gel attività saggi. Il tempo di incubazione per ogni test dipende dall&#39;efficienza di solubilizzazione delle proteine ​​e la quantità di materiale caricato per bene. Complessi I, IV e V di solito resa più forti segnali di complessi II e III. </li></ol> Complesso I (CI) Incubare la fetta gel con CI tampone (5mm Tris-HCl, pH 7.4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) a temperatura ambiente per diverse ore. IC buffer: Aggiungere per 100 ml di 5mM Tris-HCl, pH 7,4: 0.01g NADH 0,25 g NBT Fissare il gel in metanolo al 50% e 10% di acido acetico per 15-45 min. Il gel fisso è conservata nel 10% di acido acetico. Complesso II (CII) Incubare la fetta gel con CII buffer (20 mM di sodio succinato; methasulfate phenazine 0,2 mm; 2.5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) a temperatura ambiente per diverse ore. CII buffer: Aggiungi 5mM per 100 ml di Tris-HCl, pH 7,4: 200μl succinato di sodio 1M 80μl methasulfate phenazine (PMS 250mm sciolto in DMSO) 0,25 g NBT Fissare il gel come descritto per il complesso I Complesso III (CIII) Incubare la fetta gel con CIII tampone (fosfato di sodio 50mM, pH 7,2, 0,05% 3,3 &#39;-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB)) a temperatura ambiente per diverse ore. CIII buffer: Aggiungere per 100 ml di 50 mM di sodio-fosfato, pH 7,2: 50mg diaminobenzidina tetraidrocloruro Fissare il gel come descritto per il complesso I Complesso IV (CIV) Incubare la fetta gel con CIV tampone (fosfato di sodio 50mM, pH 7,2, 0,05% 3,3 &#39;-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB), 50 micron cavallo cuore citocromo c) a temperatura ambiente per diverse ore. CIV buffer: Aggiungere per 100 ml di 50 mM di sodio-fosfato, pH 7,2: 50mg diaminobenzidina tetraidrocloruro 0.1g cavallo cuore citocromo c Fissare il gel come descritto per il complesso I Complesso V (CV) Incubare la fetta gel con CV buffer (Tris-base da 35 mm, 270 mm glicina, pH 8.3 a 25 ° C, 14 mm MgSO 4, 0,2% w / v Pb (NO 3) 2, 8 mm ATP) a temperatura ambiente per diverse ore. CV buffer: 100 ml di soluzione Per aggiungere: <table border="0"><tbody><tr><td> Tris-base </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> Glicina </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> Pb (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> Non è necessario aggiustare il pH (dovrebbe essere 8.3) - non usare l&#39;acido o di base. Filtrare e aggiungere <table border="0"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> Fissare il gel in metanolo al 50% per 30 min e trasferimento in acqua.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

In questo video, che abbiamo descritto l&#39;estrazione di complessi proteici mitocondriali di cellule staminali embrionali umane, la loro separazione da alte elettroforesi su gel chiaro risoluzione nativa (hrCNE), e la successiva analisi di in-gel saggi di attività catalitica. hrCNE risolve complessi proteici della membrana mitocondriale con una risoluzione paragonabile a quella di blu elettroforesi su gel nativi ed è superiore per in-gel prove di attività. Questa tecnica può essere utilizzato non solo per quantificare respiratoria mitocon...

<table><tbody><tr><td>EDTA 0,5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>regolare il pH a 8,0 con NaOH</td></tr><tr><td>NaCl 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Succinato di sodio 1 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>Tampone fosfato di sodio 0,1 M, pH 7,2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 e BP329-1</td><td>Mischiare 68,4 ml di Na2HPO4 1 M e 31,6 ml di NaH2PO4 1 M per preparare un tampone fosfato di sodio 0,1 M con pH 7,2 a 25 °C</td></tr><tr><td>Tricina 1 M, pH 7,0 (regolato con NaOH)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>conservare a 4 °C</td></tr><tr><td>Imidazolo/HCl 1 M, pH 7,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>conservare a 4 °C</td></tr><tr><td>Tris-HCl 1 M, pH 7,4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil-β-D-maltoside (DDM) al 20% (p/v)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>Sciogliere in acqua. Conservare aliquote da 1 ml a &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Digitonina al 10% (p/v) (&amp;gt;50% di purezza, utilizzata senza ricristallizzazione)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>Sciogliere in acqua. Conservare aliquote da 0,1&amp;#8211;1 ml a &amp;#8211;20 °C. Deve essere riscaldata fino a 95 °C prima dell'uso.</td></tr><tr><td>6-aminocaproico 2 M</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>conservare a 4 °C</td></tr><tr><td>Soluzione madre di Ponceau S/glicerolo 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 e G6279-1L</td><td>Ponceau S 0,1%, glicerolo 50% (p/v) in acqua.</td></tr><tr><td>Deossicolato di sodio al 10% p/v</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>Sciogliere in acqua. Deve essere protetto dalla luce. Regolare il pH a 7,0 con HCl, filtrare e conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Fenazina metasolfato (PMS) 250 mM</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>Sciogliere in DMSO ed effettuare aliquote. Conservare a &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Nitroblu di tetrazolio (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diamminobenzidina tetracloridrato (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&amp;rsquo;-trifosfato sale disodico (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Grado I, minimo 99%</td></tr><tr><td>β-nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) forma ridotta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c da cuore di cavallo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inibitore delle proteasi 100x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Conservare a &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Colorante blu di tripano 0,4%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 10x (0,5%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

I mitocondri sono organelli citoplasmatici che hanno un ruolo primario nel metabolismo cellulare e l&#39;omeostasi, la regolamentazione della rete di segnalazione cellulare, e la morte cellulare programmata. I mitocondri producono ATP, regolare lo stato redox citoplasmatico e Ca2 + equilibrio, catabolizzare acidi grassi, sintesi dell&#39;eme, nucleotidi, ormoni steroidi, amminoacidi, e aiutare assemblare ferro-zolfo in proteine. I mitocondri hanno anche un ruolo essenziale nella produzione di calore. Le mutazioni del genoma mitocondriale causa diversi tipi di disturbo umano. L&#39;accumulo di mutazioni del mtDNA è correlata con l&#39;invecchiamento e si sospetta di avere un ruolo importante nello sviluppo del cancro. Grazie al loro ruolo di vitale importanza in tutti i tipi di cellule, la funzione dei mitocondri devono anche essere critico per le cellule staminali. Progressi fondamentali sono stati fatti nella comprensione della vitalità delle cellule staminali, proliferazione, e la capacità di differenziazione. Ma l&#39;attività funzionale delle cellule staminali, in particolare il loro stato di energia, non era ancora stato studiato in dettaglio. Quasi nulla si sa circa le proprietà mitocondriale di cellule staminali embrionali umane (hESC) e la loro progenie precursore differenziata. Un modo per comprendere e valutare il ruolo dei mitocondri nella funzione hESC e potenziale di sviluppo è quello di misurare direttamente l&#39;attività dei complessi respiratori mitocondriali. Qui, descriviamo alta elettroforesi su gel chiaro risoluzione nativa e la successiva visualizzazione in attività di gel come un metodo per analizzare i cinque complessi della catena respiratoria di hESC.

In questo video vi mostreremo come il complesso della catena respiratoria mitocondriale di cellule staminali embrionali umane possono essere analizzati utilizzando nelle prove di attività gel.

Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane

I mitocondri sono organuli citoplasmatici che svolgono un ruolo primario nel metabolismo e nell'omeostasi cellulare, nella regolazione della rete di segnalazione cellulare e...

I mitocondri svolgono numerose funzioni nella fisiologia cellulare, dal metabolismo e produzione di energia alla morte cellulare programmata e alla sintesi degli ormoni steroidei. Nonostante l'importanza dei mitocondri sia nelle funzioni cellulari fondamentali che nelle malattie, si conosce ancora molto poco sulla loro funzione nelle cellule staminali embrionali umane e nei loro derivati differenziati. In questo video, vi mostreremo come analizzare i complessi della catena respiratoria mitocondriale delle cellule staminali umane mediante saggi di attività enzimatica in gel.Ciao, sono Ivan OV del laboratorio di Michael Tetel del Dipartimento di Anatomia Patologica e Medicina di Laboratorio dell'Università della California di Los Angeles. Oggi vi mostreremo un procedimento per valutare la funzione dei complessi respiratori mitocondriali in cellule staminali embrionali umane. Questo metodo di valutazione dell'attività in gel prevede l'isolamento di un estratto mitocondriale grezzo da cellule staminali embrionali umane, la separazione dei complessi mitocondriali del sistema di fosforilazione ossidativa mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide nativo chiaro ad alta risoluzione e successivamente la rivelazione dell'attività in gel.Iniziamo. Il primo passaggio di questa procedura consiste nell'isolare i mitocondri da cellule staminali embrionali umane. Per questo saggio, utilizzeremo cellule staminali embrionali umane coltivate su una piastra rivestita con matrigel in condizioni senza feeder.Per raccogliere i mitocondri dalle nostre cellule staminali umane, iniziamo lavandole con PDS caldo 1x a pH 7,4 e quindi trattando le cellule con tripsina per cinque minuti. È possibile utilizzare un millilitro di tripsina 1x per pozzetto in una piastra a sei pozzetti. Dopo cinque minuti, è possibile arrestare la reazione aggiungendo un volume uguale di inibitore fresco della tripsina, uno milligrammo per millilitro in PBS 1x, e raccogliere le cellule.Le cellule raccolte vengono quindi centrifugate a 200 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in pellet in 0,8-1,7 millilitri di tampone freddo di isolamento delle mitocondri, contenente una miscela appena preparata di inibitori della proteasi 1×. La quantità di tampone da utilizzare dipende dalle dimensioni del pellet cellulare ottenuto. Dopo aver risospeso il pellet, incubarlo sul ghiaccio per circa 10 minuti.Dopo l'incubazione, lisiamo le cellule con un omogeneizzatore, operazione che potrebbe richiedere circa da 40 a 50 passaggi. Possiamo verificare il completamento dell'omogeneizzazione colorando un'aliquote delle cellule DOD con blu di trian e osservandole al microscopio ottico. Il risultato dovrebbe essere simile a questo.Questo è il primo prelievo dopo 50 passaggi con il potomat. Questo è il secondo prelievo dopo 80 passaggi con il potomat. Una volta che le cellule sono state omogeneizzate, centrifugarle a 20.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi C. Questo ci fornirà un pellet mitocondriale grezzo, che conterrà anche nuclei e frammenti cellulari più grandi.Prima della raccolta del pellet, è necessario pesare la provetta di raccolta al fine di stimare il peso successivo del pellet, versare e scartare il soprannatante, quindi pesare il pellet grezzo di mitocondri precipitato. Sottraendo il peso della provetta a questo punto, si può procedere alla solubilizzazione del pellet, che verrà mostrata nel passaggio successivo. Per solubilizzare il pellet mitocondriale grezzo, si inizia mantenendo il pellet sul ghiaccio e sottoponendolo a vortex con 35 microlitri di tampone di solubilizzazione freddo di ghiaccio.Per ogni 20 milligrammi di pellet, sono disponibili informazioni dettagliate sui composti tampone riportati nel protocollo scritto allegato. Dopo aver effettuato la vortexazione e aver aggiunto il buffer di solubilizzazione, e prima di aggiungere la digitonina, trasferiamo il pellet risospeso in una provetta adatta per centrifugazione ad alta velocità; quindi aggiungiamo 20 microlitri di digitonina al 10% peso/volume per ogni 20 milligrammi di peso del pellet, mescolando agitando leggermente la provetta. Dopo un'accurata miscelazione, incubiamo il pellet mitocondriale da cinque a dieci minuti sul ghiaccio. Doil beta D multiside o DDM oppure Triton X-100 possono essere utilizzati come sostituti della digitonina per solubilizzare le proteine.La scelta del detergente e della sua quantità può influenzare la formazione di sopra-complessi o forme multimeriche dei complessi mitocondriali dopo l'incubazione sul ghiaccio. Una volta solubilizzato il pellet, verrà centrifugato a centomila volte G per 15 minuti a quattro gradi C; successivamente verrà raccolto il sopranatante limpido. A questo punto siamo pronti per preparare il sopranat游戏副本 da analizzare sul nostro gel a gradiente per l'elettroforesi nativa su gel a gradiente delle mitocondri.Si consiglia di utilizzare un gel con gradiente di acrilamide dal 5 al 13% con un gel di sovrapposizione (stacking) al 3,5%. Per preparare il gel, utilizzeremo una miscela di acrilamide e bis-acrilamide come descritto nel protocollo scritto. La soluzione di acrilamide e bis-acrilamide viene preparata in anticipo e conservata a quattro gradi Celsius in un luogo al buio.L'acrilamide e la bis-acrilamide sono sostanze chimiche tossiche sia in forma di polvere che in forma liquida, quindi è necessario prestare particolare attenzione quando si lavora con esse. Combiniamo la soluzione di acrilamide e bis-acrilamide con un'aliquote di tre x tampone per gel composto da 1,5 molar di sei amino esanoico acido e 75 millimolar di ole a pH 7,0. La quantità di soluzione di acrilamide e bis-acrilamide che aggiungiamo al tampone dipenderà dalla percentuale di gel che stiamo preparando per realizzare il gel a gradiente.Prepareremo una miscela al 4% e una al 13%, mentre il gel di sovrapposizione sarà una miscela al 3,5%. Non dimenticare di aggiungere glicerolo alla miscela al 13%. Quando le tre miscele sono pronte, aggiungiamo una quantità appropriata di perossodisolfato di ammonio e TEMED alle miscele e versiamo le miscele in una camera di polimerizzazione per gradienti.La parte sinistra della camera contiene la miscela al 5%. La parte destra della camera contiene la miscela al 13% con un piccolo agitatore magnetico. Iniziamo a versare il gel aprendo la parte destra della camera.Successivamente apriamo immediatamente la parte sinistra della camera e lasciamo che la soluzione al 5% si mescoli con una soluzione al 13% per formare il gradiente. Aggiungiamo una piccola quantità di isopropanolo sulla parte superiore del gel per ottenere un bordo netto e uniforme dopo la polimerizzazione. Circa un'ora dopo, quando la polimerizzazione del gel a gradiente è completa, rimuoviamo l'isopropanolo e versiamo il gel di sovrapposizione al 3,5% nell'apparato, inserendo successivamente un pettine per gel.Assembleremo ed eseguiremo i gel in una stanza fredda a una temperatura compresa tra quattro e sette gradi Celsius. Per eseguire questo gel, utilizzeremo due tamponi diversi. Nella camera dell'anodo, useremo un tampone contenente 25 millimoli di acido oleico cloridrato, pH 7,0.Il tampone catodico conterrà 50 millimolar tric, 7,5 millimolare acido oleico cloridrato, 0,02% peso/volume, doil beta D multiside o DDM e 0,05% peso/volume, deossicolato a pH 7,0. Per preparare il sopranatante da caricare nel gel appena versato, si aggiunge tampone di caricamento per ottenere una concentrazione finale di 5% peso/volume di glicerolo e 0,01% peso/volume di Ponto S. Tipicamente, si aggiunge direttamente ai sopranatanti una soluzione madre 10x contenente glicerolo e poncho s.Ora siamo pronti a caricare il campione sul gel. Caricheremo i pozzetti del gel con un volume contenente da 20 a 40 milligrammi di proteina mitocondriale grezza per corsia. Immediatamente dopo il caricamento, il gel viene eseguito a 100 volt.Una volta che il campione è entrato nel gel di raccolta, la tensione può essere aumentata a 500 volt con la corrente limitata a 15 milliampere. Sebbene di solito si esegua l'elettroforesi durante la notte a 70-100 volt, si interrompe l'elettroforesi quando una linea netta del colorante rosso zos si avvicina al fronte del gel. Ora che il gel è stato eseguito, possiamo analizzare l'attività dei diversi complessi proteici direttamente nel gel.Il tempo di incubazione per ogni saggio dipende dall'efficienza della solubilizzazione delle proteine e dalla quantità di materiale caricato per pozzetto. I complessi uno, quattro e cinque di solito producono segnali più intensi rispetto ai complessi due e tre. Per questo motivo, il tempo di colorazione per i complessi due e tre dovrebbe essere più lungo.Per verificare l'attività del complesso, dovremo utilizzare tamponi specifici per ciascun complesso. Gli ingredienti per i singoli tamponi sono disponibili nel protocollo scritto. Ora ritaglieremo le singole corsie del gel per eseguire separatamente i saggi di attività in gel.Per tutti i complessi, incubare la fetta di gel nei rispettivi tamponi per diverse ore a temperatura ambiente, tranne che per il complesso cinque. Dopo l'incubazione, fissare il gel in metanolo al 50% e acido acetico al 10% per 15-45 minuti. Il gel fissato viene conservato in acido acetico al 10%.Qui si osserva come appare la colorazione del complesso I. È presente una banda di colore viola scuro nella fetta di gel che corrisponde al complesso I. I gel trasparenti permettono di eseguire la densitometria delle attività dei complessi mitocondriali e di effettuare analisi comparative.Dopo la citometria densa, di solito si asciugano le fette di gel per la conservazione a lungo termine e/o per la scansione al fine di ottenere un'immagine di alta qualità. Due complessi mostrano lo stesso colore violaceo del complesso tre e del complesso quattro. Entrambi producono una banda colorata di tonalità arancione o giallastra. Di seguito sono riportati esempi di attività di colorazione del complesso due, tre e quattro.È stato appena illustrato come analizzare l'attività dei complessi esudativi mitocondriali, estratti da cellule staminali embrionali umane e separati mediante elettroforesi su gel nativo ad alta risoluzione. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.

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I fibroblasti di pazienti portatori di mutazioni nel Parkinson geni che causano malattie rappresentano un facile...

L&#39;uso di fibroblasti umani primari per il monitoraggio fenotipi mitocondriali nel campo della malattia di Parkinson

Singolo gene delle cellule saggio di espressione è necessaria per comprendere eterogeneità di cellule staminali.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Qui, descriviamo come studiare la localizzazione mitocondriale di una chinasi (ciclo cellulare) e come determinare la sua posizione sub-mitocondriale, nonché potenziali substrati/bersagli mitocondriali. L'espressione forzata di proteine nei mitocondri fornisce uno strumento utile per studiare le conseguenze funzionali della localizzazione mitocondriale di una proteina di interesse.

Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

Il trasporto mitocondriale alterato e la morfologia sono coinvolti in varie malattie neurodegenerative. Il protocollo presentato utilizza neuroni del prosencefalo derivati da cellule staminali pluripotenti indotte per valutare il trasporto mitocondriale e la morfologia nella paraplegia spastica ereditaria. Questo protocollo consente la caratterizzazione del traffico mitocondriale lungo gli assoni e l'analisi della loro morfologia, che faciliterà lo studio delle malattie neurodegenerative.

Analisi del trasporto mitocondriale e della morfologia nei neuroni derivati dalle cellule staminali indotte dall'uomo in paraplegia ereditaria

Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e il loro uso nella modellazione delle malattie mitocondriali.

Generazione di organoidi del cervello umano per la modellazione della malattia mitocondriale

La preparazione di campioni arricchiti di mitocondri da tessuti solidi archiviati precedentemente congelati ha permesso ai ricercatori di eseguire valutazioni sia funzionali che analitiche dei mitocondri in varie modalità sperimentali. Questo studio dimostra come preparare preparati arricchiti con mitocondri dal tessuto cardiaco congelato ed eseguire valutazioni analitiche dei mitocondri.

Misurazione dei complessi di trasferimento di elettroni mitocondriali nel tessuto cardiaco precedentemente congelato dalla prole della scrofa: un modello per valutare i cambiamenti bioenergetici mitocondriali indotti dall'esercizio

Questo studio riporta un nuovo approccio per misurare più parametri funzionali mitocondriali basati sulla citometria a flusso e sulla doppia colorazione con due reporter fluorescenti o anticorpi per rilevare cambiamenti nel volume mitocondriale, potenziale di membrana mitocondriale, livello di specie reattive dell'ossigeno, composizione della catena respiratoria mitocondriale e DNA mitocondriale.

Analisi citometrica a flusso di parametri mitocondriali multipli in cellule staminali pluripotenti indotte umane e loro derivati neurali e gliali

Qui, presentiamo una raccolta di saggi per misurare direttamente la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero indipendentemente dalla loro capacità di consumare ossigeno molecolare.

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

Questo protocollo descrive una tecnica per l'analisi dei supercomplessi respiratori quando sono disponibili solo piccole quantità di campioni.

Isolamento dei mitocondri per l'analisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari 

Propagazione di staminali embrionali umane (ES) Cellule

Scopri come analizzare i complessi della catena respiratoria mitocondriale nelle cellule staminali embrionali umane utilizzando saggi di attività in gel. Questo metodo consente di studiare la funzione mitocondriale in vitro.

Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane

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