Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane

I mitocondri hanno numerosi ruoli nella fisiologia cellulare, dal metabolismo e dalla produzione di energia per programmare la morte cellulare alla sintesi degli ormoni steroidei. Nonostante l'importanza dei mitocondri sia nelle funzioni cellulari fondamentali che nelle malattie, si sa molto poco sulla funzione dei mitocondri nelle cellule staminali embrionali umane e nella loro progenie differenziata. In questo video, ti mostreremo come i complessi della catena respiratoria dei mitocondri delle cellule staminali amry umane possono essere analizzati utilizzando i saggi di attività di Ingel.

Ciao, sono Ivan OV del laboratorio di Michael Tetel presso il Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio dell'Università della California di Los Angeles. Oggi vi mostreremo una procedura per valutare la funzione del complesso respiratorio mitocondriale nelle cellule staminali embrionali umane. Questi in gel valutano che questa procedura comporta l'isolamento del palato mitocondriale grezzo dalle cellule staminali embrionali umane, la separazione dei complessi mitocondriali del sistema di fosforilazione essudativa con l'elettroforesi su gel di poliacrilammide nativa chiara a risoluzione più elevata e la successiva attività in gel sa.

Quindi iniziamo. Il primo passo di questa procedura consiste nell'isolare i mitocondri dalle cellule staminali embrionali umane. Per questo test, utilizzeremo cellule staminali embrionali umane che sono state coltivate su una piastra rivestita da matrigel in una condizione priva di alimentatore.

Per raccogliere i mitocondri dalle nostre cellule staminali di amry umane, iniziamo lavandole con uno caldo XPDS pH 7.4, e poi tripsina le cellule per cinque minuti. È possibile utilizzare un mil di una x tripsina per pozzetto in una piastra a sei pozzetti. Dopo cinque minuti, è possibile interrompere la reazione aggiungendo un volume uguale di inibitore della tripsina fresca un milligrammo per mil in un XPBS e raccogliere le cellule.

Le cellule raccolte vengono quindi centrifugate a 200 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la filatura, scartare il surnatante e sospendere, sospendere le cellule pellettate in 0,8-1,7 millilitri di tampone di isolamento dei mitocondri ghiacciato con un cocktail appena preparato di un inibitore della proteasi. La quantità di tampone utilizzata dipende dalle dimensioni del pellet cellulare che si ottiene Dopo che il pellet è stato risospeso, incubarlo su ghiaccio per circa 10 minuti.

Dopo l'incubazione abbiamo abbassato le cellule con un omogeneizzatore, questo potrebbe richiedere da 40 a 50 colpi. Possiamo verificare l'elenco completo dell'omogeneizzazione colorando un'aliquota delle cellule DOD con il blu trian e guardando attraverso un microscopio ottico. Dovrebbe assomigliare a questo.

Questo è il primo colpo dopo 50 colpi con un down. Questo è il secondo colpo dopo 80 colpi con un down. Una volta che le cellule sono omogeneizzate, centrifugatele a 20.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi C. Questo ci darà un pellet mitocondriale grezzo, che conterrà anche nuclei e frammenti cellulari più grandi.

Prima della raccolta del pellet, dobbiamo pesare il tubo di raccolta per stimare il peso successivo del pellet, versare e scartare il surnatante, quindi pesare il pellet mitocondriale grezzo precipitato. Sottraendo a questo punto il peso del tubo, si può procedere alla solubilizzazione del pellet, che verrà mostrata nel passaggio successivo. Per solubilizzare il pellet mitocondriale grezzo, iniziamo mantenendo il pellet sul ghiaccio e agitando con 35 microlitri di tampone di solubilizzazione ghiacciato.

Per ogni 20 milligrammi di pellet che abbiamo, le informazioni dettagliate sui composti tampone sono menzionate nel protocollo scritto allegato. Dopo il vortice e l'aggiunta del tampone di solubilizzazione e prima di aggiungere il digit toin, trasferiamo il pellet risospeso in un tubo appropriato per la centrifugazione ad alta velocità, quindi aggiungiamo 20 microlitri di peso del 10% per volume digit toin per 20 milligrammi di peso del pellet e mescoliamo facendo scorrere il tubo dopo che è stato mescolato accuratamente, incubiamo il pellet mitocondriale per cinque-10 minuti sul ghiaccio. Doil beta D multiside o DDM o Triton X 100 può essere sostituito da digit toin a proteine solubilizzate.

La scelta del detergente e la sua quantità possono influenzare la formazione di supracomplessi o forme multimeriche di complessi mitocondriali in seguito all'incubazione su ghiaccio. E una volta che il pellet è stato solubilizzato, lo centrifugheremo a centomila volte G per 15 minuti a quattro gradi C, quindi raccoglieremo il surnatante chiaro. Ora siamo pronti per preparare il surnatante per l'esecuzione sul nostro gel gradiente per l'elettroforesi su gel gradiente nativo dei mitocondri.

Si consiglia di utilizzare un gel gradiente di acrilammide dal 5 al 13% con un gel impilabile al 3,5%. Per preparare il gel, utilizzeremo una miscela di acrilammide bis acrilammide come descritto nel protocollo scritto. La soluzione di acrilammide bis acrilammide viene preparata in anticipo e conservata a quattro gradi Celsius in un luogo buio.

L'acrilammide e la bis acrilammide sono sostanze chimiche tossiche sia in polvere che in forma liquida, quindi è necessario prestare particolare attenzione quando si lavora con esse. Combiniamo la soluzione di acrilammide bis acrilammide con un'aliquota di tre tamponi gel composti da 1,5 molari di acido esonico amminoacido e 75 millimolari di ole a pH 7,0. La quantità di soluzione di acrilammide bis acrilammide che aggiungiamo al tampone dipenderà dalla percentuale di gel che stiamo producendo per realizzare il gel a gradiente.

Faremo un mix al 4% e uno al 13% e il gel impilabile sarà un mix al 3,5%. Non dimenticare di aggiungere glicerolo al mix al 13%. Quando tutte e tre le miscele sono pronte, aggiungiamo una quantità appropriata di ammonio per solfato e temid alle miscele e versiamo le miscele in una camera di colata a gradiente.

La parte sinistra della camera contiene il 5% di miscela. La parte destra della camera contiene la miscela al 13% in una piccola barra di agitazione magnetica. Iniziamo a versare il gel aprendo la parte destra della camera.

Quindi apriamo immediatamente la parte sinistra della camera e lasciamo che la soluzione al 5% si mescoli con una soluzione al 13% per creare il gradiente. Aggiungiamo una piccola quantità di isopropanolo sulla parte superiore del gel per formare un bordo dritto e affilato per il gel dopo la polimerizzazione. Circa un'ora dopo, quando la polimerizzazione del gel a gradiente è completa, rimuoviamo l'isopropanolo e versiamo il gel da impilare 3,5 nell'apparecchio e inseriamo un pettine in gel.

Assembleremo e faremo funzionare i gel in una cella frigorifera di circa quattro-sette gradi Celsius. Per eseguire questo gel, utilizzeremo due diversi tamponi. Nella camera anodica, utilizzeremo un tampone contenente 25 millimolari di acido cloridrico ole pH 7.0.

Il tampone catodico conterrà 50 millimetri di tric, 7,5 millimolari di acido cloridrico ole, 0,02% in peso per volume, doil beta D multiside o DDM e 0,05% in peso/volume, deossi coate pH 7,0. Per preparare il surnatante da far scorrere nel gel che abbiamo appena versato, viene aggiunto un tampone di carico per ottenere una concentrazione finale del 5% in peso in volume di glicerolo e dello 0,01% in peso in volume. Ponto S, in genere aggiungiamo una soluzione madre 10 x contenente glicerolo e poncho s direttamente ai surnatanti.

Ora siamo pronti per caricare il campione di gel sul gel. Caricheremo i pozzetti di gel con un volume che contiene da 20 a 40 milligrammi di proteina mitocondriale grezza per corsia. Subito dopo il caricamento, il gel viene fatto funzionare a 100 volt.

Una volta che il campione è entrato nel gel di impilamento, la tensione può essere aumentata a 500 volt con la corrente limitata a 15 milliampere. Anche se di solito facciamo funzionare il gel durante la notte a 70-100 volt, interrompiamo l'elettroforesi quando una linea netta del colorante rosso zos si avvicina alla parte anteriore del gel. Ora che il gel è stato eseguito, possiamo analizzare l'attività di diversi complessi proteici direttamente nel gel.

Il tempo di incubazione per ciascun saggio dipende dall'efficienza della solubilizzazione delle proteine e dalla quantità di materiale caricato per pozzetto. I complessi uno, quattro e cinque di solito producono segnali più forti rispetto ai complessi due e tre. Questo è il motivo per cui il tempo di colorazione per il complesso due e tre dovrebbe essere più lungo.

Per testare l'attività complessa, avremo bisogno di utilizzare buffer specifici per ogni complesso. Gli ingredienti per i singoli tamponi sono disponibili nel protocollo scritto. Ora ritaglieremo le singole corsie del gel per eseguire separatamente i saggi di attività Ingel.

Per tutti i complessi, incubare la fetta di gel nei rispettivi tamponi per diverse ore a temperatura ambiente per tutti i complessi ad eccezione del complesso cinque. Dopo l'incubazione, fissare il gel con il 50% di metanolo e il 10% di acido acetico per 15-45 minuti. Il gel fissato è conservato in acido acetico al 10%.

Si vede qui come appare la colorazione del complesso uno. C'è una banda viola intenso nella fetta di gel che corrisponde a quella complessa. I gel trasparenti consentono di eseguire la densitometria da attività complesse mitocondriali e di effettuare analisi comparative.

Dopo la citometria densa, di solito asciugiamo le fette di gel per la conservazione a lungo termine e/o per la scansione al fine di ottenere un complesso di immagini di alta qualità, due macchie dello stesso colore viola di un complesso tre e complesso quattro. Entrambi danno una banda di colorazione arancione o giallastra. Ecco alcuni esempi di complesse attività di colorazione due, tre e quattro.

Vi abbiamo appena mostrato come analizzare l'attività dei complessi di essudazione mitocondriale, che sono stati estratti da cellule staminali embrionali umane e separati da una risoluzione più elevata, compresi gli elettroni gel nativi. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il tuo esperimento.