Name: Generare cellule iPS dal MEF attraverso lespressione forzata di Sox-2, Oct-4, c-Myc e Klf4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-07T10:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Impara a generare cellule iPS da fibroblasti embrionali di topo utilizzando un sistema lentivirale inducibile con i fattori Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4. Questo metodo offre un protocollo affidabile per la riprogrammazione cellulare.

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Fase 1: Scongelare le 293 cellule e piastra per la produzione di lentivirus. <ol><li> Preparare 9 ml di medium DMEM + in un tubo da 15 ml. </li><li> Rimuovere un flacone di 293 titoli congelati dal serbatoio di azoto liquido e mettere la fiala in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C fino maggior parte delle cellule (ma non tutti) sono scongelati. </li><li> Rimuovere le cellule dal flacone congelamento e posto nel tubo 15ml dal punto 1. </li><li> Centrifugare a 180g per 5 minuti, e poi scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule con 10 ml di terreno DMEM +, e trasferirli in un gelatina rivestita da 100 mm piatto. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore fino a quando sono 80-90% confluenti. </li><li> Passaggio delle 293 celle: lavare le cellule con PBS, aspirare il PBS e aggiungere 4 ml per 10 cm piatto dello 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, e incubare per 1 min a 37 ° C. </li><li> Staccare le cellule dai piatti toccando, risospendere con 10 ml di DMEM + medio, e trasferirli in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 180g per 5 minuti, e aspirare il surnatante. </li><li> Aggiungere il volume appropriato di DMEM + medio, e rompere le cellule in una sospensione singola cella pipettando su e giù parecchie volte. </li><li> Contare il numero di cellule e regolare la concentrazione di 8x10 5 cellule per ml con media FP. </li><li> Cellule seme a 8x10 6 celle (10 ml) per 100 mm piatto di cultura, e incubare una notte a 37 ° C, 5% di CO 2. </li></ol> Fase 2: Trasfettare 293 cellule con lentivirus plasmidi e virus raccolta <ol><li> Per ogni 10 cm piastra, utilizzare 10 mg di FUW-Teto-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc) dorsale lentivirus con 2.5ug di PMD-G e 7,5 mg di pPax2. </li><li> Mentre aliquoting i tre plasmidi in un tubo, consegnare 30μl di Fugene 6 reagenti di trasfezione in una seconda provetta contenente 500μl di DMEM senza siero e mescolare delicatamente con le dita toccando e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere il mix di DNA goccia a goccia nella provetta Fugene 6/DMEM-containing, mescolare delicatamente toccando dito e incubare per 20 min. </li><li> Aggiungere il DNA / Fugene 6 gocce complesso nel piatto di 293, e incubare una notte a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> La mattina dopo: Aspirare il reagente di trasfezione contenente medio, aggiungere 5 ml di terreno fresco cellule staminali, le cellule e il ritorno alla incubatrice. </li><li> A 48 ore e 72 ore dopo la trasfezione, raccogliere il terreno dalla 293 da parte utilizzando una siringa da 10 ml sterile monouso, filtrandola attraverso un filtro di 0,45 micron dimensioni dei pori di acetato di cellulosa, e il trasferimento in un tubo da 15 ml. </li><li> Concentrare il surnatante virus da ultracentrifugazione. Risospendere il pellet virus nel volume desiderato e fare amixture in parti uguali del supporto contenente Oct-3/4-,-Sox2, Klf4 e c-Myc-lentivirus. </li><li> Pur facendo il virus, preparare Oct4-neo/rtTA o Oct4-GFP/rtTA MEF (&lt;passaggio 3) al 90% di confluenza in 10 cm di piatti (2x10 6 cellule per piatto) </li><li> Aspirare il terreno di coltura e lavare con 10 ml di PBS. </li><li> Eliminare PBS, aggiungere 1 ml per piatto dello 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, e incubare a 37 ° C per 10 min. </li><li> Aggiungere 9 ml di terreno di coltura, di sospendere le cellule a una singola cella, e trasferirli in un tubo da 15 ml. </li><li> Contare il numero di cellule, e regolare la concentrazione di 8x10 4 cellule per ml. Trasferire 10 ml di sospensione cellulare (8x10 5 celle) ad un piatto di 10 cm rivestito con gelatina. Incubare il piatto durante la notte a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Aspirare il terreno da un piatto fibroblasti, e aggiungere 10 ml di virus contenenti mezzo. Incubare le cellule da 4 ore a notte a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Dopo 24 aspirare il terreno da un piatto fibroblasti, e aggiungere 10 ml di terreno fresco delle cellule ES. </li><li> Sostituire regolarmente medio delle cellule ES con doxiciclina supporto contenente per avviare l&#39;espressione dei quattro geni, in altre parole, avviare riprogrammazione. </li><li> Se si utilizza un Oct4 neo-reporter, poi avviare la sezione di droga in qualsiasi momento tra 6 e 9 giorni. </li><li> Cambia il medium ogni giorno fino le colonie sono abbastanza grande per essere prelevati. Colonie dovrebbe prima diventare visibili circa una settimana dopo l&#39;inizio della riprogrammazione. Dovrebbero diventare abbastanza grande da essere ritirato intorno al giorno 20. </li></ol> Fase 3: Raccogliendo le colonie iPS Il giorno prima raccolta: <ol><li> Seed il numero richiesto di gelatina rivestite 24-pozzetti con γ-irradiati DR4 MEF </li></ol> Picking cloni al giorno 1: <ol><li> Avanzamento delle colonie sulle piastre 1-2 ore prima di prendere. </li><li> Aggiungere 15 ml di PBS per i pozzi di un V a fondo piatto da 96 pozzetti. </li><li> Lavare il piatto contenente le colonie di essere raccolti una volta con PBS e aggiungere 10 ml di PBS al piatto. </li><li> Scegli le colonie con le punte piccole pipetta 5μl (impostare il Pipetman P20 il 4 mL). Trasferimento di colonies ad un pozzo nel piatto da 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 20 ml di tripsina in ogni pozzetto utilizzando il multi-canale (12) pipetor. Pipettare su e giù per 3 volte. Incubare a 37 ° C per 4 minuti. </li><li> Aggiungere 100 l di media ES alle colonie trypsinized. Pipettare su e giù per 10 volte. Trasferimento 6 cloni in un momento dal piatto a 96 pozzetti a un 24-ben piatto con una punta in ogni altra posizione sulla pipetor 12 coperti. </li><li> Crescono le celle del 24-pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore fino a raggiungere le cellule 80-90% confluenza, alimentazione quotidiana con media delle cellule ES. Cellule sarà probabilmente pronto per espandersi in 3-7 giorni. </li></ol> Fase 4 <ol><li> Espansione di cellule iPS <ol><li> Aspirare il mezzo, e lavare le cellule con 1 ml di PBS. </li><li> Rimuovere completamente PBS, aggiungere 0,1 ml di tripsina 0,25% / 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C per 10 min. </li><li> Aggiungere 0,4 ml del mezzo ES e sospendere le cellule pipettando su e giù per la sospensione singola cellula. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto della piastra 6-bene, aggiungere 1,5 ml di mezzo di cellule ES, e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore fino a raggiungere le cellule 80-90% confluenza in 6 pozzetti. A questo punto, preparare congelate delle cellule, come segue. </li></ol></li><li> Preparazione del magazzino freeze <ol><li> Aspirare il mezzo, e lavare le cellule con 2 ml di PBS. </li><li> Rimuovere completamente PBS, aggiungere 0,5 ml di tripsina 0,25% / 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C per 10 min. </li><li> Aggiungere 2 ml del mezzo ES e sospendere le cellule pipettando su e giù per la sospensione singola cellula. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml, contare il numero di cellule e spin giù le cellule. </li><li> Eliminare il surnatante, risospendere le cellule ES con il mezzo per la concentrazione a 2x10 6 cellule per ml. </li><li> Preparare 2 celle medie ES congelamento (20% di DMSO in ES media) e aliquota è al 0,5 ml per flaconcino. </li><li> Trasferire 0,5 ml di sospensione cellulare di congelare fiale e mescolare delicatamente. </li><li> Mettere le fiale in una cella-congelamento contenitore e tenerlo a -80 ° C per una notte, trasferimento di azoto liquido il giorno successivo per conservazione a lungo termine. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li>
</ol>

In questo video ci dimostra come utilizzare un sistema inducibile lentivirali per generare GFP-positive, le cellule iPS da MEF pluripotenti derivate da topi e Oct4-GFP/R26-M2rtTA Nanog-GFP/R26-M2rtTA. Questa procedura è un metodo utile per generare cellule iPS, perché permette il controllo di espressione del transgene durante il processo di riprogrammazione. Sebbene l&#39;uso di virus nella generazione di cellule iPS impedisce l&#39;uso di queste cellule in un ambiente clinico, questa procedura ci permette di rispondere ad alcune delle grandi questioni biologiche che sottolineano il processo di riprogrammazione ancora definito.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato di doxiciclina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

generare cellule ips dal mef attraverso l&#39;espressione forzata di sox-2, oct-4, c-myc e klf4

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotenza può essere indotto in murini differenziati per trasduzione virale di Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc (Takahashi e Yamanaka, 2006; Wernig, et al, 2007;. Okita, et al, 2007;.. Maherali, et al, 2007). Abbiamo ideato una strategia di riprogrammazione, in cui sono espressi questi quattro fattori di trascrizione da doxiciclina (dox)-inducibile vettori lentivirali (Brambrink et al., 2008). L&#39;utilizzo di questi costrutti inducibili, possiamo derivare staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule di fibroblasti embrionali di topo (MEF). In questo video, dimostriamo la procedura per la generazione di lentivirus inducibile che esprimono i quattro fattori di trascrizione e mostrano come infettare MEF con questi virus al fine di produrre cellule iPS. Utilizzando lentivirus inducibile, l&#39;espressione dei quattro fattori controllati con l&#39;aggiunta di doxiciclina al mezzo di coltura. Il vantaggio di questo sistema oltre l&#39;infezione retrovirale tradizionale è la capacità di trasformare i geni e disattivare in modo che la cinetica di riprogrammazione e di espressione genica possono essere analizzati in dettaglio.

Questo video mostra la procedura per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte con lentivirus inducibile che esprimono Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4.

Generare cellule iPS dal MEF attraverso l&#39;espressione forzata di Sox-2, Oct-4, c-Myc e Klf4

La pluripotenza può essere indotta in cellule murine differenziate mediante la trasduzione virale di Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc (Takahashi e Yamanaka, 2006; Wernig, et al., ...

Oltre 50 anni fa, si ipotizzò che cellule differenziate in modo terminale, come i fibroblasti della pelle, potessero essere indotte ad assumere uno stato pluripotente simile a quello delle cellule staminali embrionali. La base di questo concetto risiede nell'osservazione che tutti i tipi cellulari, con poche eccezioni minori, possiedono lo stesso codice genetico e che l'unica differenza tra i tipi cellulari consiste nel modo in cui tale codice viene letto. Questa capacità di modificare l'identità cellulare di una cellula differenziata fino a uno stato pluripotente è definita riprogrammazione cellulare.Dopo cinque anni di ricerca, è stato recentemente dimostrato che l'espressione forzata di quattro fattori di trascrizione può riprogrammare i fibroblasti cutanei rendendoli pluripotenti. L'impatto di questa scoperta è enorme. Oltre all'importanza per la biologia fondamentale, essa supera anche le principali obiezioni etiche relative all'uso di cellule staminali embrionali umane per la terapia trapiantologica.Perché avvenga il riprogrammamento, quattro geni che codificano per i fattori di trascrizione OC4, Sox2, c-Myc e K4 devono essere incapsulati e inseriti in una coltura cellulare di lentivirus. Il mezzo contenente il virus purificato viene quindi aggiunto a una piastra per colture cellulari contenente una elevata densità di fibroblasti, e all'interno della piastra si verifica un fenomeno straordinario. Una piccola frazione di fibroblasti viene infettata da tutti e quattro i virus portatori dei fattori di trascrizione e inizia a dedifferenziarsi.Subiscono cambiamenti drastici nella loro morfologia e proliferazione e iniziano a dividersi in grandi agglomerati sferoidali formati da cellule staminali pluripotenti. Dopo due o tre settimane di coltura in condizioni per cellule staminali embrionali, le colonie di fibroblasti riprogrammati possono essere isolate manualmente ed espanse in vitro. Una volta purificate, queste cellule possono essere utilizzate per generare topi chimerici in cui una certa percentuale di cellule deriva dai fibroblasti dedifferenziati e può contribuire a diversi tessuti del topo.In campane in cui il materiale genetico dei fibroblasti originali ha contribuito alla linea germinale, il codice genetico può essere trasmesso alla generazione successiva, e poi a quella successiva, e ancora a quella dopo. Sebbene l'uso di un sistema di somministrazione virale rappresenti attualmente un ostacolo per le applicazioni cliniche, questo problema sarà probabilmente superato nel breve periodo. In questo video, membri del laboratorio Yin dimostreranno come vengono ottenute cellule staminali pluripotenti indotte da fibroblasti embrionali di topo.Ciao, sono Grant Welted del laboratorio di Rudolph Jish presso l'Istituto Whitehead per la Ricerca Biomedica a Cambridge, Massachusetts. E io sono Tobias Bro brink, anch'io del laboratorio Ish. Oggi vi mostreremo la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte mediante l'introduzione di quattro cDNA: OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4, utilizzando virus lentivirali che esprimono questi quattro cDNA da un promotore Tet-OCMV.Questo consente un controllo preciso dell'espressione di questi quattro transgeni dopo l'infezione di fibroblasti embrionali murini. Il protocollo che vi stiamo mostrando oggi prevede la manipolazione di lentivirus che potrebbero infettare cellule umane. È fondamentale seguire sempre procedure sicure e contattare l'ufficio per la sicurezza prima di tentare di eseguire questa procedura autonomamente.Generiamo quindi alcune cellule IPS al fine di produrre lentivirus che convertiranno le cellule mes in cellule IPS. Le cellule 293 devono essere trasfettate con tre plasmidi: Paks due, che fornisce gli elementi genetici necessari per l'impacchettamento virale; il genoma virale, costituito da un lentivirus FUW TE OCMV con uno dei quattro CD aids T quattro SOX due, KLA quattro o CMIC; e PMDG, che esprime la glicoproteina dell'involucro del virus della stomatite vescicolare, o VSV.Questo produce il virus che genererà il virus atropico. Pertanto, è necessario seguire correttamente le procedure di livello di biosicurezza 2+. In questo particolare video, non stiamo manipolando effettivamente un virus infettivo, quindi non indossiamo le nostre tipiche camiciature e non ci troviamo all'interno di un impianto di livello di biosicurezza 2+.Prima della trasfezione, le cellule 293 vengono scongelate dall'azoto liquido e coltivate fino a raggiungere una confluenza del 90%. Successivamente, le cellule vengono trasfettate con il gene FU e lasciate per 48-72 ore per esprimere il virus; a questo punto, il mezzo in cui le cellule sono state coltivate viene filtrato attraverso un filtro da 0,45 micron e concentrato mediante ultracentrifugazione. Dopo aver concentrato il virus, siamo pronti per infettare le MES al fine di generare aggregati IPS. Durante le fasi di preparazione del virus, i fibroblasti embrionali murini, passati meno di tre volte, vengono coltivati fino a raggiungere una confluenza del 90% in piastre da 10 centimetri, con un numero approssimativo di due volte 10 alla sesta cellule per piastra. In questo particolare protocollo sperimentale, stiamo utilizzando MES che esprimono RTTA, fondamentale per l'espressione della doxiciclina e della GFP dal locus endogeno OC4.I MES sono negativi per GFP, ma le vere cellule iPS diventano positive per GFP. Questo marcatore consente un metodo per identificare le cellule riprogrammate. Aspirare il mezzo di coltura dai fibroblasti e lavare con 10 ml di PBS-EDTA, scartare il PBS-EDTA e aggiungere 5 ml di tripsina 1X, quindi incubare a 37 gradi per 10 minuti. La tripsina aiuterà a staccare le cellule dal fondo delle piastre.Ora aggiungere nove mil del mezzo di coltura per risospendere le cellule in una sospensione di singole cellule e trasferirle in un tubo da 15 mil. Queste cellule vengono quindi centrifugate e raccolte come pellet. Dopo aver risospeso il pellet, si conta il numero di cellule nella sospensione e la concentrazione viene aggiustata a otto per 10 alla quattro cellule per mil.10 mil della sospensione cellulare vengono quindi trasferiti in una piastra da 10 centimetri rivestita con gelatina. Incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% CO2; al termine dell'incubazione notturna, il mezzo di una piastra di fibroblasti viene aspirato e vengono aggiunti 10 mil di mezzo contenente il virus alla piastra. Incubare le cellule da quattro ore a tutta la notte a 37 gradi Celsius, 5% CO2.Il giorno successivo, aspirare il mezzo da una piastra di fibroblasti e quindi aggiungere 10 ml di mezzo ESL fresco. A questo stadio, le cellule possono essere congelate, espanse o preparate per l'avvio del riprogrammazione. Per avviare il riprogrammazione, sostituire il mezzo ESL normale con un mezzo contenente doxiciclina per indurre l'espressione dei quattro geni.Collocare queste cellule nell'incubatore e cambiare il mezzo ogni giorno fino a quando le colonie diventano abbastanza grandi da essere prelevate. Le colonie dovrebbero apparire visibili per la prima volta circa una settimana dopo l'inizio della riprogrammazione. Dovrebbero raggiungere una dimensione sufficiente per essere prelevate intorno al giorno 20.Ora che sono passati 20 giorni, possiamo procedere alla selezione delle colonie IPS prima del prelievo delle colonie. Si dovrebbe ricordare di preparare il numero richiesto di piastre da 24 pozzetti rivestite con gelatina e trattate con irradiazione gamma DR quattro miti da una a due ore prima del prelievo. Si dovrebbero nutrire le colonie sulle piastre aggiungendo mezzo fresco appena prima del prelievo; aggiungere 50 microlitri di tampone HEPA nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V immediatamente prima del prelievo, lavare una volta la piastra contenente le colonie da prelevare con PBS e aggiungere 10 ml di PBS alla piastra. I cluster di cellule IPS possono essere prelevati sia sotto un microscopio stereoscopico che sotto un microscopio invertito.Prelevare le colonie con una piccola punta di pipetta e trasferirle in una pozzetta della piastra a 96 pozzette contenente PBS per rimuovere gli aggregati. Con la punta della pipetta viene tracciato un cerchio attorno all'aggregato per disperderlo. Ora le cellule riprogrammate possono essere prelevate utilizzando la pipetta multicanale; vengono aggiunti 20 microlitri di tripsina a ciascuna pozzetta.Pipettare su e gi&ugrave; tre volte, incubare a 37 &deg;C per quattro minuti. Dopo l'incubazione di quattro minuti, aggiungere 100 microlitri di mezzo ES alle belle colonie. Pipettare su e gi&ugrave; dieci volte e trasferire sei cloni alla volta.Dalla piastra a 96 pozzetti a una piastra a 24 pozzetti, utilizzando una punta in ogni altra posizione del pipettatore a 12 posizioni, le cellule vengono quindi coltivate nella piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 gradi centigradi e 5% di CO₂ fino a quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%, rifornendole con mezzo per cellule ES. Le cellule probabilmente saranno pronte per essere espanse in tre-sette giorni. Alcuni giorni dopo, ora che le cellule iPS sono confluenti, aspirare il mezzo e lavare le cellule con 1 ml di HBSS. Rimuovere completamente l'HBSS e aggiungere 100 microlitri di tripsina 1X, quindi incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione con la tripsina, aggiungere 400 microlitri di mezzo ES e sospendere le cellule pipettando su e giù, ottenendo una sospensione di cellule singole.La sospensione monocellulare di 500 microlitri proveniente dalla piastra a 24 pozzetti viene quindi trasferita in un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubata in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di CO2 fino a quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90% nella piastra a 6 pozzetti. A questo punto, è possibile procedere con l'amplificazione delle cellule per analisi di Southern, blast, iniezioni, saggi di teratoma o saggi di differenziamento in vitro. Si raccomanda di congelare aliquote di queste cellule per non perdere questo prezioso ceppo di cellule iPS.Abbiamo appena mostrato come indurre la pluripotenza nei fibroblasti embrionali di topo utilizzando un sistema antivirale induttibile. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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