Generare cellule iPS dal MEF attraverso l'espressione forzata di Sox-2, Oct-4, c-Myc e Klf4

Oltre 50 anni fa, è stato ipotizzato che le cellule terminalmente differenziate come i fibroblasti cutanei potessero essere costrette ad assumere uno stato pluripotente simile alle cellule staminali embrionali. La base di questo concetto è stata l'osservazione che tutti i tipi di cellule, con alcune eccezioni minori, hanno lo stesso codice genetico e che l'unica differenza tra i tipi di cellule è il modo in cui il codice viene letto. Questa capacità di cambiare l'identità cellulare di una cellula differenziata in uno stato pluripotente è definita riprogrammazione cellulare.

Dopo mezzo decennio di ricerca, è stato recentemente dimostrato che l'espressione forzata di quattro fattori di trascrizione può riprogrammare i fibroblasti cutanei per diventare pluripotenti. L'impatto di questa scoperta è enorme. Oltre all'importanza per la biologia di base, supera anche le principali obiezioni etiche all'uso di cellule staminali embrionali umane per la terapia dei trapianti.

Affinché avvenga la riprogrammazione, quattro geni che codificano i fattori di trascrizione, OC, quattro, sox, due, cmic e K quattro, devono essere impacchettati e inseriti in una coltura tissutale di lentivirus. Il terreno contenente il virus purificato viene quindi aggiunto a una piastra di coltura cellulare contenente un'alta densità di fibroblasti e, all'interno di quella piastra, accade qualcosa di straordinario. Una piccola frazione di fibroblasti viene infettata da tutti e quattro i virus che trasportano il fattore di trascrizione e inizia a dedifferenziarsi.

Subiscono drastici cambiamenti nella loro morfologia e proliferazione e iniziano a dividersi in grandi ammassi spirituali di cellule staminali pluripotenti formate. Dopo due o tre settimane di coltura in condizioni di cellule staminali embrionali, le colonie di fibroblasti riprogrammati possono essere isolate manualmente ed espanse in vitro. Una volta purificate, queste cellule possono essere utilizzate per generare topi chimerici in cui una certa percentuale di cellule derivano da quei fibroblasti de differenziati che possono contribuire a diversi tessuti del topo.

Nelle carillon in cui il materiale genetico dei fibroblasti originali ha contribuito alla linea germinale, il codice genetico deve essere trasmesso alla generazione successiva e poi alla successiva e poi alla successiva. Sebbene l'uso di un sistema di somministrazione virale sia attualmente un impedimento per le applicazioni cliniche, questo problema sarà probabilmente superato in breve tempo. In questo video, i membri del laboratorio yin dimostreranno come le potenti cellule staminali atorie indotte derivano da fibroblasti embrionali di topo.

Ciao, sono Grant Welted del laboratorio di Rudolph Jish presso il Whitehead Institute for Biomedical Research di Cambridge, Massachusetts. E io sono Tobias Bro brink anche lui da ish lab. Oggi vi mostreremo la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte mediante l'introduzione di quattro CDNA, OCT, quattro SOX, due CIC, KF, quattro utilizzando lentivirus che esprimono questi quattro CDNA da un promotore del Tet OCMV.

Ciò consente il controllo preciso dell'espressione di questi quattro transgeni dopo l'infezione dei fibroblasti embrionali di topo. Il protocollo che vi mostriamo oggi prevede la manipolazione del lentivirus che può eventualmente infettare le cellule umane. È fondamentale seguire sempre le procedure di sicurezza e contattare l'ufficio di sicurezza prima di provare a farlo da soli.

Quindi generiamo alcune cellule IPS per generare lentivirus che convertiranno mes in cellule IPS. 2 9 3 cellule devono essere trasfettate con tre plasmidi Paks due, che forniscono gli elementi genetici necessari per l'imballaggio virale. La spina dorsale virale, che è un lentivirus FUW TE OCMV con uno dei quattro CD aiuta T quattro SOX due, KLA quattro o CMIC PMDG, che esprime la glicoproteina dell'involucro del virus della stomatite vescicolare o VSV.

Questo rende il virus che genererà il virus atropico. Quindi è necessario seguire le corrette procedure BL two plus. In questo particolare video, in realtà non stiamo maneggiando virus infettivi, quindi non indossiamo i nostri camici tipici e non siamo nella nostra struttura BL two plus.

Prima della trasfezione 2, 9 3 cellule vengono scongelate dall'azoto liquido e coltivate al 90% di cofluenza, le cellule vengono quindi trasfettate con il gene FU e le vengono date da 48 a 72 ore per esprimere il virus, momento in cui il mezzo che bagna le cellule viene filtrato utilizzando un filtro da 0,45 micron e concentrato mediante ultracentrifugazione dopo aver concentrato il virus. Siamo ora pronti a infettare la MES per generare cluster di IPS Durante le fasi di preparazione virale, i fibroblasti embrionali di topo che passano meno di tre volte vengono cresciuti al 90% di fluenza di co in piastre di 10 centimetri, circa due volte 10 alle sei cellule per piatto. In questo particolare protocollo sperimentale, stiamo utilizzando MES che esprimono l'RTTA, che è fondamentale per l'espressione della doxiciclina e della GFP dal quarto locus OC endogeno.

I MES sono GFP negativi, ma le vere cellule IPS diventano GFP positive. Questo marcatore consente un metodo con cui identificare i mes riprogrammati, aspirare il terreno di coltura dai fibroblasti e lavare con 10 mil di hippies, EDTA, scartare l'EDTA hippies e aggiungere cinque mil di tripsina una volta e incubare a 37 gradi per 10 minuti. La tripsina aiuterà a sollevare le cellule dal fondo dei piatti.

Ora aggiungere nove mil di terreno di coltura per risospendere le cellule in una singola sospensione cellulare e trasferirle in una provetta da 15 mil. Queste celle vengono poi centrifugate e pellettate. Dopo la sospensione del pellet, viene contato il numero di cellule nella sospensione e la concentrazione viene regolata a otto volte 10 per le quattro cellule per mil.

10 mil della sospensione cellulare vengono quindi trasferiti in un piatto di 10 centimetri ricoperto di gelatina. Incubare la capsula per una notte a 37 gradi Celsius 5%CO2 dopo l'aspirazione del terreno di incubazione notturna da una piastra di fibroblasti e l'aggiunta di 10 mil del terreno contenente il virus alla metanfetamina. Incubare le cellule da quattro ore a tutta la notte a 37 gradi Celsius, 5% di CO2.

Il giorno successivo, aspirare il terreno da un piatto di sabbiatura e quindi aggiungere 10 mil di terreno ESL fresco. In questa fase, le cellule possono essere congelate, espanse o preparate per l'inizio della riprogrammazione. Per avviare la riprogrammazione, sostituire il normale terreno ESL con un terreno contenente doxiciclina per avviare l'espressione dei quattro geni.

Metti queste cellule nell'incubatrice, cambia il terreno ogni giorno fino a quando le colonie diventano abbastanza grandi da poter essere raccolte. Le colonie dovrebbero diventare visibili per la prima volta circa una settimana dopo l'inizio della riprogrammazione. Dovrebbero diventare abbastanza grandi da poter essere raccolti intorno al giorno 20.

Ora che sono trascorsi 20 giorni, possiamo andare avanti e raccogliere le colonie IPS prima di raccogliere le colonie. Bisogna ricordarsi di vedere il numero richiesto di piastre da 24 pozzetti rivestite di gelatina con DR quattro miti irradiati con raggi gamma una o due ore prima del prelievo. Si dovrebbero nutrire le colonie sulle piastre aggiungendo terreno fresco appena prima della raccolta, aggiungere 50 microlitri di tampone HEPA ai pozzetti di un piatto a 96 pozzetti con fondo a V immediatamente prima del prelievo, lavare il piatto contenente le colonie da raccogliere una volta con PBS e aggiungere 10 ml di PBS al piatto. I cluster di cellule IPS possono essere raccolti con uno stereo o un microscopio invertito.

Raccogli le colonie con una piccola punta di pipetta e trasferiscile in un pozzetto nella capsula da 96 pozzetti contenente PBS per rimuovere i grappoli. Viene disegnato un cerchio con una punta di pipetta attorno al grappolo per spezzare la matematica. Ora le cellule riprogrammate possono essere estratte utilizzando il pipettatore multicanale, a ciascuna vengono aggiunti 20 microlitri di tripsina.

Pipare bene su e giù tre volte, incubare a 37 gradi C per quattro minuti. Dopo l'incubazione di quattro minuti, 100 microlitri di terreno ES vengono aggiunti alle colonie di tripps nice. Collegalo su e giù 10 volte e trasferisci sei cloni alla volta.

Dalla piastra a 96 pozzetti a una piastra a 24 pozzetti, utilizzando una punta in ogni altra posizione sul pipettatore a 12 posti, le cellule vengono quindi coltivate sulla piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 centesimi di CO2 al 5% fino a quando le cellule raggiungono l'80-90% di fluenza di co, le celle medie saranno probabilmente pronte per espandersi in tre-sette giorni Pochi giorni dopo. Ora che le cellule IPS sono confluenti, aspirare il terreno e lavare completamente le cellule con un mil di hippies Rimuovere gli hippie e aggiungere 100 microlitri di tripsina una volta e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione con tripsina, aggiungere 400 microlitri di terreno ESL e sospendere le cellule pipettando su e giù per produrre una singola sospensione cellulare.

La sospensione di una singola cellula da 500 microlitri proveniente dai 24 pozzetti viene quindi trasferita in un singolo pozzetto di una piastra a sei pozzetti e incubata in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di CO2 fino a quando le cellule raggiungono l'80-90% di fluenza di co nella piastra a sei pozzetti. A questo punto, è possibile procedere all'amplificazione delle cellule per analisi meridionali, blasti, iniezioni, saggi di teratoma o saggi di differenziazione in vitro. E dovresti ricordarti di congelare le valvole di serie di queste celle in modo da non perdere questa preziosa scorta di cellule IPS.

Ti abbiamo appena mostrato come indurre la pluripotenza nei fibroblasti embrionali di topo utilizzando un sistema antivirale inducibile. Quindi grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.