Name: Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Scopri le tecniche per isolare e analizzare le cellule staminali ematopoietiche dalla placenta murina. Questo metodo consente di visualizzare le nicchie microambientali uniche che supportano lo sviluppo delle HSC durante l'embriogenesi.

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1. Embrione rimozione e dissezione placentare <ol><li> Per cominciare, gli embrioni devono essere prima isolati da dighe incinta. </li><li> Gli animali sono l&#39;eutanasia secondo procedure approvate - nel nostro caso abbiamo intenzione di utilizzare una dose letale di anestetico isoflurano </li><li> In primo luogo, spruzzare il ventre con etanolo e fare una piccola incisione con un paio di forbici. </li><li> Strappare via la pelle con entrambe le mani per scoprire l&#39;addome e tagliare aprire il peritoneo. </li><li> Con una pinza, raccogliere le corna uterine e alla loro raccolta con le forbici ad ogni estremità distale. Mettere le corna uterine in una capsula di Petri riempite con PBS e posto sul ghiaccio. Inoltre, ricordarsi di lavare più volte con PBS prima di isolare la placenta. Ora possiamo isolare la placenta. </li><li> Con due pinze, iniziare con attenzione peeling via il tessuto endometriale che circonda la conceptuses embrione. Si dovrebbe fare attenzione a non forare o comunque infliggere danni strutturali agli embrioni, in modo da complicare la dissezione passi successivi. </li><li> Posizionare il conceptuses isolato in un nuovo piatto di Petri con PBS su ghiaccio e continuare fino a quando tutti conceptuses sono stati liberati dalla endometrio. </li><li> Trasferire una concepito per un nuovo piatto di Petri con PBS posta sotto il microscopio e con due pinze sbucciare la decidua lontano dalla placenta. Rimuovere la maggior quantità di decidua il più possibile le cellule decidua interferirà con cella singola sospensione e citometria a flusso. Una fluidità del movimento continuo peeling è consigliata per ottenere i migliori risultati. </li><li> Tagliare il sacco vitellino lontano dalla placenta alla confluenza tra i due organi e tirare delicatamente il sacco vitellino ed i vasi vitellino lontano dalla placenta. Si deve prestare attenzione a non disturbare il piatto coriali della placenta, in particolare con embrioni precoci. </li><li> Con attenzione tenendo il piatto coriale della placenta con un paio di pinze e il cordone ombelicale con un altro, tirare il cordone ombelicale attaccato e embrione di distanza dalla placenta. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di tessuto a cellule giganti ai bordi della placenta al fine di minimizzare aggregazione delle cellule durante la preparazione della cella singola sospensione. </li><li> Raccogliere la placenta in un contenitore adeguato, come un tubo da 15 ml Falcon, con% FCS PBS +5 e sul ghiaccio. Fate questo per tutte le placente sezionato. </li><li> A questo punto, è possibile procedere con la preparazione di una cella singola sospensione per citometria a flusso, test funzionali, come la cultura in vitro o il trapianto, o preparare tutta la placenta per la fissazione dei tessuti e fissi blocco congelato embedding per immunoistochimica finale. </li></ol> 2. Preparazione di singole cellule sospensione del tessuto della placenta <ol><li> Noi ora vi mostrano come generare una sospensione singola cellula da placenta per l&#39;analisi FACS. </li><li> Per preparare una sospensione singola cellula da placenta, meccaniche e dissociazione enzimatica è richiesto. In primo luogo preparare una soluzione Collagenasi 0,1% in PBS con 10% FCS e 1% di soluzione di penicillina / streptomicina. </li><li> Aggiungere un volume appropriato di soluzione di collagenasi alla placenta, a seconda di quanti avete. Un volume che è il doppio del volume placenta e tra 2-5ml è raccomandato. </li><li> Utilizzare un ago 16-G montato su una siringa da 5 ml di distruggere meccanicamente i tessuti da passaging la soluzione di collagenasi e la placenta attraverso l&#39;ago 3 volte. Ripetere con un 18-G ago. </li><li> Porre il campione a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 45 minuti. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 45 minuti a collagenasi, il passaggio alla soluzione delle cellule attraverso un ago 20-G, e incubare per altri 45 minuti, in 37 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 1,5 ore in totale collagenasi, il passaggio delle cellule attraverso la soluzione 22-25-G e G aghi 3 volte con ogni ago. </li><li> Filtrare il campione attraverso un filtro da 50 micron collegato a un nuovo tubo da 15 ml Falcon, lavare con PBS +5% FCS e centrifugare a 4 ° C per 5 minuti a 300 × g. </li><li> A questo punto, abbiamo un&#39;unica sospensione cellulare adeguata per l&#39;analisi FACS o test funzionali. </li></ol> 3. Fissazione dei tessuti per le sezioni congelate <ol><li> Immediatamente dopo aver isolato la placenta da ogni embrione, essi sono posti in freddo PBS 1X. Di solito una piastra a 96 pozzetti funziona meglio per placente giovani (E8.5-11.5), ma con i placente, E12.5 e più anziani, a 24 pozzetti può essere più conveniente. </li><li> Ogni placenta viene trasferito in un nuovo pozzo pieno di appena scongelati 4% paraformaldahyde o PFA. Per la E12.5 placenta, il tessuto è spostata in un nuovo pozzo a mano, ma per il 10,5 è possibile rimuovere il PBS con attenzione con una pipetta e aggiungere il PFA. E &#39;importante che la placenta è completamente immerso per 2-4 ore a 4 ° C, a seconda dell&#39;età e delle dimensioni del tessuto. </li><li> Trasferire il tessuto in 30% di saccarosio, o se i tessuti sono molto piccoli e fragili, aspirare il PFA e aggiungere il saccarosio direttamente. In questa fase, la placenta sarà variabile a soluzione. Lasciate che i tessuti pernottamento a 4 ° C.</li><li> Dopo il passo durante la notte nel 30% di saccarosio, i tessuti dovrebbe in ultima analisi, si depositano sul fondo del pozzo, indicativo di crioconservazione corretta. Togliere la metà della soluzione di saccarosio e sostituire il volume con ottobre e il luogo del tessuto indietro nel 4 ° C per 1-2 ore. Questo facilita la penetrazione ottobre </li><li> Trasferire il tessuto al 100% ottobre per 1 ora, dopo di che può essere incorporato. </li></ol> 4. Incorporare il tessuto fissato <ol><li> Stampi di plastica con l&#39;etichetta di identificazione dei tessuti appropriati (ad esempio la muffa show). </li><li> Tirare fuori il tessuto della soluzione ottobre e tagliare a metà la placenta orientando la forma di disco placenta con il lato del cordone ombelicale rivolto verso il basso e con attenzione affettare con una lametta pulita avendo cura di spostare la lama avanti e indietro prima di rilasciare la pressione per assicurare un taglio uniforme. La placenta è tagliata a metà per ottenere il miglior prientation per visualizzare dopo il CSE placentare. </li><li> Mettere la metà placenta al fondo dello stampo con il bordo tagliato a contatto con la superficie inferiore dello stampo. Ripetete l&#39;operazione con un nuovo stampo per l&#39;altra metà. Per 10,5 placente, le due metà può essere messo nello stampo stesso utilizzando la stessa tecnica. </li><li> Quando si versa nello stampo ottobre, può essere difficile mantenere la placenta con l&#39;orientamento corretto. Fissare la placenta in posizione tenendo la metà del tessuto con una pinza. Versare lentamente la soluzione ottobre nello stampo e di evitare di produrre le bolle. Per 10,5 placente, tenere la metà dei tessuti da pinze e il riposo l&#39;altra metà dei tessuti contro l&#39;esterno della pinza. Versare lentamente soluzione ottobre come descritto per E12.5 placente. </li><li> Una volta che lo stampo è riempito di ottobre, subito posto lo stampo su ghiaccio secco, l&#39;ottobre si trasformerà flash bianco il congelamento dei tessuti </li><li> Mettere lo stampo in un sacchetto di plastica contenente Drierite e subito conservare in freezer -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li>
<li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li>
</ol>

Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo permetterà per l&#39;isolamento e la visualizzazione del tessuto placentare e staminali ematopoietiche e cellule progenitrici. Per un riepilogo completo di rendimento atteso su cellulare e numero di cellule staminali nella placenta fetale e di altri organi ematopoietici durante lo sviluppo fetale si fa riferimento a Gekas, et al. 2005. Per la localizzazione di cellule staminali e lo sviluppo di altre cellule ematopoietiche nella placenta si fa riferimento a Rodi, et al. 2008.

Elencare le materie: Il glucosio 100mM 10mM NaN3 15-ml tubi (BD) 16-G, 18-G, 20-G, 22-25-G e G aghi (BD) Soluzione di saccarosio 30% 35 millimetri piastre di Petri (BD) 4% paraformaldeide 50 - I filtri delle cellule m (Celltrics) 5-ml siringhe (BD) Fosfatasi alcalina substrato Kit I (vettore rosso, Vector) Fosfatasi alcalina substrato Kit III (vettore blu, Vector) Antibiotici (penicillina / streptomicina, P / S) soluzione Collagenasi di tipo I (Sigma) Cryomold monouso in vinile Stampi campioni (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) Citocheratina Anticorpo primario (DakoCytomation) Dissezione forcipe, acciaio inox o in titanio, numero 5 o 55 Drierite Siero fetale bovino (FBS) Fisherbrand plastica vetrino da microscopio Mailer (Fisher) Glucosio Ossidasi 1000u/ml Levamisolo (Vector) Montaggio di mezzi, a base acquosa Mounting Medium (VectamountTM AQ) Normale siero di cavallo (Vector) Taglio di temperatura ottimale (ottobre, Tissue-Tek) Perossidasi Kit substrato DAB (Vector) Soluzione tampone fosfato (PBS) con calcio / magnesio (Ca2 + w / Mg2 +) Soluzione tampone fosfato (PBS) senza calcio / magnesio (w / o Ca2 + / Mg2 +) Far scorrere scatola di plastica (detiene il 100 diapositive) Tubi di plastica (180 Nalgene PVC atossico autoclavabile) Polipropilene a fondo tondo Provetta, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) Proteinasi K 20mg/ml Soluzione (Amresco) Prodotti di ricerca International Corp Super Pap Pen HT * Marcatori scorrere (2,5 mm, Fisher) Tessuto-coltura trattata a forma di U (andata e basso) piastre a 96 pozzetti o 24 pozzetti (BD Falcon) Tween20, SigmaUltra (Sigma) Amplificazione Tyramide Kit (Invitrogen) Vectastain ABC fosfatasi alcalina Standard Kit (Vector) Vectastain ABC standard Elite Kit (Vector)

isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi e di generare tutti i tipi di cellule dei lignaggi di sangue per tutta la durata di un individuo. Tutte le CSE emergono durante lo sviluppo embrionale, dopo di che le loro dimensioni piscina è gestito da auto-rigenerante divisioni cellulari. Identificare l&#39;origine anatomica di cellule staminali e gli eventi critici dello sviluppo che regolano il processo di sviluppo HSC è stato complicato come molti siti anatomici partecipare durante emopoiesi fetale. Recentemente, abbiamo identificato la placenta come organo principale ematopoietiche dove si generano HSCs e ampliato nel unici nicchie microambientali (Gekas, et al 2005, Rodi, et al 2008). Di conseguenza, la placenta è una fonte importante di cellule staminali durante il loro nascita e l&#39;espansione iniziale. In questo articolo, mostriamo le tecniche di dissezione per l&#39;isolamento di murino placenta da 10,5 e E12.5 embrioni, corrispondenti alle fasi di sviluppo di iniziazione di cellule staminali e il picco nella dimensione del pool di HSC nella placenta, rispettivamente. Inoltre, presentiamo un protocollo ottimizzato per dissociazione enzimatica e meccanica del tessuto placentare in cella singola sospensione per l&#39;uso in citometria a flusso o test funzionali. Abbiamo trovato che l&#39;uso di collagenasi per cella singola sospensione della placenta dà rendimenti sufficiente di cellule staminali. Un fattore importante di rendimento HSC dalla placenta è il grado di dissociazione meccanica prima, e la durata di un trattamento enzimatico. Forniamo anche un protocollo per la preparazione di fisso congelati sezioni di tessuto placentare per la visualizzazione di sviluppare HSCs mediante immunoistochimica nelle loro nicchie precise cellulare. Come ematopoietiche antigeni specifici non vengono mantenute durante la preparazione di sezioni in paraffina, si usano abitualmente fisso sezioni congelate per la localizzazione HSCs placentare e progenitori.

Abbiamo identificato la placenta come organo principale ematopoietiche durante lo sviluppo. Abbiamo trovato che le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono entrambi generati e ampliato nella placenta in unica nicchie microambientali. Qui, descriviamo le tecniche sperimentali necessari per l&#39;isolamento e la visualizzazione di cellule staminali nella placenta del mouse.

Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi e di generare tutti i tipi cellulari delle linee ematiche per tutta la durata della vita di un individuo. ...

Ciao, sono Mikkola e benvenuti nel mio laboratorio. L'obiettivo principale del nostro laboratorio è studiare lo sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche. Durante l'embriogenesi, abbiamo identificato la placenta come un organo ematopoietico fondamentale e abbiamo scoperto che le cellule staminali ematopoietiche vengono sia generate che amplificate nella placenta all'interno di nicchie microambientali uniche.Pertanto, la placenta ha un valore notevole come fonte di cellule staminali ematopoietiche durante la loro comparsa e iniziale espansione. Oggi i membri del mio laboratorio mostreranno le tecniche sperimentali necessarie per l'isolamento delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta e la visualizzazione delle HCS nelle loro nicchie microambientali uniche. Ciao, sono Chriss Geka del laboratorio della dottoressa Hannah Mola del Dipartimento di Biologia Cellulare Molecolare e dello Sviluppo presso l'UCLA.Oggi vi mostrerò come dissezionare la placenta del topo e come preparare una sospensione di singole cellule del tessuto placentario per l'analisi FACS di cellule staminali ematopoietiche fetali. Io sono Katrina Rhodes e vi mostrerò come preparare il tessuto placentario per l'immunohistochimica. Cominciamo.Per iniziare, gli embrioni devono prima essere isolati da femmine gravide. Gli animali vengono soppressi secondo procedure approvate. Nel nostro caso, utilizzeremo una dose letale dell'anestetico isoflurano.Per prima cosa, spruzzare l'addome con etanolo ed eseguire una piccola incisione con un paio di forbici. Allontanare la pelle con entrambe le mani per esporre l'addome e aprire il peritoneo con una pinza. Afferrare le corna uterine e raccoglierle utilizzando le forbici a ciascuna estremità distale.Posizionare i corni uterini in una piastra di Petri riempita con PBS e mettere sul ghiaccio. Ricordarsi inoltre di lavare più volte con PBS prima di isolare la placenta utilizzando due pinzette. Iniziare a rimuovere con attenzione il tessuto endometriale che circonda i concetti embrionali.Questi embrioni provengono dal giorno embrionale 12,5, ovvero l'età di sviluppo in cui le cellule staminali ematopoietiche o HSCs raggiungono il loro picco nella placenta. È necessario fare attenzione a non perforare o altrimenti danneggiare la struttura degli embrioni, poiché ciò complicherebbe i successivi passaggi di dissezione. Posizionare i concetti isolati nella nuova piastra di Petri con PBS su ghiaccio e continuare finché tutti i concetti non sono stati liberati dall'endometrio.Trasferire un singolo concetto al piatto di Petri nuovo con PBS posizionato sotto il microscopio. Con due pinzette, staccare l'epidermide dalla placenta G. Rimuovere la maggior quantità possibile di epidermide, poiché le cellule epidermiche interferiranno.Con sospensione cellulare singola e citometria a flusso. Si raccomanda un movimento di distacco liscio e continuo per ottenere i migliori risultati. Va notato che, quando si lavora con embrioni più giovani come questi embrioni al giorno embrionale 10,5 o E 10,5, la deidra circonderà l'intero blastocisto.A differenza degli embrioni a 12,5 gg, a 10,5 gg le cellule staminali ematopoietiche (HSC) stanno appena iniziando a emergere all'interno della placenta. Osservare la notevole differenza di dimensioni tra gli embrioni a 10,5 gg e quelli a 12,5 gg. Recidere il sacco vitellino dalla placenta all'innesto tra i due organi, e staccare delicatamente il sacco vitellino e i vasi allantoidei dalla placenta.Si deve fare attenzione a non danneggiare la placca coriale della placenta, specialmente con embrioni precoci. Tenere con cura la placca coriale della placenta con un paio di pinzette, mentre con l'altra si afferra il cordone ombelicale. Staccare il cordone ombelicale e l'embrione ad esso attaccato dalla placenta.Rimuovere il tessuto in eccesso di cellule giganti ai margini della placenta. Per ridurre al minimo l'aggregazione cellulare durante la preparazione della sospensione monocellulare, raccogliere la placenta in un contenitore adatto, come un tubo Falcon da 15 mL con PBS e 5% FCS, e porlo sul ghiaccio. Eseguire questa operazione per tutte le placente dissezionate. A questo punto, è possibile procedere con la preparazione della sospensione monocellulare per saggi funzionali mediante citometria a flusso, come colture in vitro o trapianti, oppure preparare l'intera placenta per la fissazione tissutale e l'inclusione in blocchi congelati fissati, destinati eventualmente a immunohistochimica.Ora vi mostreremo come ottenere una sospensione di singole cellule dalla placenta per l'analisi fax. Preparare innanzitutto una soluzione di collaghenasi 0,1% in PBS con FCS al 10% e soluzione di penicillina-streptomicina all'1%. Aggiungere un volume appropriato di soluzione di collaghenasi alla placenta in base alla quantità disponibile; si raccomanda un volume pari a due volte il volume della placenta, compreso tra due e cinque millilitri.Usare un ago da 16 gauge montato su una siringa da cinque ml per interrompere meccanicamente il tessuto, passando la soluzione di collaghenasi e la placenta attraverso l'ago per tre volte. Ripetere l'operazione con un ago da otto gauge. Collocare il campione in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per 45 minuti dopo l'incubazione di 45 minuti.Nel passaggio con collagenasi, far passare la soluzione cellulare attraverso un ago da 20 gauge e incubare per ulteriori 45 minuti a 37 gradi. Dopo un'incubazione totale di un'ora e mezza nel passaggio con collagenasi, far passare la soluzione cellulare attraverso aghi da 22 gauge e da 25 gauge, tre volte con ciascun ago. Filtrare ora il campione attraverso un filtro da 50 micrometri collegato a un nuovo tubo Falcon da 15 mL, lavare con PBS più 5% FCS e centrifugare a quattro gradi Celsius per cinque minuti a 300 ×g. A questo punto, si ottiene una sospensione di cellule singole adatta per l'analisi in fax.Vi mostrerò come preparare il tessuto placentare per l'immunohistochimica. L'immunohistochimica del tessuto placentare può essere utilizzata per localizzare le cellule staminali ematopoietiche all'interno del microambiente placentare. Immediatamente dopo l'isolamento della placenta da ciascun embrione, queste vengono poste in PBS freddo 1X, generalmente una piastra a 96 pozzetti è la più adatta per placenti giovani, dal giorno embrionale 8,5 al 11,5; tuttavia, per placenti più mature, a partire dal giorno E 12,5 in poi, una piastra a 24 pozzetti può risultare più comoda.Ogni placenta viene trasferita in una nuova pozzetta riempita con paraformaldeide (PFA) al 4% appena scongelata. Il tessuto viene spostato manualmente in una nuova pozzetta. Tuttavia, per la placenta al giorno E 10.5, è possibile rimuovere con attenzione il PBS mediante pipetta e aggiungere la PFA.È importante che la placenta sia completamente immersa per due-quattro ore a quattro gradi C, a seconda dell'età e delle dimensioni del tessuto. Successivamente trasferire il tessuto in saccarosio al 30%. Oppure, se i tessuti sono molto piccoli e fragili, aspirare il PFA e aggiungere direttamente il saccarosio.In questa fase, la placenta galleggerà nella soluzione. Lasciare il tessuto in incubazione tutta la notte a quattro gradi C. Dopo il passaggio notturno in saccarosio al 30%, i tessuti dovrebbero affondare completamente sul fondo della pozzetta, indicando un'adeguata criopreservazione. Successivamente, rimuovere la metà della soluzione di saccarosio e sostituire il volume con OCT.Riposizionare il tessuto a quattro gradi C per uno o due ore. Questo facilita la penetrazione dell'OCT. Infine, il tessuto verrà trasferito in OCT al cento per cento per un'ora, dopo di che potrà essere incluso.Etichettare gli stampi di plastica con l'identificazione appropriata del tessuto. Estrarre il tessuto dalla soluzione OCT e tagliare la placenta a metà posizionando la placenta di forma discoidale con il lato del cordone ombelicale rivolto verso il basso e tagliando con attenzione mediante una lama pulita, assicurandosi di muovere la lama all'indietro. E in quarto luogo, prima di rilasciare la pressione, per garantire un taglio uniforme.La placenta viene tagliata a metà per ottenere l'orientamento migliore per la successiva visualizzazione delle cellule staminali ematopoietiche placentari. Quindi posizionare una metà della placenta sul fondo dello stampo con il bordo tagliato a contatto con la superficie inferiore dello stampo. Ripetere con un nuovo stampo per l'altra metà.Per le placente di E 10,5, entrambe le metà possono essere posizionate nello stesso stampo utilizzando la stessa tecnica. Quando si versa l'OCT nello stampo, può risultare difficile mantenere la placenta nell'orientamento corretto. Fissare la placenta al suo posto tenendo con una pinzetta la metà del tessuto nel caso della placenta di E 10,5.Tenere una metà del tessuto con una pinzetta e appoggiare l'altra metà del tessuto all'esterno della pinzetta. Versare quindi lentamente la soluzione OCT come descritto per E 12,5. Una volta riempito lo stampo con OCT, posizionare rapidamente lo stampo sul ghiaccio secco.L'OCT diventerà bianco congelando rapidamente il tessuto; posizionare lo stampo in un piccolo sacchetto di plastica e conservarlo immediatamente in un congelatore a meno gradi centigradi. Di seguito è mostrata una sezione rappresentativa di una placenta a E 10,5. È importante che le sezioni includano la lamina coriale, visibile nella parte inferiore dell'immagine, e il labirinto placentare, la regione della placenta deputata allo scambio fetomaterno, mostrata nella parte centrale.Questa sezione è stata colorata con un anticorpo anti-CD31, che ha evidenziato in rosso l'endotelio. I trofoblasti mostrati in marrone sono marcati dalla citocheratina. Il labirinto contiene sia vasi della vascolarizzazione fetale marcati in rosso, sia spazi ematici materni rivestiti dai trofoblasti marroni.Le cellule blu sono cellule ematopoietiche immature positive per CD41 e cellule progenitrici ematopoietiche; notare che si localizzano alla vascolarizzazione fetale. Abbiamo appena mostrato come dissezionare e preparare una sospensione singola di placenta di massa e anche come identificare le cellule staminali ematopoietiche placentari mediante citometria a flusso. Abbiamo inoltre mostrato come preparare sezioni di tessuto placentare per la visualizzazione delle cellule staminali ematopoietiche mediante immunohistochimica.È importante prestare attenzione a alcuni parametri critici durante l'esecuzione di queste procedure. Durante la dissezione placentare, è fondamentale lavorare rapidamente e mantenere gli embrioni e le soluzioni il più possibile freschi per preservare un'elevata vitalità cellulare nella preparazione della sospensione cellulare singola. Il grado di dissociazione meccanica prima e il tempo di incubazione durante il trattamento enzimatico sono i fattori più critici che influenzano la vitalità e la salute cellulare.Infine, quando si esegue un'immunohistochimica, una fissazione eccessiva può causare problemi per alcuni antigeni, mentre una fissazione insufficiente può portare alla distruzione del tessuto. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Questo video mostra come micro-sezionare il sacco vitellino e aorta-gonadi-mesonefro regione da embrioni e l'uso di citometria a flusso per ordinare le cellule staminali ematopoietiche.

Isolamento delle prime cellule staminali emopoietiche da murini sacco vitellino e AGM

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Due tecniche per isolare gocce lipidiche cellulari da 1) cellule di lievito e 2) placente umane sono presentati. Il fulcro di entrambe le procedure è la densità centrifugazione in gradiente, dove lo strato risultante galleggiante contenente le goccioline può essere facilmente visualizzato occhio, estratto, e quantificato mediante analisi Western Blot per la purezza.

Isolamento dei lipidi cellulari Goccioline: due tecniche di purificazione partire da cellule di lievito e placente umane

Qui descritto è un protocollo per isolare e studiare ulteriormente i leucociti infiltranti della decidua basalis e della decidua parietalis - l'interfaccia materno-fetale umana. Questo protocollo mantiene l'integrità dei marcatori della superficie cellulare e produce un numero sufficiente di cellule vitali per le applicazioni a valle, come dimostrato dall'analisi della citometria a flusso.

L&#39;isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

Qui descritto è un protocollo per isolare e analizzare i leucociti infiltranti dei tessuti all'interfaccia materno-fetale (utero, decidua e placenta) dei topi. Questo protocollo mantiene l'integrità della maggior parte dei marcatori di superficie cellulare e produce un numero sufficiente di cellule vitali per le applicazioni a valle, tra cui l'analisi della citometria a flusso.

L&#39;isolamento dei leucociti di tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale

Le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) derivano da (hemogenic) cellule endoteliali specializzate durante lo sviluppo, ma poco si sa circa il processo attraverso il quale alcune cellule endoteliali specificano a diventare la formazione del sangue. Dimostriamo un metodo basato citometria a flusso che permette l'isolamento simultaneo di cellule endoteliali hemogenic e HSPC da tessuti embrionali murine.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

Qui descriviamo i metodi per la dissezione dei tessuti fetali e materni da placenta umana termine, seguito da isolamento e l'espansione delle cellule stromali / staminali mesenchimali (MSC) da questi tessuti.

Isolamento e l&#39;espansione delle staminali mesenchimali stromali derivate / cellule da placenta umana Tissue

Qui, presentiamo un protocollo per la dissezione di cordone umano ombelicale (UC) e il campione placenta fetale in cavo rivestimento (CL), gelatina di Wharton (WJ), cavo-placenta giunzione (CPJ), e placenta fetale (FP) per l'isolamento e caratterizzazione di cellule stromali mesenchimali (MSC) utilizzando la tecnica di espianto.

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare le cellule progenitrici endoteliali da sangue del cordone ombelicale. Alcune delle applicazioni includono l'utilizzo di queste cellule come biomarcatore per identificare i pazienti con rischio cardiovascolare, trattamento delle malattie ischemiche, e costrutti di creazione valvola vascolare e cuore tessutale.

Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano

Questo protocollo viene illustrato un metodo per l'isolamento di cellule deciduali umane primarie raccolti da membrane fetali di placente di termine che possono essere utilizzate per una varietà di applicazioni (cioè immunocitochimica, citometria a flusso, ecc.) con l'obiettivo per studiare il ruolo delle diverse popolazioni cellulari in complicazioni di gravidanza.

Isolamento di cellule deciduali umane primarie dalle membrane fetali del termine intempestivo della placenta

Presentiamo un protocollo passo-passo per l'isolamento di cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs) e HSCs a breve termine (ST-HSCs) utilizzando il sistema reporter Hoxb5.

Metodo di isolamento per cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine

Scopri le tecniche per isolare e analizzare le cellule staminali ematopoietiche dalla placenta murina. Questo metodo consente di visualizzare le nicchie microambientali uniche che supportano lo sviluppo delle HSC durante l'embriogenesi.

Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

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