Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Mi chiamo Jeanette Boudreaux e oggi vorrei guidarvi attraverso i passaggi verso la coltura che rispecchia le cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo. Il lignaggio mieloide DC sta diventando sempre più apprezzato per gli studi sull'interazione immunitaria innata e adattativa, oltre ad essere sempre più utilizzato come piattaforma per lo sviluppo di vaccini. Oggi ti guideremo attraverso i passaggi per isolare le cellule precursori, metterle in coltura e differenziarle in cellule dendritiche.

Successivamente, ti mostrerò un'analisi citofluorimetrica delle cellule prima e dopo la maturazione. Con il ligando del recettore toll-like, le cellule proliferano in vitro durante il periodo di coltura, quindi aspettatevi di vedere un aumento da cinque a otto volte del numero totale di cellule rispetto ai precursori che avete giocato anche il giorno zero. Le procedure che vi mostro oggi saranno dimostrate su un banco da laboratorio aperto, ma per mantenere la sterilità, vi consiglio di fare le vostre colture in una cabina di sicurezza biologica o in una cappa a flusso lanare.

Per iniziare, avrai bisogno di una siringa da 10 mil con un ago calibro 25 riempito di PBS, un paio di pinze curve, un paio di pinze dritte, forbici affilate e un paio di forbici smussate che possono essere utilizzate per tagliare l'osso. Dopo l'eutanasia del topo donatore, preparare le zampe per l'incisione spruzzandole con etanolo al 70%, afferrare saldamente la caviglia del topo usando una pinza smussata e usare forbici affilate per tagliare con cura la pelle e il tessuto muscolare delle gambe. Inizia dal tendine d'Achille per rimuovere la pelle dalla parte posteriore della gamba, facendo attenzione a non danneggiare l'osso.

Quindi, taglia via la pelle e il muscolo dalle parti anteriori della gamba. Dopo questo passaggio, il tessuto muscolare profondo della gamba dovrebbe essere esposto. Fai scorrere un braccio della pinza curva tra la tibia e il muscolo rimanente per rompere il tessuto connettivo che li tiene insieme e usa le forbici affilate per tagliare il tendine che ciascuna estremità libera il muscolo da rimuovere.

Continuare a pulire la muscolatura dalla tibia in questo modo fino a quando l'osso non è esposto e non rimane tessuto muscolare. Per pulire il femore, afferrare l'articolazione del ginocchio con la pinza smussata e utilizzare la pinza curva per stuzzicare ancora una volta il tessuto muscolare circostante. Tagliate via la muscolatura rimanente con le forbici, facendo attenzione a non danneggiare l'osso.

Continua a pulire il tessuto muscolare fino a quando la testa del femore non è chiaramente esposta all'interno dell'articolazione dell'anca. Fai scorrere le forbici ossee lungo il femore e sopra il grande trocantere nell'articolazione dell'anca. Con un taglio deciso, separare l'osso e metterlo in PBS su ghiaccio.

Se sono necessarie molte cellule dendritiche, può essere raccolta anche la seconda zampa. Per rimuovere il midollo osseo, assicurati che non rimanga tessuto muscolare alle estremità dell'osso. Quindi, usando le forbici ossee, separare le ossa dell'articolazione del ginocchio.

Quindi tagliare le epifisi del primo osso. Inserire la punta dell'ago al centro dell'osso e spingere con decisione lo stantuffo della siringa per forzare il midollo osseo in un piatto pulito. Continua fino a quando non vedi che il midollo è stato completamente lavato e ripeti l'operazione con le ossa rimanenti.

Utilizzando l'estremità in gomma di uno stantuffo da una siringa da un mil, dissociare delicatamente il midollo osseo in una sospensione a singola cellula schiacciando con un movimento su e giù. Raccogliere il midollo osseo in una provetta da centrifuga conica. Sciacquare il piatto con PBS e aggiungerlo al tubo.

PT le celle mediante centrifugazione per cinque minuti a 1500 giri/min. A questo punto, alcuni ricercatori includeranno un passaggio per licare i globuli rossi. Tuttavia, abbiamo riscontrato che questo passaggio non è necessario.

Risospendere il pellet in terreno CC e contare su un emocitometro. Questo preparato è una miscela di cellule del midollo osseo e una frazione in grado di differenziarsi in cellule dendritiche. La fornitura di G-M-C-S-F favorirà lo sviluppo delle dcs, ma non degli altri tipi di cellule.

Pertanto, non è necessario esaurire le altre cellule. Per la placcatura, dobbiamo contare le cellule del midollo osseo, ma non gli eritrociti. Queste sono le celle più grandi e luminose.

Ad esempio, in questo campo, conteremmo queste celle ma non queste. È il momento di impiattare le cellule. Per la coltura DC, non utilizziamo piastre rivestite di coltura.

I Dcs si differenziano meglio in polistirolo. Le piastre di Petri piastrano le cellule a una densità di 200.000 precursori per mil in terreni DC, integrate con 40 nanogrammi per mil G-M-C-S-F e incubate a 37 gradi per una settimana. Il terzo giorno di coltura, rinfrescare i terreni aggiungendo metà del volume totale di terreni CC freschi integrati con G-M-C-S-F.

Il sesto giorno. Aggiornare il terreno sostituendone nuovamente un terzo con un terreno contenente G-M-C-S-F per raccogliere le cellule. Il settimo giorno, rimuovere il terreno che contiene dcs non aderenti e raccoglierlo in un tubo conico.

Raschiare il piatto usando un raschietto per colture tissutali, quindi sciacquare il raschietto e il piatto e aggiungere questo risciacquo alle cellule non aderenti nel tubo conico. A questo punto, puoi iniziare i tuoi esperimenti. I tuoi dcs sono pronti.

Ecco come appaiono le cellule il primo giorno di coltura. Subito dopo la placcatura. Si noti che le celle sono piccole, rotonde e non aderenti.

Dopo sette giorni di coltura, molte, ma non tutte, le cellule hanno aderito alla piastra. Molte delle cellule hanno sviluppato dendriti evidenti in queste condizioni di coltura. In genere, dal 70 al 90% delle cellule raccolte sono CD 11 C positive.

A questo punto, le cellule sono differenziate, ma relativamente immature. I ricercatori spesso scelgono di promuovere un fenotipo maturo stimolando le cellule durante la notte con un ligando del recettore toll-like, ad esempio. Ecco alcuni grafici rappresentativi della citometria a flusso della dcs dopo la stimolazione notturna con CPG fenotipico.

I segni di maturazione sono mostrati in alto. I pannelli CD 40 e CD 86 sono sovraregolati come dimostrato da uno spostamento della linea blu, che rappresenta la popolazione stimolata. Allo stesso modo, un grafico a punti raffigurante CD 11 C e IL 12 nel pannello inferiore dimostra la produzione della citochina.

In risposta alla CPG, è ora possibile applicare diverse modifiche alle cellule dendritiche. Ad esempio, possono essere stimolati con ligandi del recettore tolike o citochine per migliorare il loro stato di maturazione e la capacità di presentare l'antigene. Inoltre, molti studi sui vaccini hanno applicato la pulsazione di peptidi o proteine al dcs prima del loro uso in vivo come strategia di immunizzazione.

In bocca al lupo per i tuoi esperimenti.