Name: Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-25T18:13:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Impara a coltivare cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo murino. Questo metodo mostra l'isolamento, la differenziazione e l'analisi citometrica per studiare la maturazione cellulare e la produzione di IL-12.

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JB è sostenuto da borse di studio dalle scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC). Il supporto per questo progetto è stato fornito dal Canadian Institutes of Health Research, Grant MOP-67066.

Questo protocollo è stato adattato da Lutz et al 1. Raccolta ed elaborazione di midollo osseo <ol><li> Isolamento della tibia e femore: eutanasia il mouse donatore e spruzzare le gambe con il 70% di etanolo. Afferrare la caviglia prima saldamente con una pinza smussato e cominciare a tagliare via la pelle e la muscolatura sottostante per esporre la tibia. Per evitare di danneggiare l&#39;osso, tagliato lentamente e in parallelo alla tibia, lasciando intatto il ginocchio. Per pulire il femore, immobilizzare l&#39;articolazione del ginocchio afferrando con una pinza contundente. Pulire via la muscolatura con un paio di forbici affilate e pinze curve. Continuare verso l&#39;alto fino a quando l&#39;anca è esposto e forbici può essere posizionato tra la testa del femore e dell&#39;anca. Togliere le ossa, tagliando tra comuni femore e dell&#39;anca e del luogo in tampone fosfato (PBS) su ghiaccio. </li><li> La rimozione del midollo osseo: Pulizia muscolatura residua dalle ossa con le forbici e pinze curve. Tagliare il epifisi di ogni osso e individuare la cavità centrale. Utilizzando una siringa da 10 ml caricato con PBS e un 25G0.5 &quot;ago, a livello del midollo osseo in un non-tessuto piatto rivestito di Petri. </li><li> L&#39;elaborazione di midollo osseo: Utilizzare l&#39;estremità in gomma dello stantuffo da una siringa da 1 ml per dissociare il midollo osseo in una cella singola sospensione (utilizzare un su e giù, non raschiando movimento). Raccogliere midollo osseo in un tubo conico falco, e risciacquare midollo osseo residuo con PBS. </li></ol> Coltura di cellule dendritiche <ol><li> Risospendere le cellule in DC media e precursori DC contare su un emocitometro (Figura 1). Vedrete le cellule di varie dimensioni, i precursori DC sono i più grandi e più brillanti. Differenziale contano solo queste cellule. Da due femori e due tibie di una wild-type C57BL / 6 del mouse (6-8 settimane), si dovrebbe aspettare tra 25-40 x 10 6 precursori DC totale. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_3/article769_figure_1.jpg" alt="" width="218" height="217" /> Figura 1 </li><li> Celle di coltura ad una densità di 2 x 10 5 precursori DC / mL in DC dei media integrato con 40 ng / mL ricombinante murino GM-CSF. Cellule piastra in lastre di polistirene non tessuto rivestito di Petri. </li></ol> Aggiungi media (giorno 3) Per aggiornare i media, aggiungete la metà del volume totale di mezzi freschi integrata con 40 ng / mL GM-CSF. Sostituire un terzo della media (giorno 6) e la maturazione Per aggiornare i media, con attenzione rimuovere un terzo del volume totale dei media e sostituire questo volume con nuove mezzi di comunicazione integrata con DC 40 ng / mL GM-CSF al giorno 6 di cultura. Se lo si desidera, le cellule dendritiche possono essere stimolati per la maturazione con citochine o toll-like ligandi del recettore. Nel video, DC erano maturate dalla stimolazione durante la notte con 5 ng / ml CpG. Raccolta di cellule dendritiche Cultura DC è completa (Figura 2). Cellule saranno sia in sospensione e liberamente aderito alla piastra. Aderito cellule possono essere rimosse raschiando il piatto con un raschietto coltura di tessuti e risciacquo con PBS. Il numero totale di cellule aumenterà 5-8 volte durante la settimana di cultura e il periodo di differenziazione, quindi, si aspettano di raccogliere 1-1,6 x 10 6 cellule / ml. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_5/article769_figure_2.jpg" alt="Figura 2" width="407" height="358" /> Figura 2 Reagenti <ol><li> DC dei media <ol><li> RPMI-1640 mezzi di comunicazione, integrato con: </li><li> 10% di siero fetale bovino </li><li> 100 UI / ml penicillina </li><li> 100 mg / ml streptomicina </li><li> 1% di L-glutammina </li><li> 0,1% 2-mercaptoetanolo </li><li> 1X aminoacidi non essenziali </li><li> 1X sodio piruvato </li></ol></li><li> Ricombinante murino GM-CSF <ol><li> rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, nessun catalogo. 315-03) </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).</li>
</ol>

DC sono utili per gli studi di interazioni immune innata e adattativa, e può essere impiegato come vettore di vaccino. In questo video, abbiamo dimostrato i passi per isolare midollo osseo e differenziare cellule dendritiche mieloidi in vitro. Dopo il periodo di coltura, queste cellule possono essere visualizzate sia le cellule al microscopio come aderenti, che spesso possiedono dendriti, e non aderente cellule rotonde. La DC può essere ulteriormente manipolata per la presentazione dell&#39;antigene da pulsante con l&#39;antigene o stimolat...

<table><tbody><tr><td>GM-CSF murino ricombinante</td><td>Reagente</td><td>Peptrotech</td><td>315-03</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Mieloide cellule dendritiche (DC) sono spesso usati per studiare le interazioni tra meccanismi immunitari innati e adattivi e la prima risposta alle infezioni. Perché questi sono l&#39;antigene più potenti cellule presentanti l&#39;, DC sono sempre più usato come vettore vaccino per studiare l&#39;induzione di risposta immunitaria antigene-specifica. In questo video, dimostriamo la procedura per la raccolta delle tibie e femori da un topo donatore, l&#39;elaborazione del midollo osseo e differenziare DC in vitro. Le proprietà del cambiamento DC a seguito di stimolazione: le cellule dendritiche immature sono fagociti potenti, mentre DC mature sono capaci di presentazione dell&#39;antigene e di interazione con CD4 + e CD8 + T. Questo cambiamento di attività funzionale corrisponde al upregulation dei marcatori di superficie delle cellule e la produzione di citochine. Molti agenti possono essere utilizzati per DC mature, tra cui citochine e Toll-like ligandi del recettore. In questo video, dimostriamo confronti citometria a flusso di espressione di due molecole co-stimolatorie, CD86 e CD40, e le citochine, IL-12, a seguito di stimolazione durante la notte con trattamento di CpG o modelli. Dopo la differenziazione, DC può essere ulteriormente manipolata per l&#39;utilizzo come vettore vaccino o per generare una risposta immunitaria antigene-specifica in vitro utilizzando impulsi peptidi o proteine, o trasdotte con vettori virali ricombinanti.

Questo video mostra la procedura per la differenziazione delle cellule dendritiche mieloidi dal midollo osseo dei topi. Isolamento di tibia e femore del mouse, e la lavorazione del midollo osseo sono dimostrati. Immagini che dimostrano morfologia cellulare prima e dopo la differenziazione, e le figure raffiguranti fenotipo delle cellule e IL-12 maturazione di produzione utilizzando i seguenti CpG sono mostrati.

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Le cellule dendritiche (DC) mieloidi sono frequentemente utilizzate per studiare le interazioni tra i meccanismi immunitari innati e adattativi e la risposta precoce a...

Il mio nome è Jeanette Boudreaux e oggi desidero illustrarvi i passaggi per coltivare in vitro cellule dendritiche mieloidi a specchio a partire da precursori midollari. La linea cellulare delle DC mieloidi sta assumendo un'importanza crescente negli studi sull'interazione tra immunità innata e adattativa, oltre ad essere sempre più utilizzata come piattaforma per lo sviluppo di vaccini. Oggi vi guideremo attraverso i passaggi necessari per isolare le cellule precursori, coltivarle in vitro e differenziarle in cellule dendritiche.In seguito, vi mostrerò un'analisi mediante citometria a flusso delle cellule prima e dopo la maturazione. In presenza del ligando del recettore di tipo Toll, le cellule proliferano in vitro durante il periodo di coltura; pertanto, ci si aspetta un aumento di circa cinque-otto volte del numero totale di cellule rispetto ai precursori seminati al giorno zero. Le procedure che vi mostrerò oggi verranno dimostrate su un bancone da laboratorio aperto, ma per mantenere la sterilità, consiglio di eseguire le colture all'interno di una cappa a sicurezza biologica o di una cappa a flusso laminare.Per iniziare, sarà necessaria una siringa da 10 mil con ago da 25 ga

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Biologia

Presentazione dell'antigene in organi linfatici secondari da parte delle cellule dendritiche è cruciale per l'avvio della cellula T mediata risposta immunitaria adattativa. Qui mostriamo la cultura del midollo osseo derivate le cellule dendritiche murine, di attivazione e di etichettatura per 2-fotoni imaging.

Generazione di cellule derivate dal midollo osseo dendritiche murini per l&#39;uso in 2-fotone Imaging

Questo video descrive un protocollo per la generazione di cellule dendritiche - cellule chiave che presentano l'antigene che attivano le cellule T - dal midollo osseo di un topo adulto.

Generazione di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo: un metodo per generare cellule dendritiche dal midollo osseo di topo

Questo video mostra un test in vitro per generare cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) da cellule progenitrici linfoidi comuni (CLP). Dopo la co-coltura di CLP purificati con cellule feeder irradiate con γ in presenza del ligando tirosin-chinasi-3 (FL) Fms-like, i CLP si differenziano in pDC non aderenti, la cui presenza è confermata mediante citometria a flusso.

Generazione in vitro di cellule dendritiche plasmacitoidi da progenitori linfoidi comuni

Le cellule dendritiche immature possono essere differenziate selettivamente in cellule dendritiche tolleranti o mature per regolare l'equilibrio tra immunità e tolleranza. Questo lavoro presenta un mezzo per generare da cellule dendritiche immature derivate da monociti (moDC), moDC in vitro tollerogeniche e mature che differiscono nei fenotipi metabolici.

Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

Le cellule del midollo osseo coltivate con il fattore stimolante le colonie di macrofagi granulociti (GM-CSF) generano una coltura eterogenea contenente macrofagi e cellule dendritiche (DC). Questo metodo evidenzia l'utilizzo del legame MHCII e ialuronano (HA) per differenziare i macrofagi dalle DC nella coltura GM-CSF. I macrofagi in questa cultura hanno molte somiglianze con i macrofagi alveolari.

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Qui, dimostriamo come i monociti vengono isolati mediante separazione di biglie magnetiche dalle cellule mononucleate del sangue periferico dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue umano anticoagulato. Dopo un'incubazione di 5 giorni, i monociti umani vengono differenziati in cellule dendritiche immature e sono pronti per le procedure sperimentali in un contesto non clinico.

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Qui forniamo un metodo per identificare e isolare un numero elevato di GM-CSF guidato cellule mieloidi utilizzando l'ordinamento delle cellule ad alta velocità. Cinque popolazioni distinte (comune dei progenitori mieloidi, progenitori del granulocita/macrofago, monociti, macrofagi monocito-derivati e DCs monocito-derivato) possono essere identificati sulla base di Ly6C e CD115 espressione.

Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia

Dimostriamo come identificare e isolare 6 sottoinsiemi dei progenitori mieloidi dal midollo osseo murino utilizzando una combinazione di magnetico e fluorescenza ordinamento (MACS e FACS). Questo protocollo può essere usato per analisi di RNA/proteine, in vivo gli esperimenti di trasferimento adottivo e saggi di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido).

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Qui, presentiamo un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo ad alta purezza dai topi dopo 7 giorni di coltura con 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo dai topi.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Qui, descriviamo le condizioni di coltura in vitro , l'isolamento e l'aumento della generazione di vescicole extracellulari (EV) da Echinococcus granulosus. Le piccole vescicole extracellulari sono state caratterizzate dalla diffusione dinamica della luce e dalla microscopia elettronica a trasmissione. L'assorbimento da parte delle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo e la loro modulazione fenotipica sono stati studiati mediante microscopia confocale e citometria a flusso.

Isolamento e captazione delle cellule dendritiche di piccole vescicole extracellulari da Echinococcus granulosus

Impara a coltivare cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo murino. Questo metodo mostra l'isolamento, la differenziazione e l'analisi citometrica per studiare la maturazione cellulare e la produzione di IL-12.

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

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