A cellula intera Recordings of Light Evocati eccitatorio Correnti Synaptic nel Slice Retinal

Oggi vi mostrerò come preparare sezioni retiniche del salamandro tigre per registrazioni con tecnica del patch clamp. Per prima cosa, preparerò due tipi di vetrini. Utilizziamo vetrini ai quali è applicato un pozzetto adesivo, in modo da poterli usare come camere per liquidi.

Sul primo vetrino, pongo due strisce parallele di grasso da vuoto. Poi prendo della carta da filtro e la taglio in pezzi rettangolari con un taglio netto. Ora pongo uno dei pezzi sulle strisce di grasso e lo premo bene in modo che aderisca completamente al vetrino.

Faccio lo stesso per l'altro pezzo. Il secondo tipo di vetrino presenta piccoli blocchetti di gomma incollati. Per ora, aggiungo semplicemente un po' di grasso da vuoto tra i blocchetti; inserisco anche un nuovo pezzo di lama di rasoio nel taglia tessuti.

Infine, preparo gli strumenti necessari per la dissezione, ovvero due paia di pinzette, un paio di forbici e uno strumento per rimuovere l'occhio dalla testa al fine di registrare le correnti evocate dalla luce. La dissezione va eseguita sotto luce infrarossa, ma a scopo dimostrativo, ora lavorerò alla luce visibile. Rimuovo innanzitutto l'occhio e lo pongo sul microscopio su un pezzo di carta da filtro, che ho inumidito con soluzione di Ringer fredda.

Rimuovo quindi il tessuto connettivo in eccesso dal bulbo oculare per assicurarmi che non danneggi l'occhio. Taglio sempre lungo la superficie. Questo è ciò che si vede attraverso il microscopio.

Successivamente, utilizzo una lametta per praticare una piccola incisione nella cornea. Per fare ciò, tengo fermo l'occhio con la pinzetta mentre premo il bordo della lametta sulla cornea. Poi trattengo la cornea con la pinzetta e la rimuovo con le forbici per estrarre il cristallino.

Esercito una leggera pressione sui bordi della coppa oculare per accedere facilmente alla lente con la pinzetta. Successivamente, rimuovo l'iride. Afferro l'iride con la pinzetta e taglio lungo l'ora serrata fino a quando rimane soltanto la coppa oculare.

Quindi taglio la tazza in due pezzi rettangolari. La taglio prima a metà e poi rifilo i bordi superiore e inferiore. Ora prendo uno dei vetrini che ho preparato in precedenza, sollevo un pezzo di tazza e lo posiziono con il lato della retina rivolto verso il basso sulla carta filtrante.

Sollevo quindi questa sclera in modo che solo la retina rimanga sul vetrino. Successivamente, aggiungo rapidamente la nostra soluzione nella camera. Ripetiamo la procedura per il secondo frammento di retina.

Ma questa volta è possibile osservare attraverso il microscopio mentre si appoggia la retina sulla carta filtro. Uso la pinzetta con la mano sinistra per premere delicatamente sulla sclera. Infine, taglio la retina in fette larghe da 200 a 300 micrometri.

Successivamente, scelgo una sezione da utilizzare per i miei esperimenti. Per selezionare una sezione adeguata, devo ruotare le sezioni di 90 gradi in modo da poter osservare i livelli della retina. Scelgo una sezione che appare integra e mostra bande orizzontali distinte che indicano i diversi strati.

Per spostare i preparati da un vetrino all'altro, creo un ponte di Ringer e successivamente sposto con attenzione i preparati attraverso la soluzione. Quando appoggio la sezione, la spingo contro i blocchetti di gomma in modo che la carta filtro sia orientata verticalmente rispetto al vetro. Ora sono pronto per la registrazione mediante patch clamp.

Conserviamo la soluzione intracellulare in piccole porzioni nel congelatore, in modo da scongelare solo la quantità effettivamente necessaria per un singolo giorno. Prima di riempire gli elettrodi, filtriamo la soluzione per rimuovere le piccole particelle che potrebbero ostruire la punta dell'elettrodo. Gli elettrodi per il patch sono preparati da capillari in vetro borosilicato per la registrazione dai neuroni gangliari.

Scelgo un'impostazione di tiraggio che produrrà resistenze degli elettrodi comprese tra due e quattro megaohm. Quando riempio gli elettrodi, devo assicurarmi che non ci siano bolle d'aria nella punta dell'elettrodo. Dare dei colpetti al vetro con il dito aiuta a rimuovere le bolle.

Questo è il supporto dell'elettrodo collegato allo stadio della testa. Il rullo elettrodico contiene un filo di cloruro d'argento. Questa è l'elettrodo di riferimento con un ponte niga.

Ecco la pipetta di perfusione. È collegata a un sistema di microperfusioni a otto canali. La perfusione principale è a gravità, quindi si tratta semplicemente di una bottiglia riempita con soluzione, e la soluzione scorre attraverso questo tubo nella camera di registrazione.

Per poter registrare al buio, ho collegato una telecamera a infrarossi alla porta laterale del microscopio, che è a sua volta collegata a un monitor televisivo. Alla porta superiore ho collegato un proiettore di immagini, che mi permette di proiettare stimoli visivi sulla retina. E infine, l'amplificatore per la tecnica del patch clamp.

Ora pongo la sezione retinica sotto il microscopio e aggiungo l'elettrodo di terra nel bagno per impostare la principale perfusione. Successivamente, aggiungo il tubo dal sistema di perfusione a gravità. Il tubo di vetro sull'altro lato è collegato a un'aspirazione sotto vuoto, che mantiene costante il livello del fluido.

Verifico inoltre che un tubo di aspirazione sia collegato alla spalla elettrica. Successivamente, posiziono la pipetta di microperfusione. La abbasso nel bagno seguendo con l'obiettivo del microscopio.

Una volta avvicinatomi alla sezione, la ritraggo leggermente in modo che la soluzione colpisca la sezione. Quando attivo la perfusione, dovrei vedere la sezione muoversi leggermente, come in questo caso. Cerchiamo ora una buona cellula da cui registrare.

Stiamo cercando le cellule gangliari, che si trovano nella parte inferiore della sezione. Ora preparo l'elettrodo prima di immergerlo nel bagno; aggiungo una leggera pressione positiva. Una volta individuato l'elettrodo al microscopio, lo abbasso posizionandolo direttamente sopra la sezione per eseguire il patching su una cellula.

Passo all'obiettivo da 40x. Ora azzero la corrente di base e verifico la resistenza dell'elettrodo. Il test del sigillo consiste in una sequenza di impulsi di 10 millivolt, che mi permette di verificare se ho stabilito un sigillo stretto tra l'elettrodo e la cellula.

Ora abbasso l'elettrodo sulla cellula bersaglio. Non appena vedo una fossetta sul corpo cellulare, rilascio la pressione positiva dal tubo, stabilendo così un sigillo stretto. La resistenza è ora così elevata che il tracciato della corrente appare piatto.

I piccoli picchi sono artefatti di capacità provenienti dall'elettrodo. Questi possono essere compensati in questo modo, quindi ora sono scomparsi. Ora proverò a penetrare nella cellula.

Per fare ciò, applico con attenzione piccoli impulsi di aspirazione al tubo collegato alla spalla dell'elettrodo e, se tutto funziona correttamente, si osserva un cambiamento nella traccia della corrente come questo. Le piccole oscillazioni che si vedono ora sono attraversate dalla capacità della membrana e possono essere compensate. Si tratta ora di una preparazione effettuata al buio. Vediamo se riusciamo a registrare risposte evocate dalla luce.

Il tracciato che si può osservare sull'oscilloscopio rappresenta la risposta alla corrente di una cellula gangliare bloccata in tensione a meno 60 millivolt. Gli stimoli luminosi che utilizziamo sono barre chiare e scure presentate su uno sfondo uniforme costante. Il software del nostro laboratorio mostra la registrazione completa di un singolo tentativo.

Si può osservare che questa è una cellula di tipo off, in risposta all'inizio di una barra scura e alla cessazione di una barra luminosa. La linea bianca in alto indica la durata dello stimolo. Ora possiamo eseguire esperimenti in cui perfondiamo diversi agenti farmacologici.

Ad esempio, possiamo bloccare l'inibizione sinergica GABAergica e glicinergica. Dopo aver atteso meno di un minuto, di solito possiamo iniziare a osservare qui gli effetti del farmaco. La risposta è diventata più intensa e più prolungata.

La preparazione di fettine retiniche è stata ampiamente utilizzata per registrare le correnti sinaptiche da diverse cellule nella retina e, aggiungendo un colorante fluorescente alla soluzione dell'elettrodo, è possibile confermare facilmente il tipo cellulare. Anatomicamente, utilizziamo qui la salamandra TGA larvale come modello animale. Il fatto che le salamandre siano animali a sangue freddo e abbiano cellule retiniche di grandi dimensioni offre condizioni di registrazione vantaggiose, ma la stessa tecnica può essere applicata a preparati mammiferi.