A cellula intera Recordings of Light Evocati eccitatorio Correnti Synaptic nel Slice Retinal

Oggi ti mostrerò come preparare fette di retina della salamandra tigre per le registrazioni con patch clamp. Per prima cosa, preparerò due tipi di vetrini da microscopio. Utilizziamo vetrini che hanno un adesivo ben attaccato in modo da poterli utilizzare come camere del fluido.

Sul primo vetrino, posiziono due bande parallele di grasso per vuoto. Poi prendo della carta da filtro e la taglio a pezzi rettangolari con un rialzo di luce. Ora posiziono uno dei pezzi sui binari del grasso e lo spingo verso il basso in modo che sia ben attaccato alla slitta.

Faccio lo stesso per l'altro pezzo. Il secondo tipo di scivolo ha piccoli blocchi di gomma incollati ad esso. Per ora, ho solo aggiunto un po 'di grasso sottovuoto Tra i blocchi, ho anche messo un nuovo pezzo di lama di rasoio nell'affettatrice per tessuti.

Infine, ho stabilito gli strumenti di cui avrò bisogno durante la dissezione, che sono due paia di pinze, un paio di forbici e uno strumento per rimuovere l'occhio dalla testa per registrare le correnti luminose evocate. Si dovrebbe eseguire la dissezione sotto la luce IR, ma a scopo dimostrativo, ora lavorerò alla luce. Per prima cosa tolgo l'occhio e lo posiziono al microscopio su un pezzo di carta velina, che ho inumidito con una soluzione di ringer ghiacciata.

Quindi rimuovo il tessuto connettivo in eccesso dal bulbo oculare per assicurarmi che non danneggi l'occhio. Taglio sempre lungo la superficie. Questo è ciò che si vede attraverso il microscopio.

Successivamente, uso una lama di rasoio per fare una piccola fessura nella cornea. Per fare ciò, tengo premuto l'occhio con la pinza mentre spingo verso il basso il bordo della lama del rasoio sulla cornea. Quindi tengo la cornea con il forcipe mentre la rimuovo con le forbici per estrarre l'obiettivo.

Faccio un po' di pressione sui bordi dell'oculare in modo da poter accedere facilmente alla lente con il forcipe. Successivamente, rimuovo l'iride. Mi aggrappo all'iride con la pinza mentre taglio l'aura serato fino a quando non rimane solo l'oculare.

Ho poi tagliato la tazza in due pezzi rettangolari. Prima l'ho tagliato a metà e poi ho rifilato i bordi superiore e inferiore. Ora prendo uno dei vetrini che ho preparato in precedenza, prendo un pezzo di tazza e lo posiziono con la retina rivolta verso il basso sulla carta da filtro.

Quindi tiro su questa sclera in modo che solo la retina rimanga sul vetrino. Dopodiché, aggiungo rapidamente, suona la nostra soluzione alla camera. Ripetiamo la procedura per il secondo pezzo di retina.

Ma questa volta puoi guardare attraverso il microscopio mentre metti la retina sulla carta da filtro. Uso la pinza nella mano sinistra per spingere con cautela verso il basso la sclera. Infine, ho tagliato la retina in fette larghe da 200 a 300 micrometri.

Successivamente, scelgo una fetta da utilizzare per i miei esperimenti. Per scegliere una buona fetta, ho bisogno di ruotare le fette di 90 gradi in modo da poter vedere gli strati della retina. Scelgo una fetta che sembra integra e mostra bande orizzontali distinte che indicano i diversi strati.

Per spostare le diapositive da una diapositiva all'altra, creo un ponte di suonerie e poi sposto con attenzione le diapositive attraverso la soluzione. Quando metto giù la fetta, la spingo contro i blocchi di gomma in modo che la carta da filtro sia orientata verticalmente rispetto al vetro. Ora sono pronto per la registrazione con patch clamp.

Conserviamo la soluzione intracellulare in piccole porzioni nel congelatore in modo da vedere solo la quantità di cui abbiamo effettivamente bisogno in un giorno. Prima di riempire gli elettrodi, filtriamo la soluzione per rimuovere le piccole particelle che potrebbero bloccare la punta dell'elettrodo. Gli elettrodi patch vengono estratti da una fresa in vetro capillare di silicato per registrare dalle cellule ganglionari.

Scelgo un'impostazione pull che produrrà resistenze degli elettrodi comprese tra due e quattro mega ohm. Quando riempio gli elettrodi, voglio assicurarmi che non ci siano bolle d'aria nella punta dell'elettrodo. Sfiorare il vetro con il dito aiuta a rimuovere le bolle.

Questo è il portaelettrodo fissato allo stadio principale. L'elettrorullo contiene un filo di cloruro d'argento. Questo è l'elettrodo di terra con un ponte niga.

Ecco la pipetta per perfusione. È collegato a un sistema di microperfusione a otto canali. La perfusione principale è guidata dalla gravità, quindi è solo una bottiglia piena di ali, e la soluzione scende attraverso questo tubo nella camera di registrazione.

Per poter registrare al buio, ho una fotocamera IR collegata alla porta laterale del microscopio, che è collegata a uno schermo TV. Sulla porta superiore, ho collegato un proiettore di immagini, che mi permette di proiettare stimoli visivi sulla retina. E infine, l'amplificatore patch clamp.

Ora metto la fetta di retina al microscopio e aggiungo l'elettrodo di terra al bagno per impostare la profusione principale. E poi, aggiungi il tubo dal sistema a profusione per gravità. Il tubo di vetro sull'altro lato è collegato all'aspirazione del vuoto, che mantiene costante il livello del fluido.

Mi assicuro anche che un tubo di aspirazione sia collegato all'elettrospalla. Successivamente, posiziono la pipetta per microperfusione. Lo abbasso nella vasca da bagno Seguendo con l'obiettivo del microscopio.

Una volta che mi avvicino alla fetta, la tiro un po' indietro in modo che la soluzione colpisca la fetta. Quando accendo la perfusione, dovrei vedere la fetta muoversi leggermente come qui. Cerchiamo ora una buona cella da cui registrare.

Stiamo cercando cellule ganglionari, che si trovano nella parte inferiore della fetta. Ora preparo l'elettrodo prima di entrare nel bagno con l'elettrodo, aggiungo un po' di pressione positiva. Una volta trovato l'elettrodo al microscopio, lo abbasso sotto la sua destra sopra la fetta per applicare un patch su una cellula.

Sono passato all'obiettivo 40x. Ora azzero la corrente di base e controllo la resistenza dell'elettrodo. Il test di tenuta è una sequenza di impulsi da 10 millivolt, che mi aiuta a vedere se ho stabilito una tenuta ermetica tra l'elettrodo e la cella.

Ora abbasso l'elettrodo sulla cella bersaglio. Una volta che vedo una fossetta sul corpo della cellula, rilascio la pressione positiva dal tubo, che stabilisce una tenuta ermetica. La resistenza è ora così alta che la traccia di corrente sembra piatta.

I piccoli picchi sono artefatti di capacità dell'elettrodo. Questi possono essere compensati in questo modo, quindi ora sono spariti. Quindi ora cercherò di entrare nella cella.

Per fare ciò, ho messo con cura piccoli impulsi di aspirazione sul tubo collegato alla spalla dell'elettrodo e, se tutto funziona correttamente, si vede la traccia di corrente cambiare in questo modo. I picchi che potete vedere ora sono attraversati dalla capacità della membrana e possono anche essere compensati per questo, ora è una preparazione che è stata preparata al buio. Vediamo se siamo in grado di registrare le risposte evocate dalla luce.

La traccia che si può vedere sull'oscilloscopio è la risposta in corrente di una tensione di una cella gangliare bloccata a meno 60 millivolt. Gli stimoli luminosi che utilizziamo sono barre luminose e scure presentate su uno sfondo uniforme e costante. Il nostro software per uso di laboratorio mostra la registrazione completa di una prova.

Si può vedere che si tratta di una cella off come risposta all'inizio di una barra scura e all'offset di una barra luminosa. La linea bianca in alto indica la durata dello stimolo. Ora possiamo eseguire esperimenti in cui perfondiamo diversi agenti farmacologici.

Ad esempio, possiamo bloccare l'inibizione sinergica GABAergica e Gly. Dopo aver atteso meno di un minuto, di solito possiamo iniziare a vedere gli effetti del farmaco qui. La risposta è diventata più forte e più prolungata.

La preparazione della fetta di retina è stata ampiamente utilizzata per registrare le correnti sinaptiche provenienti da diverse cellule della retina e, se si aggiunge un colorante fluorescente alla soluzione dell'elettrodo, il tipo di cellula può essere facilmente confermato. Anatomicamente, qui usiamo la salamandra larvale TGA come modello animale. Il fatto che le salamandre siano animali a sangue freddo e abbiano grandi cellule retiniche fornisce condizioni di registrazione vantaggiose, ma la stessa tecnica può essere applicata ai preparati di mammiferi.