Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

Ciao, sono Stefan Burani del laboratorio del Dottor Frank Zawa del Dipartimento di Biochimica dell'Università della California a Riverside. Oggi vi mostreremo un procedimento di immunoprecipitazione della cromatina. Cominciamo dunque.

Questa procedura inizia con l'incrocio incrociato mediante formaldeide di cellule staminali embrionali umane prima dell'incrocio incrociato. Le cellule staminali embrionali umane vengono scongelate dall'azoto liquido per cinque minuti a 37 gradi Celsius, quindi lavate con il mezzo di coltura. Le cellule vengono quindi seminate in piastre da sei pozzetti rivestite con gelatina e lasciate espandere per due o tre giorni.

Per ogni reazione di immunoprecipitazione, sarà necessario partire da 50 a 100 milioni di cellule. Le cellule vengono prima lisate e raccolte in sospensione. Viene aggiunto alle sospensioni cellulari appena preparato l'aldeide ad una concentrazione dell'1% e incubato per 10 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, aggiungere un volume pari a un decimo di glicina 1,25 M per bloccare il formaldeide e incubare per 10 minuti. Lavare le cellule due volte con 10 millilitri di PBS, quindi raccoglierle in provette coniche da 50 millilitri. Centrifugare le provette a 1000 giri al minuto per cinque minuti a quattro gradi Celsius al fine di raccogliere le cellule in un pellet.

Dopo la centrifugazione, eliminare il sopranatante e risospendere il pellet in 1,5 millilitri di tampone lyce. Infine, trasferire le cellule in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Dopo il trasferimento delle cellule, congelarle rapidamente tre volte in azoto liquido e quindi utilizzare un macinatore tessutale per romperle.

Dopo che le cellule sono state incrociate, sono pronte per l'immunoprecipitazione oppure possono essere conservate congelate a meno 80 gradi Celsius indefinitamente. Una volta incrociate le cellule, è necessario preparare le microsfere magnetiche per eseguire questa procedura. Aggiungere 50 microlitri di microsfere DI in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro a bassa ritenzione, preparando una provetta di microsfere per ogni immunoprecipitazione.

Quindi aggiungere un millilitro di soluzione di blocco. Ora raccogliere le perle dializzate utilizzando il dializzatore MPC. Posizionare le provette nel supporto magnetico.

Lasciare che le perle si accumulino sul lato del tubo. Ci vorranno circa 15 secondi. È possibile capovolgere il portatubi due volte per favorire l'accumulo delle perle.

Dopo aver raccolto le perle, è possibile rimuovere il tampone con la pipetta. Dopo aver eliminato il sopranatante, aggiungere un millilitro di soluzione di blocco e risospendere delicatamente le perle rimuovendo la striscia magnetica dal supporto e capovolgendo il supporto. Con la provetta ancora al suo posto, ripetere questa operazione da 10 a 20 volte o fino a quando le perle non sono uniformemente distribuite.

Risospendere i microsfera e raccoglierli come fatto in precedenza. Una volta raccolti, è possibile rimuovere il soprannatante con una pipetta. Ripetere questo lavaggio utilizzando 1,5 millilitri di soluzione bloccante.

Dopo il secondo lavaggio, è possibile risospendere le perle in 750 microlitri di soluzione di blocco e quindi aggiungere 10 microgrammi di anticorpo. Nella nostra ricerca, utilizziamo un anticorpo contro la proteina MLL, incubando la miscela a quattro gradi Celsius per un minimo di sei ore o durante la notte su un agitatore. Durante questa incubazione, è possibile sottoporre a sonica il cromatina cross-linkato, come mostreremo subito dopo l'incubazione notturna.

Rimuovere la soluzione anticorpale e quindi lavare le perle tre volte. Utilizzare un millilitro di buffer lisico come fatto in precedenza, usando il supporto magnetico per raccogliere le perle. Dopo i lavaggi, si è pronti per aggiungere la cromatina satura.

Prima di iniziare la sonificazione, è necessario recuperare i pellet cellulari congelati da meno 80 gradi Celsius e lasciarli scongelare. Preparare un tubo conico da 15 millilitri per la sonificazione. Questo si ottiene tagliando il tubo in due parti al segno dei cinque millilitri e scartando la metà superiore.

I tubi possono essere coperti con paraffina o con il tappo del tubo. Durante l'allestimento, utilizzare un portatubi per posizionare il tubo in modo che la sonda ator si trovi approssimativamente da 0,5 a un centimetro sopra il fondo del tubo.

Assicurarsi che la sonda sia centrata e non entri in contatto con i lati del tubo per evitare la formazione di schiuma nella soluzione. Ora sottoporre la sospensione a sei cicli di sonificazione della durata di 20 secondi ciascuno. Dopo ogni ciclo, mantenere ogni campione in un bagno di ghiaccio per ridurre la formazione di schiuma.

Impostare inizialmente l'output di potenza a zero e quindi aumentarlo manualmente fino alla potenza finale durante il primo impulso. Dopo un certo tempo, trasferire il materiale in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 13.000 giri al minuto per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Per formare un pellet dei detriti e raccogliere l'acido nucleico.

Trasferire la SINA in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Conservare 50 microlitri del lisato cellulare di ogni campione come DNA di input. Questo verrà utilizzato in seguito per verificare la dimensione della cromatina condivisa.

Questo può essere conservato a meno 20 gradi Celsius. Almeno un'aliquote di DNA di ingresso deve essere conservata per ogni lotto di lisato sonificato. Ora siamo pronti per immunoprecipitare la cromatina per amino precipitare la cromatina.

Per prima cosa, aggiungere il corrispondente di cromatina di 50-100 milioni di cellule ottenuto dal campione raccolto nel passaggio precedente a 50 microlitri di mix magnetico di anticorpi preparato in precedenza, portando il volume finale a un millilitro. Se necessario, questo volume può essere aggiustato con tampone lyce invert per risospendere. Le perle incubano questa miscela tutta la notte sul mutator a quattro gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, raccogliere le perle utilizzando il dyl MPC posizionando i tubi nel portatubi, permettendo così alle perle di accumularsi sul lato del tubo. Questo processo dovrebbe richiedere circa 20 secondi. Inclinare il portatubi due volte per favorire la raccolta di tutte le perle.

Quindi rimuovere il sovranatante con una pipetta, cambiando le punte tra i campioni. Successivamente, è necessario lavare le perle. Per fare ciò, aggiungere un millilitro di buffer lisante in ogni provetta e risospendere delicatamente le perle.

Questa operazione può essere eseguita rimuovendo la striscia magnetica dal rack e capovolgendo il rack con le provette ancora al loro posto da 10 a 20 volte, oppure fino a quando le perle non sono uniformemente risospese. Successivamente, raccogliere le perle riposizionando la striscia magnetica. Rimuovere il soprannatante mediante pipetta.

Ripetere questo lavaggio da tre a cinque volte aggiuntive. Ricordarsi di cambiare i puntali tra un lavaggio e l'altro. Successivamente, lavare le perle da quattro a sei volte in un millilitro di buffer IP one come appena descritto.

Quindi, lavare in modo analogo le perle da quattro a sei volte in un millilitro di tampone IP due. Infine, lavare le perle da quattro a sei volte in un millilitro di tampone TE a pH 8,0, come fatto per gli altri lavaggi. Rimuovere il tampone TE dopo l'ultimo lavaggio.

Ora centrifugare a 3000 giri al minuto per tre minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere qualsiasi residuo di tampone TE. Le perle sono ora pronte per l'eluzione del cromatina. Aggiungere innanzitutto 210 microlitri di tampone di eluzione ed eluire il materiale dalle perle incubando i tubi in un agitatore termico a 65 gradi Celsius a 800 giri al minuto per 15 minuti o fino a 30 minuti per migliorare il recupero dell'eluito.

Centrifugare le perle a 13.000 giri al minuto per un minuto. Dopo la centrifugazione, rimuovere 200 microlitri del soprannatante S e trasferirli in un nuovo tubo, quindi aggiungere 200 microlitri di TE 0.0. A questo punto i campioni sono pronti per i CRO che si legheranno per invertire il crosslink del DNA precipitato deviato.

Incubare il sopranatante in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius per un minimo di sei ore e un massimo di 15 ore. Questa incubazione può essere effettuata in un bagno d'acqua per minimizzare la condensa. Successivamente, seguire i 50 microlitri di DNA in ingresso.

Questo è stato riservato dopo la sonicazione, invertendo il legame incrociato di questa DNA di input mediante incubazione a 65 gradi Celsius, come fatto con l'eluito. Ora siamo pronti per purificare il DNA. Il DNA viene quindi purificato e precipitato utilizzando l'estrazione con fenolo-cloroformio, seguita da tecniche di precipitazione con etanolo.

I pellet di DNA precipitati vengono risospesi in acqua e quindi possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius. Per utilizzi futuri, il DNA in ingresso purificato può essere analizzato su un gel di agarosio per verificare la dimensione del cromatina tagliato. Idealmente, la dimensione dovrebbe essere compresa tra 250 e 750 basi.

Abbiamo appena mostrato come eseguire un'immunoprecipitazione della cromatina da cellule staminali embrionali umane. Quando si esegue questo esperimento, è importante utilizzare un anticorpo ad alta affinità per la cromatina, con l'intervallo di dimensioni corretto, e passaggi di lavaggio ad alta stringenza. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna per i vostri esperimenti.