Name: Isolamento delle prime cellule staminali emopoietiche da murini sacco vitellino e AGM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-27T19:56:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Impara la tecnica di microdissezione per isolare le prime cellule staminali emopoietiche da embrioni di topo. Questo metodo combina dissezione del sacco vitellino e regione AGM con l'ordinamento citometrico a flusso per ottenere popolazioni cellulari pure.

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Dissezione e isolamento delle prime cellule staminali ematopoietiche di topo sacco vitellino e aorta-gonadi-mesonefro regione <ol><li> Prima di iniziare, è importante avere tutti i reagenti e gli strumenti necessari per la procedura: <ul><li> Forbici </li><li> Pinze, misura 4, e chirurgici grado piegate a punta pinze, misura 5 / 45 (opzionale) </li><li> 30 aghi di calibro con siringa </li><li> Piastre di Petri da 35 mm e 100 millimetri </li><li> PBS con il 10% e 20% siero fetale bovino </li><li> e, infine, Collagenasi </li></ul></li><li> Per iniziare la dissezione, abbiamo bisogno di raccogliere le corna uterine da una donna incinta a 10,5 dopo il concepimento giorni. </li><li> Gli animali sono l&#39;eutanasia secondo procedure approvate. Noi usiamo asfissia anidride carbonica, seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Addome della femmina è bagnato con etanolo e la pelle è aperto con le forbici. </li><li> Tenendo la pelle con una pinza, ulteriori tagli sono fatti per aprire il peritoneo. </li><li> L&#39;addome viene aperto e le corna uterine possono essere visualizzati. Uso di pinze per tenere le corna uterine, tagliare ogni estremità distale e il centro di entrambe le accise corna. </li><li> Corna uterine vengono poi poste in una piastra di Petri contenente PBS freddo con il 10% FBS per rimuovere i tessuti uterino. </li><li> Utilizzando taglia 4 pinze e lavorare al microscopio, rimuovere delicatamente il tessuto endometriale di tutto ogni embrione concepito, facendo attenzione a non forare la placenta. </li><li> Una volta rimosso, gli embrioni sono posti in un piatto fresco con PBS freddo e il 10% FBS. </li><li> Rimuovere con attenzione il tessuto placentare per rivelare l&#39;embrione racchiuso nel sacco vitellino, utilizzando le pinze per tagliare l&#39;embrione-incassato sacco vitellino lontano dalla placenta a loro frangente. Il sacco vitellino contiene arterie vitellina, e una parte del cordone ombelicale, possono essere delicatamente preso in giro dalla dell&#39;embrione e mettere da parte in ghiaccio per dissociazione. </li><li> L&#39;embrione viene spostato in una piccola scatola di Petri con livelli minimi di PBS con 10% FBS - quel tanto che basta per bagnare l&#39;embrione ma non troppo. Livelli ottimali mantenere l&#39;embrione fermo mentre la piastra è agitato lentamente, mantenendo l&#39;embrione saldamente in posizione durante la dissezione. </li><li> Passare al 30 aghi calibro, che sono usati per rimuovere la parte superiore e inferiore dell&#39;embrione, tagliando al di sopra della arti anteriori e sotto le zampe posteriori. Acquisire familiarità con l&#39;utilizzo degli aghi come strumenti da taglio può richiedere una certa pratica. Un metodo di utilizzo ripetuto piccoli tagli attraversando gli aghi si sezionare il tessuto, con l&#39;ago nella mano dominante di fungere da guida di taglio per l&#39;ago che si tiene nella mano non dominante. </li><li> Rimuovere la parte dorsale dell&#39;embrione. Questo è il tessuto che contiene i somiti. Delicatamente tagliare via la dorsale più a tessuto, pur rimanendo una distanza sufficiente dalla aorta (linea rossa) per evitare qualsiasi Knicks. Taglio l&#39;aorta si tradurrebbe in perdita di sangue e l&#39;impossibilità di visualizzare facilmente la sua posizione. Ancora una volta, facendo piccoli tagli con gli aghi è fondamentale per mantenere una posizione precisa di taglio. </li><li> Spingere il tessuto più lontano dalla vista e girare l&#39;embrione attorno a tagliare il tessuto ventrale, ancora una volta il taglio il più vicino all&#39;aorta possibile senza knicking esso. Tagli troppo lontano dalla posizione ottimale si tradurrebbe in tessuti addominali essere presente, che può essere rimosso una volta che l&#39;assemblea è isolato. </li><li> Posizionare l&#39;embrione con il suo lato dorsale verso il basso o la schiena contro la piastra. Splay delicatamente l&#39;embrione aperto premendo ai lati verso il basso e visualizzare la posizione delle creste delle gonadi. Questi si trovano leggermente fuori centro come tubo strutture simili su entrambi i lati dell&#39;aorta. </li><li> Completa la dissezione rimuovendo i tessuti in eccesso lato utilizzando le tecniche di taglio come prima. Una volta che il tessuto lato dell&#39;embrione viene rimosso, allora l&#39;embrione è capovolto per rimuovere il tessuto rimanente lato. </li><li> A questo punto, l&#39;assemblea è ispezionato per qualsiasi tessuto in eccesso che può essere rimosso facilmente con gli aghi senza danno per l&#39;aorta o gonadi. Rimozione come eccesso più risultati possibili in una migliore isolamento della popolazione di cellule staminali in quanto possiamo contare solo su alcuni marcatori di superficie cellulare per la purificazione. </li><li> Utilizzando la punta piegata pinze, dolcemente raccogliere ogni AGM e il luogo in PBS freddo con il 10% FBS fino al momento dissociazione. </li></ol> Dissociazione e analisi FACS <ol><li> Dissociare l&#39;, il tessuto primo posto sacchi di tuorlo e assemblee in tubi separati. </li><li> Spin brevemente ai tessuti pellet e scartare PBS con 10% FBS. </li><li> Risospendere tessuti 0,25% collagenasi in PBS con il 20% FBS, con volume sufficiente a coprire adeguatamente i tessuti. </li><li> Incubare i tessuti a 37 gradi. 25-30min per assemblee e 35-40min per sacchi di tuorlo. </li><li> Al termine della incubazione, pipettare delicatamente i tessuti su e giù per dissociazione in sospensioni singola cella. </li><li> Lavare i tessuti in eccesso con PBS wi° 10% FBS, pellet e risospendere le cellule in PBS sterile fresca con il 10% FBS. </li><li> Per l&#39;analisi FACS, le cellule sono colorate in base alle raccomandazioni del fabbricante. Usiamo un FACSAria da BD Biosciences per eseguire citometria a flusso. A causa delle dimensioni e la fragilità delle cellule embrionali, l&#39;apertura ordinamento è regolato per un diametro maggiore rispetto per l&#39;adulto cellule ematopoietiche, che abbiamo anche lo studio in laboratorio. Allo stesso modo, la pressione viene regolata da meno le condizioni richieste dalla adulto cellule ematopoietiche. Ad esempio, ordinare sul FACSAria, la dimensione dell&#39;ugello sarebbe di 100 micron e la pressione di ordinamento sarebbe 30 psi. </li><li> Per le analisi delle cellule staminali, triple cellule positive che esprimono la cKit marcatori, CD34, CD41 e sono isolati e ordinati dal sacco vitellino e positivi doppio (cKit, CD34) sono isolati dal AGM tramite FACS. Una trama tipica sarebbe simile a questa: cKit cellule positive sono analizzati per CD34 e CD41 simultaneamente o singolarmente. Di solito le cellule visualizzare una gradazione di positività per ciascun marcatore con la popolazione di cellule staminali che si trovano come un sottoinsieme della popolazione positivo. Questi grafici ci indicano che abbiamo raggiunto un buon rendimento cella con 100-300 cellule per sacco vitellino e per AGM. </li></ol>

isolamento delle prime cellule staminali emopoietiche da murini sacco vitellino e agm

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Nell&#39;embrione del mouse, ematopoiesi precoce si verifica contemporaneamente in più organi, che comprende il sacco vitellino e aorta-gonadi-mesonefro regione. Queste regioni sono fondamentali per stabilire il sistema sanguigno negli embrioni e conduce al movimento finale di cellule staminali nel fegato fetale e poi lo sviluppo delle cellule staminali adulte nel bonemarrow. Prime cellule staminali ematopoietiche possono essere isolate da questi organi attraverso microdissezione dell&#39;embrione seguita da ordinamento citometria a flusso per ottenere una popolazione più pura. Non è ancora chiaro come queste popolazioni di cellule staminali contribuiscono alla piscina staminali fetali e adulte cellulare. Inoltre, il nostro laboratorio indaga su come le cellule staminali primi funzionalmente diversa da fetali e cellule staminali emopoietiche. Inoltre, i nostri tipi di laboratorio diverse popolazioni di cellule staminali ematopoietiche e testare il loro ruolo funzionale nel contesto di una varietà di modelli genetici. In questo video, dimostriamo il micro-dissezione procedura usiamo comunemente e mostrano anche i risultati di un tipico plotfter FACS isolare queste popolazioni rara, è possibile eseguire una serie di test funzionali, tra cui: saggi di colonia e di trapianti di midollo osseo.

Questo video mostra come micro-sezionare il sacco vitellino e aorta-gonadi-mesonefro regione da embrioni e l&#39;uso di citometria a flusso per ordinare le cellule staminali ematopoietiche.

Isolamento delle prime cellule staminali emopoietiche da murini sacco vitellino e AGM

Nell'embrione di topo, l'ematopoiesi precoce avviene simultaneamente in molteplici organi, tra cui il sacco vitellino e la regione aorta-gonade-mesonefros. Questi...

Nell'embrione di topo. L'emopoiesi precoce avviene contemporaneamente in diversi organi, tra cui il sacco vitellino, il mesenchima aortico e la regione AGM. Ancor più importante, le cellule staminali ematopoietiche precoci possono essere isolate da questi organi mediante microdissezione dell'embrione, seguita da un ordinamento citofluorimetrico per ottenere una popolazione più pura.In questo video, mostriamo la procedura di microdissezione che utilizziamo abitualmente e presentiamo anche i risultati di un tipico grafico fax. Ciao, sono Kelly Morgan del laboratorio del Dott. Gary Gilland presso l'Istituto Medico Howard Hughes e del Dipartimento di Medicina del Brigham and Women's Hospital, formata inizialmente da Elaine Dza presso il Centro Medico dell'Università di Rasmus a Rotterdam. Oggi vi mostrerò la procedura per la dissezione embrionale al fine di ottenere cellule staminali ematopoietiche precoci dal sacco vitellino e dalla regione aortica goad meph o a GM. E io sono Michael Care.Anche dal Go Lab. Ti mostrerò come preparare sospensioni cellulari singole di cellule GM e del sacco vitellino per cellule staminali ematopoietiche (HSC) utilizzando fatti. Questa procedura prevede la dissezione di organi ematopoietici precoci da embrioni di topo a 10 giorni e mezzo, la dissociazione dei tessuti e la preparazione di sospensioni cellulari singole per isolare le cellule staminali ematopoietiche.Iniziamo. Prima di cominciare, è importante avere tutti i reagenti e gli strumenti necessari per la procedura. Forbici, pinzette, pinzette chirurgiche curve di calibro quattro, pinzette curve di calibro cinque 40 cinquantesimi, aghi da 30 gauge con siringa, piastre di Petri da 35 millimetri e da 100 millimetri, PBS con siero bovino fetale al 10% e al 20% e collagenasi.Per iniziare la dissezione, dobbiamo prima prelevare le camere uterine da una femmina gravida. A 10 giorni e mezzo dal concepimento, l'addome della femmina viene inumidito con etanolo e quindi la cute viene aperta con le forbici, tenendo la pelle con pinze. Vengono effettuati tagli aggiuntivi per aprire il peritoneo.Ora l'addome viene aperto e le corna uterine possono essere visualizzate. Utilizzando pinze per tenere le corna uterine, tagliare ciascun estremo distale e la parte centrale per escindere entrambe le corna. Le corna uterine vengono quindi posizionate in una piastra di Petri contenente PBS freddo e FBS al 10%.Per rimuovere il tessuto uterino utilizzando pinze di dimensione quattro e lavorando al microscopio, rimuovere delicatamente il tessuto endometriale attorno a ciascun embrione. Concetto assicurandosi di non perforare la placenta. Una volta rimosso, gli embrioni vengono posizionati in una nuova piastra con PBS freddo e FDS al 10%; rimuovere con cura il tessuto placentario per far emergere l'embrione racchiuso nella sacca amniotica.Questo viene fatto utilizzando la pinzetta per tagliare l'embrione, isolando il sacco vitellino dalla placenta. Nella loro giunzione, il sacco vitellino contenente arterie villose e una porzione del cordone ombelicale può essere delicatamente separato dall'embrione e messo da parte sul ghiaccio. Per la dissociazione, l'embrione viene trasferito in una piccola piastra di Petri con una minima quantità di PBS contenente il 10% di FBS, sufficiente a inumidire l'embrione, ma non in eccesso.I livelli ottimali mantengono l'embrione fermo mentre la piastra viene lentamente agitata. Questo permette di mantenere l'embrione saldamente in posizione durante la dissezione. Passare agli aghi da 30 gauge per rimuovere le porzioni superiore e inferiore dell'embrione tagliando al di sopra degli arti anteriori e al di sotto degli arti posteriori.Abituarsi a utilizzare gli aghi come strumenti di taglio può richiedere un po’ di pratica. Ripetere piccoli tagli incrociando gli aghi per dissezionare il tessuto. Utilizzare un ago come guida mentre l’altro esegue i tagli.Successivamente, rimuovere la porzione dorsale dell'embrione. Questo tessuto contiene i somiti. L'operazione si esegue tagliando delicatamente il tessuto dorsale MOS, mantenendosi a una distanza sufficiente dall'aorta per evitare eventuali incisioni accidentali.Tagliare l'aorta comporterebbe una perdita di sangue e l'incapacità di visualizzarne facilmente la posizione. Effettuare nuovamente piccoli tagli con gli aghi, secondo necessità, per mantenere una posizione di taglio precisa. Spingere il tessuto in eccesso al di fuori e ruotare l'embrione per tagliare il tessuto ventrale.Di nuovo, tagliare il più vicino possibile all'aorta senza intaccarla. Tagli effettuati troppo lontano dalla posizione ottimale potrebbero comportare la presenza di tessuti addominali, che possono essere rimossi una volta isolato il A GM. Ora posizionare l'embrione con il lato dorsale verso il basso, ovvero con la schiena appoggiata alla piastra.Aprire delicatamente l'embrione spingendo i lati verso il basso e individuare la posizione delle creste genitali. Queste si trovano leggermente fuori dal centro come strutture tubolari su entrambi i lati dell'aorta. Completare la dissezione rimuovendo i tessuti laterali in eccesso, utilizzando le stesse tecniche di taglio descritte in precedenza.Dopo aver rimosso il tessuto laterale contenente l'embrione, l'embrione viene capovolto per eliminare il tessuto laterale residuo. A questo punto, la GM viene esaminata per verificare la presenza di tessuto in eccesso che può essere facilmente rimosso con gli aghi senza danneggiare l'aorta o il goad. L'eliminazione della maggior quantità possibile di tessuto in eccesso consente un migliore isolamento della popolazione di cellule staminali.Dato che ci affidiamo solo a pochi marcatori della superficie cellulare per la purificazione. Utilizzando la pinzetta con punta ricurva, prelevare delicatamente ogni GM AG e trasferirlo in PBS freddo con il 10% di FBS, fino al momento della dissociazione. Per dissociare i tessuti, posizionare prima il sacco vitellino e i GM AG in provette separate, centrifugare brevemente per formare il pellet dei tessuti, scartare il PBS con il 10% di FBS, risospendere i tessuti in 0,25% di collagenasi in PBS con il 20% di FBS, usando un volume sufficiente a coprire adeguatamente i tessuti.Incubare i tessuti a 37 gradi, da 25 a 30 minuti per gli AGM e da 35 a 40 minuti per le sacche del tuorlo. Al termine dell'incubazione, pipettare delicatamente i tessuti su e giù per dissociarli in sospensioni cellulari singole. Lavare i tessuti con PBS in eccesso con pellet al 10% di FPS, pellettare le cellule e risospendere in PBS sterile fresco con FBS al 10%. Le cellule sono ora pronte per la colorazione.E per questo, li passo a Mike. Grazie Kelly. Per l'analisi del fax, le cellule vengono colorate secondo le raccomandazioni del produttore.Utilizziamo un fax aria di BD Bios per eseguire la citometria a flusso. A causa delle dimensioni e della fragilità delle cellule embrionali, l'apertura di separazione viene regolata su un diametro maggiore. L'ugello viene impostato a 100 micron e la pressione di separazione è di 30 PSI.Per l'analisi delle cellule staminali, le cellule triplamente positive che esprimono autonomamente i marcatori C kit C 34 e CD 41 vengono isolate e ordinate dal sacco vitellino e le doppie positive. C kit CD 34 vengono isolate dall'A-G-M-V-F-X. Un grafico tipico avrebbe questo aspetto.Le cellule positive per il c-kit vengono analizzate per CD34 e CD41 simultaneamente o singolarmente. Di solito le cellule mostrano un grado variabile di positività per ciascun marcatore. Con la popolazione di cellule staminali identificata come sottoinsieme delle popolazioni positive, questi grafici ci indicano che abbiamo ottenuto una buona resa cellulare con 100-300 cellule per sacco vitellino.E per un GM, vi abbiamo appena mostrato come dissezionare e isolare le cellule staminali ematopoietiche precoci da un embrione in massa. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che il tempo necessario per completare il protocollo influisce negativamente sulla vitalità cellulare. In sostanza, più velocemente si completano le dissezioni, migliore sarà il rendimento cellulare.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE)

Questa dettagli del protocollo la derivazione di cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da topo cellule staminali embrionali (ESC) e la loro successiva iniezione in topi irradiati letalmente destinatario. In breve, ESC si differenziano come corpi embrionali, che sono poi infettati con HoxB4 retrovirali e co-coltura con cellule stromali OP9 e citochine ematopoietiche.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Questo video dimostra una tecnica per generare topi del sistema immunitario umano (HIS). Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) CD34+ sono isolate dalle cellule del buffy coat del sangue del cordone ombelicale umano utilizzando perle magnetiche rivestite di anticorpi. Le HSC CD34+ vengono espanse in un terreno di crescita arricchito con citochine e crioconservate. Infine, le HSC scongelate vengono iniettate in un cucciolo di topo immunodeficiente per stabilire il modello murino HIS.

Isolamento delle cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone ombelicale per generare topi del sistema immunitario umano

Le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) derivano da (hemogenic) cellule endoteliali specializzate durante lo sviluppo, ma poco si sa circa il processo attraverso il quale alcune cellule endoteliali specificano a diventare la formazione del sangue. Dimostriamo un metodo basato citometria a flusso che permette l'isolamento simultaneo di cellule endoteliali hemogenic e HSPC da tessuti embrionali murine.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

Questo protocollo descrive l'utilizzo coltivate Aorta-gonade-Mesonephros per analisi di espressione, unità formanti colonia in cultura e milza e ricostituzione a lungo termine per determinare l'effetto di fattori regolatori e vie di segnalazione su staminali ematopoietiche sviluppo delle cellule. Questo è stato dimostrato come un sistema efficace per lo studio della funzione e biologia delle cellule staminali ematopoietiche.

Applicazione del sistema di coltura Explant Aorta-gonade-Mesonefro nell'ematopoiesi inerente allo sviluppo

Qui presentiamo la metodologia per l'analisi clonale di cellule staminali ematopoietiche precursori durante lo sviluppo embrionale murino. Combiniamo Indice ordinamento delle singole cellule della regione di aorta-gonade-Mesonefro embrionale con co-coltura delle cellule endoteliali e trapianto per caratterizzare le proprietà fenotipiche e potenziale di attecchimento dei precursori ematopoietici singoli.

Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

Questo metodo descrive la purificazione mediante citometria a flusso di MEP e MKp da topi femori, tibie e ossa pelviche.

Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

Presentiamo un protocollo passo-passo per l'isolamento di cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs) e HSCs a breve termine (ST-HSCs) utilizzando il sistema reporter Hoxb5.

Metodo di isolamento per cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine

Questo studio ha stabilito un metodo stabile ed efficiente per l'isolamento, la coltura e la determinazione funzionale delle cellule staminali CD34+ residenti nella parete vascolare (CD34+ VW-SC). Questo metodo di isolamento, facile da seguire ed efficace in termini di tempo, può essere utilizzato da altri ricercatori per studiare i potenziali meccanismi coinvolti nelle malattie cardiovascolari.

Isolamento immunomagnetico delle cellule staminali CD34+ residenti nella parete vascolare dai topi

Qui presentiamo protocolli che consentono l'isolamento di cellule stromali da osso murino, midollo osseo, timo e tessuto timico umano compatibile con la multiomica a singola cellula.

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

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