Name: Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina mediante lapplicazione di fluoro-oro sulla superficie del collicolo superiore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:19:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Impara l'etichettatura retrograda delle cellule gangliari della retina con fluoro-oro applicato sul collicolo superiore. Questa tecnica permette di studiare le vie neuronali e valutare gli effetti di farmaci sulla sopravvivenza cellulare.

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Gli autori desiderano ringraziare per il sostegno del Programma Nazionale Glaucoma Foundation Assistant Salute americano.

<ol><li> Anestetizzare il ratto di iniezione intra-peritoneale di ketamina (80mg/kg) e xilazina (8mg/kg) (rapporto tra volume a 2:1). Applicare lubrificante sterile unguento oculare per evitare l&#39;essiccazione delle cornee durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Accorciare il pelo testa (da occhio a livello delle orecchie) e fissare la testa sul palco testa da un capo morsetto e impostarne il incisivi nella barra degli incisivi. </li><li> Disinfettati zona di operazione con una soluzione di iodio povidone al 10% seguito dal 70% di alcol. </li><li> Tagliare la pelle ed i muscoli per esporre cranio e suture (sagittale, coronale e trasversale suture) (Figura 1). Applicare analgesico, bupivicaine come una spruzzata di zona incisione (non superiore a 2 mg / kg). </li><li> Praticare un foro del cranio (ø 2x2 mm, 0,5 mm da entrambi i punti di sutura sagittale e trasverso) su ogni lato della sutura sagittale. Evitare la rottura delle meningi e del seno che giacciono sotto le suture. <img src="/files/ftp_upload/old/819_2008_6_18_3/ratSkull.png" alt="Caratteristiche del cranio topo vivo." width="469" height="317" /> Figura 1. Caratteristiche del cranio topo vivo. </li><li> Taglio aperto le meningi con le forbici a molla, di evitare strappi. </li><li> Aspirare il contenuto cerebrale che si trova sulla superficie dorsale del collicolo superiore attentamente dalla pompa del vuoto e tre check-point può essere osservato: <ol><li> il colore del tessuto cerebrale cambia dal grigio al bianco al grigio </li><li> interrompere l&#39;aspirazione quando il fluido cerebrospinale incolore uscire </li><li> attentamente allargare il più basso livello di aspirazione orizzontale per esporre il collicolo superiore giallastro coperto dalla durata </li></ol></li><li> Aspirare il contenuto del cervello su SC fino a quattro bordi di SC può essere osservato direttamente al microscopio. La porzione di corteccia cerebrale rimosso deve essere ridotta al minimo per evitare effetti collaterali indesiderati (ad esempio, disfunzione motoria). Fare attenzione a non toccare il seno. </li><li> Assorbire il liquido nel foro con sottile striscia di cotone sterile per ottenere la superficie della SC più asciutto possibile. Poi, posto un sottile strato di gelatina spugna pre-impregnato con il 6% Fluoro-oro sulla superficie di SC (FG è occupato dai terminali degli assoni delle cellule gangliari della retina e bilateralmente trasportato retrogrado alla sua somas nella retina). </li><li> Riempire il buco con Gelfoam e chiudere la ferita pelle con clip sutura. </li><li> Gli animali sono stati autorizzati a recuperare sotto lampade a incandescenza per tenere in caldo. Analgesico, buprenorfina (100mcg/kg), viene applicato per via orale nell&#39;acqua da bere per 5 giorni dopo l&#39;etichettatura SC. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+double+labeling+of+retinal+ganglion+cells+in+the+newborn+and+adult+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat.</a> Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
<li>Forrester, J., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibers+in+the+optic+nerve+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerve fibers in the optic nerve of rat.</a> Nature. 214, 245-247 (1967).</li>
<li>Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF+promotes+survival+of+retinal+ganglion+cells+after+induction+of+ocular+hypertension+in+rats%3A+the+possible+involvement+of+STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway.</a> European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).</li>
<li>Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells+Are+More+Injury-Resistant+in+a+Chronic+Ocular+Hypertension+Model.+Investigative%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative.</a> Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).</li>
</ol>

<ol><li> Perché usare questo metodo chirurgico per la conta delle cellule gangliari della retina? Nel ratto circa il 98% delle cellule gangliari retiniche (RGC) sono noti per progetto al controlaterale collicolo superiore (SC). L&#39;applicazione di fluoro-oro sulla superficie di SC può etichettare quasi tutti i RGCs, in modo che possiamo concentrarci su questa neuroni più vulnerabili della retina nel glaucoma. Confronta con marcatura retrograda di RGC mettendo FG a tronco di transected nervo ottico per 2 giorni, l&#39;interferenza...

etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina mediante l&#39;applicazione di fluoro-oro sulla superficie del collicolo superiore

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus

Cellule gangliari della retina (RGC) conteggio è essenziale per valutare la degenerazione retinica soprattutto nel glaucoma. Etichettatura affidabile RGC è fondamentale per valutare gli effetti di qualsiasi trattamento. Nel ratto, circa il 98% del RGCs è noto per proiettare al controlaterale collicolo superiore (SC) (Forrester e Peters, 1967). L&#39;applicazione di fluoro-oro (FG) sulla superficie di SC può etichettare quasi tutte le RGCs, in modo che possiamo concentrarci su questa neuroni più vulnerabili della retina nel glaucoma. FG è occupato dai terminali degli assoni delle cellule gangliari della retina e bilateralmente trasportato retrogrado alla sua somas nella retina. Confronta con marcatura retrograda di RGC mettendo FG a tronco di transected nervo ottico per 2 giorni, l&#39;interferenza di sopravvivenza RGC è ridotto al minimo. Confronta con colorazione violetto cresolo che RGCs macchie, le cellule amacrine ed endotelio dei vasi sanguigni nello strato di cellule gangliari della retina, questo metodo di etichettatura più specifico per il RGC. Questo video descrive il metodo di marcatura retrograda di RGC FG applicando sulla superficie del SC. Le procedure chirurgiche includono perforazione del cranio; aspirando la corteccia per esporre la SC e l&#39;applicazione di spugna di gelatina su tutta la superficie dorsale del SC sono mostrati. Consigli utili per evitare la massiccia emorragia intracranica e l&#39;aspirazione delle SC sono state date.

Questo video descrive il metodo di marcatura retrograda di RGC mediante l&#39;applicazione di fluoro-oro (FG) sulla superficie del collicolo superiore (SC). Tecnica consiste nel forare il cranio, aspirando la corteccia, e l&#39;applicazione di spugna di gelatina su tutta la superficie dorsale del SC.

Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina mediante l&#39;applicazione di fluoro-oro sulla superficie del collicolo superiore

Il conteggio delle cellule gangliari della retina (RGC) è essenziale per valutare la degenerazione retinica, in particolare nel glaucoma. Una marcatura affidabile delle RGC è fondamentale per...

Ciao, sono Tu del laboratorio GOSO dell'Università di Hong Kong. Oggi illustrerò come etichettare retrogradamente il ratto. Cellula gangliare retinica.I neuroni gangliari della retina verranno etichettati retrogradamente applicando un colorante tracciante sulla superficie del collicolo superiore in modo da poter conteggiare successivamente i neuroni gangliari retinici nella preparazione piatta della retina, al fine di valutare la morte cellulare o l'effetto del farmaco applicato. Questa immagine illustra il percorso dal collicolo superiore alla retina. Il colorante fluorescente CLE può essere trasportato retrogradamente dal collicolo superiore CLE attraverso il tratto ottico.Attraversare il chiasma ottico attraverso il nervo ottico fino alla retina nell'occhio. Utilizziamo un microscopio operatorio per eseguire l'intervento chirurgico. Pompa di aspirazione per rimuovere la corteccia cerebrale sulla superficie dorsale dello stadio CLE per mantenere il cappuccio rosso in posizione.Chiave e seno per fissare il trapano per ratto per l'apertura del cranio e pinza assorbibile per applicare il colorante fluorescente FG sulla superficie del cranio. Gli strumenti sono stati sterilizzati in autoclave prima dell'uso, inclusi pinzette fini, forbici a molla, ago da vuoto, punta del trapano e clip per sutura. Anche la lama chirurgica per tagliare la cute, il righello per le misurazioni e il cotone si trovano in condizione sterili.Analizziamo il rosso mediante iniezione tonale di ketamina e gel di sine. Dopo aver rimosso il pelo dalla regione degli occhi fino alla regione delle orecchie, abbiamo disinfettato la zona operatoria con iodio propilico, seguito da alcol al 70%. Quindi abbiamo posizionato il cappuccio rosso sulla pedana cranica.Tagliare la pelle lungo la linea mediana della testa, partendo dal livello dell'occhio fino al livello delle orecchie. A questo punto si ha una buona esposizione della sutura coronale, della sutura sagittale, della sutura trasversa, e questa è la BMA e questa è la Lambda. Contrassegnare il punto per il fissaggio a 0,5-1 millimetro dalla sutura transfer end AL, quindi etichettare entrambi i lati in modo speculare per assicurarsi che il segno sia distante almeno 0,5 millimetri dalle suture.Quindi possiamo iniziare a trapanare un foro lungo il lato del marcatore, controllando la velocità e la direzione del trapano fino a ottenere una rottura ampia delle meningi e del rivestimento del seno sotto la sutura. Arrestare il trapanaggio quando il diametro raggiunge circa due millimetri. Successivamente, iniziamo nuovamente dall'altro lato per verificare che il foro abbia le dimensioni corrette e sia nella posizione appropriata.Tagliare le meningi con forbici a molla, utilizzare una pinzetta fine per rimuovere i detriti ossei dal foro. Ora possiamo iniziare l'aspirazione utilizzando la pompa a vuoto. Il primo strato del BR è la sostanza verde, da tagliare nuovamente insieme alle meningi.Poi si può osservare che il colore della cellula diventa bianco. Queste sono le sostanze bianche del siero. Eseguire l'aspirazione con calma e lentamente.Ora possiamo vedere di nuovo le sostanze grigie. Il colore sta diventando meno bianco. Si può notare che in basso è grigio.Capisco. Quindi si può vedere che il liquido cefalorachidiano limpido sta fuoriuscendo. Questo significa che abbiamo raggiunto la superficie dorsale del corpo calloso superiore.È nuovamente presente un foro ingrandito a questo livello. In basso, possiamo osservare la dura di colore giallastro che ricopre il clus superiore. È necessario effettuare un'aspirazione orizzontale a questo livello per evitare di danneggiare il contenuto del clus superiore.Poi possiamo iniziare l'analisi nel suo complesso. Vedete la materia verde. È effettivamente di colore verde.E poi arriviamo alla sostanza bianca. Il colore del tessuto è bianco. Ora potete vedere il liquido cerebrospinale che si trova al di sotto di quel colore grigio, in modo così nitido.Rimuovere l'ultimo strato di sostanza grigia, quindi si espone la dura madre gialla. Avere cura di interrompere la dura madre sopra i singoli clicker e poi allargare il foro. Cercare di assicurarsi che tutto il bordo dei clicker possa essere osservato al microscopio.Si prenda il morsetto della testa della piastra in diverse angolazioni ed esercitare una leggera aspirazione finale finché i quattro bordi del CLE non siano visibili direttamente al microscopio. Assorbire il liquido presente nel foro con una striscia di cotone fine, in modo da rendere la superficie del CLE il più resistente possibile. Prendere un pezzo di gelatina, precedentemente rivestita con oro al 6% in peso, e dividerla in pezzi equivalenti.Stendere uno strato sottile, leggermente più grande dell'intera superficie dorsale del superiore. Posizionarlo con attenzione sulla superficie dei clicker superiori, quindi sull'altro lato. Inserirlo all'interno del foro coprendo l'intera superficie del clus attraverso i fori con un flusso a getto decrescente.Infine, chiudere la ferita cutanea con clip chirurgiche e pulire la ferita dopo l'intervento, riporre il ratto in una gabbia pulita e permettergli di riprendersi. Mantenere condizioni di calore. Il ratto si comporta normalmente dopo l'operazione quando è sveglio.Sette giorni dopo la marcatura SC, isoliamo la retina e la montiamo in piano, quindi contiamo le cellule gangliari retiniche e l'epinale al microscopio utilizzando un filtro UV. Poiché il 98% delle cellule gangliari retiniche proietta ai collicoli superiori, una marcatura affidabile del TS è fondamentale per la valutazione della progressione della malattia e dell'effetto dei farmaci. Questo è un esempio di cellule gangliari retiniche marcate retrogradamente su una retina montata in piano.

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