Name: Primaria dissociato mesencefalo colture cellulari dopamina da roditori neonati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Scopri come generare colture primarie di neuroni dopaminergici del mesencefalo da neonati di roditori. Questo metodo consente di studiare la liberazione di dopamina e i meccanismi di esocitosi in vitro.

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Il lavoro è stato supportato da DK065872 (PEV), una famiglia Smith Award Foundation di eccellenza nella ricerca biomedica (PEV), F31 DA023760 (BMG, PEV) e P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research).

<ol><li>Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+defective+mesolimbic+dopamine+exocytosis+in+obesity-prone+rats%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats.</a> FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).</li>
<li>Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dopamine+quantal+size+in+midbrain+and+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons.</a> Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).</li>
<li>Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+transporter+expression+regulates+vesicle+phenotype+and+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).</li>
<li>Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+recording+of+quanta+from+midbrain+dopamine+neurons+and+modulation+of+the+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+mechanisms+that+regulate+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Presynaptic mechanisms that regulate quantal size.</a> Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).</li>
</ol>

I metodi descritti permettono di risoluzione fine delle caratteristiche morfologiche e neurochimica dei neuroni dopaminergici centrali che non sono altrimenti disponibili in un approccio sistemico o in vivo.

I materiali sono inclusi nel testo del protocollo.

primaria dissociato mesencefalo colture cellulari dopamina da roditori neonati

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

La possibilità di creare colture cellulari primarie di neuroni dopaminergici permette per lo studio delle caratteristiche presinaptici dei neuroni dopaminergici in isolamento da ingresso sistemica da altre parti del cervello. Nel nostro laboratorio, usiamo questi neuroni per valutare la cinetica di rilascio di dopamina amperometria utilizzando fibra di carbonio, così come i livelli di espressione di geni correlati dopamina e proteine ​​mediante PCR quantitativa e immunocitochimica. In questo video vi mostriamo come si generano queste culture da neonati di roditori. Il processo prevede diverse fasi, tra cui la placcatura di corticale astrociti gliali, il condizionamento dei mezzi di coltura delle cellule neuronali del substrato gliale, la dissezione del mesencefalo nei neonati, la digestione, l&#39;estrazione e la placcatura dei neuroni della dopamina e l&#39;aggiunta di fattori neurotrofici per garantire la sopravvivenza delle cellule. Le applicazioni adatte per tali preparati sono elettrofisiologia, immunocitochimica, PCR quantitativa, microscopia video (ad es, in tempo reale fusione vescicolare con la membrana plasmatica), saggi di vitalità cellulare e di altri schermi tossicologico.

Primaria dissociato mesencefalo colture di cellule della dopamina permettono per lo studio delle caratteristiche presinaptici dei neuroni dopaminergici. Possono essere utilizzati per monitorare in tempo reale la cinetica di rilascio di dopamina e proteine ​​/ mRNA livelli di regolatori di esocitosi dopamina. Qui vi mostriamo come generare queste culture da neonati di roditori.

Primaria dissociato mesencefalo colture cellulari dopamina da roditori neonati

La capacità di creare colture cellulari primarie di neuroni dopaminergici consente lo studio delle caratteristiche presinaptiche dei neuroni dopaminergici in isolamento...

Ciao, sono Lauren Frank del Laboratorio di Emmanuel Pothos del dipartimento di Farmacologia e Terapia Sperimentale della Scuola di Medicina della Tufts University. E io sono Emmanuel Pothos. Oggi vi mostreremo un procedimento per generare colture primarie di cellule dopaminergiche del mesencefalo da neonati roditori.Questa procedura comprende i seguenti passaggi: preparazione degli strumenti e dei reagenti, dissezione del mesencefalo di cervelli di roditori da P0 a P2, isolamento dei segmenti cerebrali e semina dei neuroni dissociati. Cominciamo dunque.In questa procedura, è necessario eseguire una serie di passaggi preparatori in anticipo, da due a tre settimane prima della generazione della coltura di neuroni dopaminergici: le cellule gliali devono essere seminate in modo da avere il tempo di proliferare e ricoprire il fondo delle piastre. I neuroni dopaminergici primari verranno coltivati su uno strato monocellulare di cellule gliali da uno a sette giorni prima della coltura primaria di cellule neuronali. Rimuovere il mezzo dalle cellule gliali e sostituirlo con due millilitri di mezzo neuronale fresco il giorno precedente alla coltura delle AC; tutti gli oggetti, ad eccezione d

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Biologia

Un metodo per generare fette organotipica dal mesencefalo murino embrionale E12.5 è descritto. Le culture fetta organotipica può essere usato per osservare il comportamento dei neuroni dopaminergici o di altri neuroni del mesencefalo ventrale.

Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em

Questo video delinea un metodo per coltivare neuroni dopaminergici da tessuto cerebrale embrionale di topo. Il processo include il trattamento del mesencefalo con un enzima proteolitico, il distacco delle cellule e la loro coltura su vetrini coprioggetti rivestiti di polimero in un mezzo ricco di sostanze nutritive con antibiotici per la loro crescita e vitalità a lungo termine.

Coltura e mantenimento di neuroni dopaminergici da tessuto cerebrale embrionale di topo

Il video dimostra il processo di isolamento e coltura dei neuroni dopaminergici dal mesencefalo di embrioni di topo. I pavimenti ventrali isolati del mesencefalo vengono dissociati utilizzando enzimi. I neuroni dopaminergici risultanti vengono raccolti e trasferiti in micro-isole all'interno di piastre multi-pozzetto. Le cellule vengono incubate con un mezzo neuronale dopaminergico per mantenere le cellule ad alta densità all'interno delle micro-isole.

Isolamento e coltura dei neuroni dopaminergici del mesencefalo embrionale primario di topo

Questo video dimostra il processo di quantificazione dell'accumulo di alfa-sinucleina nei neuroni dopaminergici embrionali di topo pre-trattati con fibrille preformate di alfa-sinucleina. Descrive i passaggi per fissare, colorare e quantificare i neuroni dopaminergici contenenti aggregati di alfa-sinucleina utilizzando l'immunofluorescenza.

Studio dell'accumulo di alfa-sinucleina nei neuroni della dopamina embrionale primaria di topo

Noi, sulla base delle conoscenze della biologia dello sviluppo e della ricerca pubblicata, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per generare in modo efficiente neuroni dopaminergici del mesencefalo A9 sia da cellule staminali embrionali umane che da cellule staminali pluripotenti indotte umane, che sarebbero utili per la modellazione della malattia e la terapia di sostituzione cellulare per il morbo di Parkinson.

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

I neuroni dopaminergici svolgono un ruolo regolatore vitale nel cervello. La loro perdita è associata al morbo di Parkinson. In questo video, mostriamo come generare colture primarie di neuroni dopaminergici centrali da mesencefalo embrionale di topo. Tali colture sono utili per studiare l'estrema vulnerabilità di questi neuroni a vari stress.

Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

Le cause della degenerazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo durante il morbo di Parkinson non sono completamente comprese. I sistemi di coltura cellulare forniscono uno strumento essenziale per lo studio delle proprietà neurofisiologiche di questi neuroni. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato, che può essere utilizzato per la modellazione in vitro della neurodegenerazione.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Nella malattia di Parkinson (PD), sostanza nera (SNC) neuroni dopaminergici degenerano, portando ad una disfunzione del motore. Qui riportiamo un protocollo per la coltura di neuroni del mesencefalo ventrale da un topo che esprime eGFP guidata da una sequenza promotore la tirosina idrossilasi (TH), la raccolta neuroni fluorescenti singoli dalle culture, e misurando il loro trascrittoma utilizzando RNA-Seq.

Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression

Il protocollo presenta la riprogrammazione delle cellule mononucleari del sangue periferiche per indurre le cellule staminali neurali mediante l'infezione da virus Sendai, la differenziazione degli iNSC in neuroni dopaminergici, il trapianto di precursori DA nei precursori unilateralmente Modelli murini del morbo di Parkinson e valutazione della sicurezza e dell'efficacia dei precursori DA derivati da iNSC per il trattamento con LA PD.

Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per studiare l'accumulo neuronale di sinucleina nei neuroni primari della dopamina del topo. Gli aggregati di sibbonucleina fosfolati nei neuroni sono indotti con fibrille pre-formate e sinucleina. L'imaging automatizzato di cellule etichettate immunofluorescentmente e l'analisi imparziale dell'immagine rendono questo protocollo robusto adatto per lo screening della produttività medio-alta di farmaci che inibiscono l'accumulo di sinucleina.

Studio pre-formato Fibril indotta accumulazione di z-sinucleina in primario embrionale Midbrain Dopamine Neuroni

Questo protocollo descrive la coltura cellulare di neuroni dopaminergici del mesencefalo umano, seguita da colorazione immunologica e generazione di profili fenotipici neuronali da immagini microscopiche acquisite ad alto contenuto che consentono l'identificazione di variazioni fenotipiche dovute a modulazioni genetiche o chimiche.

Profilo fenotipico dei neuroni dopaminergici del mesencefalo derivati da cellule staminali umane

Scopri come generare colture primarie di neuroni dopaminergici del mesencefalo da neonati di roditori. Questo metodo consente di studiare la liberazione di dopamina e i meccanismi di esocitosi in vitro.

Primaria dissociato mesencefalo colture cellulari dopamina da roditori neonati

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