Primaria dissociato mesencefalo colture cellulari dopamina da roditori neonati

Ciao, sono Lauren Frank del Laboratorio di Emmanuel Pothos del dipartimento di Farmacologia e Terapia Sperimentale della Scuola di Medicina della Tufts University. E io sono Emmanuel Pothos. Oggi vi mostreremo un procedimento per generare colture primarie di cellule dopaminergiche del mesencefalo da neonati roditori.

Questa procedura comprende i seguenti passaggi: preparazione degli strumenti e dei reagenti, dissezione del mesencefalo di cervelli di roditori da P0 a P2, isolamento dei segmenti cerebrali e semina dei neuroni dissociati. Cominciamo dunque.

In questa procedura, è necessario eseguire una serie di passaggi preparatori in anticipo, da due a tre settimane prima della generazione della coltura di neuroni dopaminergici: le cellule gliali devono essere seminate in modo da avere il tempo di proliferare e ricoprire il fondo delle piastre. I neuroni dopaminergici primari verranno coltivati su uno strato monocellulare di cellule gliali da uno a sette giorni prima della coltura primaria di cellule neuronali. Rimuovere il mezzo dalle cellule gliali e sostituirlo con due millilitri di mezzo neuronale fresco il giorno precedente alla coltura delle AC; tutti gli oggetti, ad eccezione degli strumenti di dissezione, devono essere sterilizzati mediante luce UV, inclusi 12 piatti di dissezione.

Due provette di dissociazione con un'asta magnetica microscopica. Due tappi per provette con due piccoli fori praticati sulla sommità. Anelli scorrevoli disposti in modo separato.

E la scatola dell'anello scorrevole, ricordarsi di lasciarla aperta. Tutti questi strumenti vengono ricoperti con etanolo al 70% prima dell'inizio della giornata di coltura. Per prima cosa, prelevare tutti i componenti della soluzione pepane che verrà utilizzata per dissociare la soluzione di neuroni primari dal congelatore e lasciarli scongelare.

Impostare una piastra riscaldante per riscaldare un becher d'acqua fino a 34 gradi Celsius per la digestione e preparare acqua satura di carbogeno per l'ossigenazione della soluzione di pepane. Durante la digestione, si preparano 15 provette sterili riempite con quattro-sei millilitri di PBS sterile per il lavaggio dei cervelli prima della dissezione e si mettono sul ghiaccio. Si prelevano 20-30 millilitri di mezzo neuronale fresco e si collocano nell'incubatrice.

Successivamente, si prepara il vial di dissociazione utilizzando un'unità di filtrazione sterile con tappo a ribaltamento per filtrare la soluzione di pepane, che viene quindi trasferita nel vial di dissociazione con un tappo twist da 25 millilitri; inserire una siringa sterile, praticare un foro nel tappo, al quale viene collegato un filtro da 0,2 micron. Collegare il carbogen al filtro e fissarlo con pellicola parafilm. Posizionare il vial nel disco di polistirolo.

Una volta posizionata la provetta di dissociazione, assicurarsi che il barra magnetica stia ruotando. Il gas sta entrando nella provetta e la temperatura è stabilizzata a 34 gradi Celsius. Il microscopio per dissezione viene introdotto nella cappa e gli strumenti per dissezione vengono disposti sulla carta d'alluminio.

Quindi disponi un grande quadrato di carta d'alluminio e 12 quadrati più piccoli. Lascia una paio di forbici per le decapitazioni insieme alla carta d'alluminio. Posiziona una scatola di polistirolo con acqua ghiacciata all'esterno della cappa.

Successivamente, preparare l'anestetico, che è una miscela di 0,075 millilitri di chetamina e 0,075 millilitri di xilazina. Quindi ottenere almeno 12 cuccioli da P zero a P due per piastre da 135 millimetri con vetrino da 23 millimetri. Per i topi, assicurarsi che vi sia una corrispondenza di genotipo per tutta la nidiata.

Se il genotipo è sconosciuto, le cellule di ciascun animale dovranno essere seminate in piatti separati e dovranno essere conservati registri accurati per associare le cellule ai risultati successivi del genotipaggio. Per iniziare la dissezione, anestetizzare il primo animale mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina. Quando l'animale non risponde al test del pinzamento della coda, immergerlo in acqua ghiacciata per 30 secondi fino a quando non diventa ipotermico.

Quindi risciacquare una piccola piastra di alluminio, il bisturi per la decapitazione e la testa dell'animale con etanolo al 70% per evitare contaminazioni del tessuto cerebrale durante la dissezione; decapitare con il bisturi, lasciare che la testa cada sulla piastra di alluminio e trasferirla sotto la cappa. Rimuovere delicatamente il cervello tagliando prima la pelle con il piccolo bisturi per esporre il cranio. Tagliare intorno al cranio per 360 gradi.

Quindi rimuovere il coperchio cranico con una pinzetta. Sollevare il cervello dal cranio utilizzando una spatola piccola e collocarlo in un tubo da 15 millilitri contenente ghiaccio. Immergere il tubo in PBS freddo e riporlo nuovamente sul ghiaccio prima di rimuovere il cervello successivo.

Ripetere le dissezioni fino a quando non si hanno tre cervelli in provette separate poste sul ghiaccio. Versare un cervello e il PBS sulla prima piastra di dissezione. Sotto il microscopio, posizionare il cervello su una piattaforma di colla sill guard che funge da cuscino, in modo che la lama mantenga il filo.

Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire i segmenti in un nuovo tubo contenente PBS, al fine di lavare i segmenti prima del trasferimento nella soluzione di pepaina. Avviare un timer non appena i primi segmenti vengono immessi, continuando le dissezioni fino a quando tutti i cervelli sono in fase di digestione. In papaina.

I primi segmenti cerebrali avranno digerito per circa un'ora. Entro il momento in cui vengono aggiunti gli ultimi segmenti, consentire alla digestione di proseguire per un'ulteriore ora durante la digestione stessa. Assicurarsi che la temperatura nel bagnomaria di pepane sia stabilizzata a 34 gradi Celsius.

Per iniziare il passaggio di centrifugazione, utilizzare una pipetta trasferibile per posizionare i segmenti cerebrali in un tubo sterile da 15 millilitri. Si consiglia di evitare di trasferire eccessiva soluzione di pepane. Tuttavia, se ciò dovesse accadere, rimuovere il pepane in eccesso.

Successivamente, lavare i segmenti aggiungendo due millilitri di mezzo neuronale riscaldato dall'incubatrice. Lasciare depositare i segmenti, quindi eliminare con attenzione la maggior quantità possibile di soluzione senza disturbare i segmenti. Eseguire un totale di tre lavaggi.

Ricordarsi di cambiare le pipette tra un lavaggio e l'altro per evitare contaminazioni, utilizzando ogni volta una pipetta nuova. Iniziare le iterazioni in due millilitri di mezzo neuronale. Triturare 25 volte, evitando di introdurre bolle d'aria.

Quindi lasciare sedimentare i segmenti non associati per tre minuti. Utilizzare una pipetta di trasferimento per raccogliere la maggior quantità possibile di soprannatante senza disturbare i segmenti sul fondo. Mantenere il soprannatante in un nuovo tubo sterile da 15 millilitri.

Ripetere il passaggio precedente utilizzando una punta da pipetta da 1000 microlitri e successivamente una punta da 200 microlitri, dopo di che i segmenti dovrebbero apparire completamente dissociati ad occhio nudo. Il soprannatante di tutte le operazioni viene raccolto nello stesso tubo da 15 millilitri. Siamo pronti per seminare le cellule, che vengono infine ripetutamente aspirate e rilasciate 10 volte con una pipetta Pasteur per ottenere una sospensione cellulare omogenea da conteggiare.

Utilizzando una punta pipetta sterile gialla, coprire ogni estremità della pinzetta. Lasciare cadere con attenzione un anello per vetrino il più centrato possibile rispetto al vetro. All'interno di ogni piastra, questi anelli verranno utilizzati per isolare un'area all'interno della piastra di coltura in cui verranno seminate le cellule neuronali.

Utilizzare la punta della pipetta per far scivolare gli anelli al centro del pozzetto di ogni piastra. Aggiungere delicatamente il volume appropriato di cellule alla piastra. Aggiungere le cellule al centro dell'anello che è già stato posizionato nella piastra.

Ricordarsi di cambiare la punta per ogni piastra. Successivamente, aggiungere cento microlitri di soluzione di GDNF diluita il più vicino possibile all'esterno dell'anello di ciascuna piastra per favorire la proliferazione dei neuroni. Poi, l'inibitore della mitosi fluoro dioxina o FDU viene aggiunto all'esterno dell'anello per impedire che le cellule gliali crescano eccessivamente.

Le punte della pipetta vengono spesso riposte nell'incubatrice e si lasciano le cellule sedimentare durante la notte; il giorno successivo, utilizzando punte di pipetta sterili per coprire le estremità della pinzetta, rimuovere gli anelli, reinserire le piastre nell'incubatrice e disturbarle il meno possibile fino al momento degli esperimenti. Controllare le piastre quotidianamente per eventuali contaminazioni e, se ne vengono osservate, rimuovere immediatamente le piastre problematiche. Le colture sono pronte per essere utilizzate in esperimenti di elettrofisiologia, biologia molecolare e immunoistochimica citoplasmatica entro tre settimane.

Ora che le cellule sono state seminate, esaminiamo alcuni esempi rappresentativi di cellule in coltura. Qui stiamo osservando una coltura primaria seminata 14 giorni fa. Questo è un esempio di una buona coltura, poiché è possibile vedere chiaramente corpi cellulari distinti con prolungamenti che si estendono da essi.

Inoltre, osservare l'assenza di qualsiasi crescita di muffe o funghi nella piastra, che indicherebbe un'infezione. Vi abbiamo appena mostrato come generare colture primarie dissociate di cellule dopaminergiche del mesencefalo da neonati roditori. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere un ambiente sterile, utilizzare esclusivamente neonati da P0 a P2, seminare su substrati gliali sani con mezzo condizionato da cellule gliali e mantenere una densità di semina costante.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.