Name: Dal MEF per Matrigel 2: hESC scissione dal MEF sul Matrigel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-09T18:48:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Scopri la coltura di cellule staminali embrionali umane senza strato alimentatore su Matrigel. Questo metodo include il passaggio continuo e la conferma della pluripotenza mediante microscopia a immunofluorescenza.

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Embrionali umane studi sulle cellule staminali in laboratorio Teitell sono supportati da una California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) sementi concedere RS1-00313. Ringraziamo i membri del Centro di Medicina Rigenerativa Broad e ricerca sulle cellule staminali presso la UCLA, in particolare il Dott. Amander Clark, il Dr. Jerome Zack, e membri del Fondo per la UCLA Stem Cell Institute Broad core per il loro sostegno dei nostri studi.

hESC manutenzione cultura quotidiana <ol><li> terreni di coltura hESC deve essere cambiato ogni 24 ore. Dalla bottiglia ES magazzino multimediali memorizzati a 4 ° C, estrarre la quantità di soluzione necessaria (~ 20ml per 6 pozzetti), posto in un tubo da 50 ml falco, e calda a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. Una volta che la media è riscaldato, aggiungere bFGF conservato a 4 ° C ad una concentrazione finale di 10ng/ml. Mettete il brodo bFGF torna a 4 ° C subito dopo l&#39;uso! </li><li> Togliere dal 6 pozzetti tutti ma ~ 500μl dei media. Assicurati di agitare il piatto cultura di sospendere i detriti per la rimozione. Assicurarsi che il bFGF in terreni di coltura del hESC sia ben mescolata e aggiungere 3 ml di mezzi freschi di nuovo in ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Rimettere la piastra nell&#39;incubatrice. </li></ol> HESC scissione dal MEF sul Matrigel Di solito un confluenti 6 pozzetti di hESC sul MEF possono essere divisi 1:02-1:03 su Matrigel piatti 6-bene, con i pozzi di diventare confluenti ancora 4-5 giorni dopo la divisione. <ol><li> Quando hESC suddivisione su Matrigel, MEF condizionata media (CM) è usato per mantenere la pluripotenza. MEF condizionata media è in anticipo. Il primo giorno, 1,5 × 10 7 γ-irradiati MEF sono seminati in un pallone T75. Il secondo giorno, MEF vengono lavati una volta con temperatura ambiente 1 × PBS, pH 7,4, e poi 15 ml di media ES integrato con 5ng/ml bFGF si aggiunge al pallone. (NOTA: MEF può essere placcato in fiasche più piccole o più grandi, ma proporzione tra la densità delle cellule e il volume dei mezzi di comunicazione ES deve essere costante.) Il pallone viene incubata a 37 ° C per altre 24 ore. Il terzo giorno, il CM è raccolto e sostituito con 15 ml di media ES fresca integrato con 5ng/ml bFGF. Il CM raccolto viene conservato a 4 ° C. MEF condizionata da una placcatura mezzi di MEF sono raccolte più di sette giorni consecutivi di generare 15 × 7 = 105ml. Dopo sette giorni, tutte le frazioni CM sono combinati, sterile filtrata, aliquotati e conservati a -20 ° C. Mezzi di comunicazione CM preparato come descritto possono essere memorizzati e utilizzati per 1 mese. </li><li> Un giorno prima divisione hESC, messo aliquote Matrigel in tubi eppendorf a 4 ° C per scongelare tutta la notte (una aliquota contiene 76.2mg di Matrigel, e questo è l&#39;importo necessario per un 6-pozzetti). Il giorno della scissione, prendere un flaconcino di Matrigel scongelati per un 6-pozzetti, mettere il flaconcino e 6 ml di freddo DMEM/F12 multimediale su ghiaccio. Trasferire il Matrigel nel DMEM/F12 media e mescolare bene. Aggiungere 1 ml della soluzione in ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Agitare la piastra per distribuire Matrigel sulla superficie e incubare il Matrigel coperto di piastra a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima di dividere la hESC. </li><li> hESC il MEF sono lavati una volta con 1 × PBS, pH 7,4. Successivamente 1 ml di caldo collagenasi IV (1mg/ml) viene aggiunto in ciascun pozzetto della piastra ben 6 e poi la piastra viene incubata a 37 ° C per 5-10 min. </li><li> Aggiungere 1ml di media ES senza bFGF in ciascun pozzetto. Utilizzare una pipetta 1 ml di far saltare le cellule staminali fuori dal piatto. Raccogliere tutti i supporti contenenti grumi di hESC e morti MEF in una provetta da 50 ml falco. Lasciate grumi di cellule grandi accontentarsi di 5-10 minuti in modo che le macchie hESC forma una pallina sul fondo della provetta mentre il MEF rimangono sospese nel supernatante. Eliminare il supernatante e lavare da risospendere il pellet mezzi hESC ES manca bFGF, seguita da centrifugazione a temperatura ambiente a 200 g per 5 min. </li><li> Alla piastra le cellule staminali su piastre Matrigel, prima lavare i piatti Matrigel con temperatura ambiente DMEM/F12 (1 ml per pozzetto) e l&#39;aggiunta di 2,5 ml di CM integrata con 10ng/ml bFGF per bene. Risospendere il pellet in un volume adeguato di CM integrata con 10ng/ml bFGF, pipetta la sospensione cellulare su e giù parecchie volte fino a quando le macchie diventano uniformi e di piccole dimensioni. Aliquota la sospensione a 0,5 ml per pozzetto sul piatto Matrigel. Si noti che la densità colonia su Matrigel è superiore alla densità delle colonie dividendo consueto MEF. Posizionare la piastra a 37 ° C di coltura tissutale incubatore. </li><li> Per mantenere la hESC su Matrigel, media CM integrato con 10ng/ml bFGF è cambiato ogni 24 ore per un massimo di 4-5 giorni. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts++%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Questo video mostra come hESC passaggio da piastre MEF per alimentatore cell-free piastre Matrigel. Si noti che la densità colonia su Matrigel è superiore alla densità delle colonie dividendo consueto MEF. Immunofluorescenza e la citometria a flusso o microscopia per i marcatori hESC pluripotenza, come Oct-4 e SSE-4, sono necessari per confermare la manutenzione di hESC in uno stato indifferenziato di alimentazione priva di condizioni di coltura.

<table><tbody><tr><td>Sostituto del siero per knockout (KSR)</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagente</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispasi</td><td>Reagente</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina / Stretomicina </td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reagente</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Oct-4</td><td>Reagente</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo IgG3 coniugato con fito&amp;#8211;eritrina anti-h/mSSEA-4</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Antitopo IgG coniugato con FITC</td><td>Reagente</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

dal mef per matrigel 2: hesc scissione dal mef sul matrigel

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) su fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule di alimentazione, come hESC passaggio da piastre MEF per alimentatore cell-free piastre Matrigel.

Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 2 di 3.

Dal MEF per Matrigel 2: hESC scissione dal MEF sul Matrigel

Questo video dimostra come coltivare cellule staminali embrionali umane (hESC) su cellule feeder di fibroblasti embrionali di topo (MEF), come effettuare il passaggi delle hESC da MEF...

Per mantenere la coltura di cellule staminali embrionali umane, il mezzo di coltura deve essere sostituito ogni 24 ore. Per fare ciò, iniziare prelevando una bottiglia di riserva di mezzo per cellule staminali embrionali conservata a quattro gradi Celsius. Prelevare la quantità di soluzione necessaria, che di solito è di circa 20 millilitri per ogni sei.Piastra multiwell e posizionare tale quantità in un tubo Falcon da 50 millilitri, quindi riscaldare il tubo con il contenuto a 37 gradi Celsius in un bagno termico. Una volta riscaldato il mezzo, aggiungere il FGF, precedentemente conservato a quattro gradi Celsius, fino a una concentrazione finale di 10 nanogrammi per millilitro. Assicurarsi di riporre immediatamente il stock di BFGF a quattro gradi Celsius dopo l'uso.Assicurarsi che il BFGF nei mezzi di coltura cellulare staminale umana con amox sia completamente miscelato. Successivamente, rimuovere tutti i mezzi da ogni pozzetto lasciandone circa 500 microlitri per pozzetto. Poi, aggiungere nuovamente tre millilitri di mezzo fresco in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti e reinserire la piastra nell'incubatore.Ora che vi abbiamo mostrato come mantenere le cellule staminali embrionali umane su ONMs, vi mostreremo successivamente come trasferirle su matrigel. Per suddividere le cellule staminali embrionali umane coltivate su ONMs e trasferirle su matrigel, partiamo da una piastra a sei pozzetti confluenti di cellule staminali su mes, che possono essere suddivise da uno a due o da uno a tre su matrigel. Piastre a sei pozzetti.Questo permetterà alle colture di raggiungere di nuovo la confluenza quattro-cinque giorni dopo il passaggio. Quando si effettua il passaggio di cellule staminali embrionali umane su matrigel, utilizzare il mezzo condizionato da meth per mantenere la pluripotenza. Il mezzo condizionato da meth viene preparato in anticipo, raccogliendo ogni giorno per sette giorni il mezzo, integrato con cinque nanogrammi per millilitro di BFGF, da una coltura di meth in crescita. Il mezzo per cellule staminali embrionali viene quindi usato per sostituire il mezzo condizionato da meth rimosso.Ogni giorno. Il mezzo condizionato con metionina dovrebbe essere utilizzato entro un mese dalla raccolta e dal congelamento. Il giorno prima della suddivisione delle cellule staminali embrionali umane, trasferiamo aliquote di matrigel in provette EOR da meno 20 gradi Celsius a quattro gradi per scongelarle durante la notte.Un'aliquote contiene due milligrammi di matri gel, ovvero la quantità necessaria per una piastra a sei pozzetti. Nel giorno della suddivisione, prelevare un flaconcino di matri gel scongelato.Per ogni piastra a sei pozzetti, mescolare ogni fiala con sei millilitri di mezzo D-M-E-M-F 12 freddo. Ricordarsi di mantenere il tutto sul ghiaccio. Aggiungere un millilitro della soluzione in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti.Quindi agitare delicatamente la piastra per distribuire il matrigel sulla superficie e incubare la piastra ricoperta di matrigel a temperatura ambiente per almeno un'ora prima di suddividere le cellule staminali embrionali umane. Prima di suddividere le cellule staminali embrionali umane, lavare le cellule staminali su MES una volta con un XPBS pH 7,4. Successivamente, aggiungere un millilitro di collaghenasi IV calda a una concentrazione di un milligrammo per millilitro in ciascun pozzetto da suddividere, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque-dieci minuti.Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di terreno per cellule staminali embrionali senza BFGF in ciascun pozzetto, utilizzando una pipetta da un millilitro per staccare le cellule staminali dalla piastra. Raccogliere tutto il terreno contenente aggregati di cellule staminali e mes morti in un tubo falcon da 15 millilitri. Lasciare sedimentare gli aggregati cellulari più grandi per cinque minuti, in modo che gli aggregati di cellule staminali formino un pellet sul fondo del tubo mentre i mes rimangono sospesi nel surnatante.Una volta che le cellule sembrano essersi depositate, eliminare il soprannatante e lavare le cellule risospendendo il pellet di cellule staminali embrionali. Utilizzando il mezzo per cellule staminali embrionali senza BFGF, centrifugare successivamente a temperatura ambiente a 200 ×g per cinque minuti. Mentre le cellule sono in centrifugazione, possiamo preparare le piastre in matrigel per la semina delle cellule staminali lavando le piastre con D-M-E-M-F 12 a temperatura ambiente, usando un ml per pozzetto, e aggiungendo 2,5 millilitri di mezzo condizionato integrato con 10 nanogrammi per ml.BFGF per pozzetto dopo la centrifugazione. Risospendere, sospendere il pellet in un volume appropriato di mezzo condizionato di metionina integrato con 10 nanogrammi per millilitro di BFGF, pipettare la sospensione cellulare su e gi&ugrave; diverse volte fino a quando gli aggregati diventano uniformi e di piccole dimensioni.Successivamente, aliquotare la sospensione in 0,5 millilitri per pozzetto sulla piastra con matrigel per ottenere un volume finale di tre millesimi di millilitro per pozzetto. Per il matrigel, utilizziamo una densità di colonie più elevata rispetto alla suddivisione normale su maths, una volta aggiunte le cellule. Posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius.Per mantenere le cellule staminali embrionali umane in condizione di matrigel. Il mezzo, integrato con 10 nanogrammi per millilitro di FGFb, viene sostituito ogni 24 ore per un massimo di quattro-cinque giorni.Le cellule staminali embrionali umane sono solitamente contaminate da quantità residue di MEF dopo il primo passaggio su Matrigel; il secondo passaggio da Matrigel a Matrigel rimuoverà completamente eventuali tracce di cellule feeder contaminanti la coltura di cellule staminali.

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In questo video ci dimostra come il nostro laboratorio passaggi di routine RIFLESSI embrionali umane linee di cellule staminali con tripsina.

RIFLESSI Passaging sulle cellule staminali embrionali umane-linee con tripsina

Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) sulle cellule dei fibroblasti del mouse (MEF) le cellule di alimentazione. Parte 1 di 3.

Dal MEF per Matrigel I: hESC Passaging in presenza di MEF

Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 3 di 3.

Dal MEF per Matrigel 3: hESC Passaging da Matrigel su Matrigel

Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

La qualità di fibroblasti embrionali di topo (MEF) è dettata dal ceppo destro del mouse, ad esempio CF-1. Pluripotenza-solidale MEF e mezzi condizionati (CM) ottenuti da questi dovrebbe contenere le concentrazioni ottimali di Activin A, Gremlin e Tgfβ1 necessari per la Activin / Nodale FGF e percorsi di co-operativamente mantenere il self-renewal e la pluripotenza.

Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

Nonostante gli sforzi volti a culture di transizione a feeder liberi condizioni, la derivazione e la cultura di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimangono in gran parte dipendente dal co-colture con alimentatori embrionali di topo (MEF). Qui vi mostriamo una nuova metodologia per la rapida rimozione di alimentatori da culture hESC prima della sperimentazione.

Fibroblast rimozione veloce da alta densità Culture staminali embrionali umane

Qui, descriviamo un protocollo basato su riprogrammazione epigenetica di cellule staminali embrionali umane (hESCs) verso generare una popolazione omogenea di progenitori muscolari scheletriche che in condizioni di coltura permissive formano cluster tridimensionali delle miofibre contrattili (myospheres), che ricapitolano caratteristiche biologiche umana muscoli scheletrici.

Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

Qui, presentiamo protocolli di coltura di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), basati sulla crescita di singole cellule dissociate in monostrato (NCM) di tipo non coloniale. Questo nuovo metodo, che utilizza inibitori della chinasi Rho-associati o l'isoforma 521 della laminina (LN-521), è adatto per la produzione di grandi quantità di hPSC omogenee, la manipolazione genetica e la scoperta di farmaci.

Le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica

Linee cellulari Reporter offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse da popolazioni eterogenee. Tuttavia,-gene targeting utilizzando convenzionale ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali umane è estremamente inefficiente. Qui, descriviamo il targeting CNS mesencefalo specifico PITX3 locus fattore di trascrizione con EGFP utilizzando zinc-finger nucleasi avanzata ricombinazione omologa.

Zinc-finger nucleasi avanzata gene targeting in cellule staminali embrionali umane

Qui, presentiamo un protocollo per generare in modo efficiente cellule trofoblastiche umane da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando la proteina morfogenica ossea 4 e inibitori delle vie Activina/Nodale. Questo metodo è adatto per la differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane e può generare grandi quantità di cellule per la manipolazione genetica.

La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

Le proteine ​​contengono spesso più domini che possono esercitare diverse funzioni cellulari. Gene knock-out (KO) non considerano questa diversità funzionale. Qui riportiamo un cambio cassette ricombinazione mediata (RMCE) approccio basato lo struttura-funzione in cellule staminali embrionali KO che consente la dissezione molecolare dei vari domini funzionali o varianti di una proteina.

Studi struttura-funzione nel topo cellule staminali embrionali Uso ricombinasi mediata Cassette Scambio

Scopri la coltura di cellule staminali embrionali umane senza strato alimentatore su Matrigel. Questo metodo include il passaggio continuo e la conferma della pluripotenza mediante microscopia a immunofluorescenza.

Dal MEF per Matrigel 2: hESC scissione dal MEF sul Matrigel

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