L'applicazione di una degenerazione C. elegans Dopamina Saggio Neuron per la convalida dei potenziali morbo di Parkinson geni

Nel Caldwell Lab, AKA, il Worm Shack, studiamo i meccanismi neurologici delle malattie nell'eleganza del mare. E dopo una lunga giornata di fruttuosa sperimentazione, ci premiamo con qualche attività ricreativa. Ciao, sono Adam Knight, studente universitario del Calwell Laboratory del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università dell'Alabama.

Oggi, io e altri mostreremo come eseguire un saggio di degenerazione dei neuroni della dopamina in C Elegants. Incrocierò un ceppo di verme neurodegenerativo della dopamina con ceppi transgenici che sovraesprimono i geni correlati alla malattia e i neuroni della dopamina. Ciao, sono Adam Harrington, uno studente laureato presso il Caldwell Lab.

Oggi vi mostrerò come impostare i vermi transgenici per l'analisi dei neuroni della dopamina. Ciao, sono Shu Amichi e sono uno studente laureato. Qui vi mostrerò come analizzare i neuroni della dopamina di C elegance, che sono chiamati porcini e aiutanti.

Generalmente i vermi che esprimono solo GFP nei neuroni della dopamina non mostrano morte cellulare. Tuttavia, in presenza di CLE, si osserveranno quelli e la neurodegenerazione dipendente dall'età Utilizzando questo test, un transgene potrebbe essere co-espresso nei neuroni della dopamina per determinare se può aumentare o sopprimere la tossicità indotta dal CLE. Quindi iniziamo.

Prima di effettuare l'analisi dei neuroni della dopamina, dobbiamo prima incrociare i ceppi di GaN appropriati per iniziare a posizionare otto mulini che esprimono sia il nucleo alfa che la GFP sotto il controllo del promotore specifico del neurone della dopamina dat one sulla piastra di accoppiamento. Ora aggiungiamo due afroditi transgenici L a quattro stadi che mostrano un'espressione specifica del neurone dopamina del nostro gene candidato di interesse, così come l'espressione delle cellule muscolari della parete corporea del marcatore selezionabile DS rosso due fluorescenti. È importante notare che per ogni costrutto transgenico generiamo tre linee transgeniche stabili.

Quindi questo incrocio genetico dovrebbe essere eseguito individualmente per ciascuna delle tre linee stabili separate create. Dopo due giorni, rimuovere e scartare i maschi dopo altri due o tre giorni. Ispeziona la generazione F1.

Ci sono diversi discendenti maschi e l'accoppiamento è andato a buon fine. Successivamente, trasferire individualmente su nuove piastre cinque da Afrodite L quattro animali da ciascun incrocio che mostrano sia il marcatore fluorescente GFP ereditato dal genitore maschio che il marcatore muscolare della parete corporea rosso DS due ereditato dal genitore hamadi. Gli animali trasferiti devono essere allo stadio L quattro per assicurarsi che non l'abbiano ancora M.

Con gli animali maschi presenti sulla piastra, lasciare che gli animali si autofecondino per tre o quattro giorni per produrre una progenie F due. Ora ripulisci la progenie F two per fare questo. Trasferisci da cinque a 10 animali che espongono entrambi i pennarelli dei centesimi sulle loro targhe individuali.

Quindi eseguire lo screening della generazione F 3 per piastre in cui il cento per cento degli animali esprime GFP nei neuroni della dopamina e in cui alcuni degli animali esprimono il DS rosso due marcatori fluorescenti e le cellule muscolari della parete corporea. Questi animali saranno omozigoti per l'alfa sinucleina e i geni GFP e trasmetteranno stabilmente anche il transgene appena creato. Una volta completato lo screening, siamo pronti per eseguire l'analisi dei neuroni dopaminergici.

Per iniziare l'analisi dei neuroni, preparare una nuova piastra degli animali F tre identificati nel passaggio precedente. Prepara una piastra per ciascuna delle tre linee transgeniche. Inoltre, la piastra alfa-sinucleina GFP da sola come ceppo di controllo consente ai vermi di crescere fino all'età adulta.

Una volta che i vermi hanno raggiunto l'età adulta, trasferisci da 30 a 40 animali transgenici da ogni linea su un piatto fresco. Lasciali deporre le uova per cinque ore a 20 gradi Celsius. Dopo cinque ore, rimuovere e gettare.

Gli adulti permettono agli embrioni di svilupparsi per tre o quattro giorni a 20 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio L quattro. Quindi, raccogli circa un centinaio di animali transgenici L quattro su una piastra contenente 0,04 milligrammi per millilitro di cinque fluoro. Due deossi uridina.

Questo analogo nucleotidico impedisce lo sviluppo della generazione successiva attraverso l'inibizione della sintesi del DNA. Poiché le piastre FDUR sono sensibili alla luce, proteggerle dalla luce mantenendo le piastre al coperto e avvolte completamente. Crea un tampone lordo per l'analisi del verme.

Questi vengono utilizzati freschi e non vengono lasciati asciugare. Posiziona due vetrini da microscopio con un pezzo di nastro adesivo. Per lungo. Il nastro funge da distanziatore per cuscinetti di spessore equivalente.

Appoggia un terzo scivolo tra di loro sulla panca. Sono posizionati. Tre a fianco.

Posizionare una goccia di arus fuso sul lato centrale e adagiare rapidamente un altro vetrino sopra gli agros perpendicolari due e su tutti e tre i vetrini. Ripetere l'operazione per creare diversi tamponi aggiuntivi, quanti ne sono necessari per il numero di campioni da analizzare. Una volta che i cuscinetti della coclea sono pronti, posizionare una goccia da sei microlitri di tre millimolari, sega da 11 miglia e anestetico su un vetro di copertura da 22 x 30 millimetri.

Raccogli 40 animali adulti nella goccia e poi capovolgi il vetro di copertura sul pad agros. Ripetere l'operazione per ciascuna delle altre righe. Assegna un punteggio a 30 animali per linea per la presenza di ciascun CEP e di un neurone D.

Utilizzando un microscopio composto con epifluorescenza in un cubo filtrante che consente la visualizzazione di FITC o GFP, utilizzeremo un cubo filtrante endo G-F-P-H-Y-Q per registrare i dati su un foglio di punteggio. Gli animali selvatici conservano la GFP completa per le lezioni in tutti e quattro i neuroni CEP e due neuroni A DE. I singoli animali che mostrano perdita di neuroni D sono classificati come wild type noti o degenerati.

Questi neuroni vengono registrati come LG o perdita di GFP. Allo stesso modo, l'entità della degenerazione può essere valutata contando il totale dei neuroni persi in ciascun animale e la popolazione ripete l'analisi altre due volte. Utilizzando 30 animali in più per linea per prova.

Viene calcolata la media del numero totale di vermi che presentano neuroni dopaminergici wild type dai tre cicli di analisi. L'analisi statistica per la neuroprotezione viene quindi eseguita utilizzando il valore P del test T dello studente inferiore a 0,05. Per confrontare i vermi di controllo con ceppi che sovraesprimono geni candidati nei neuroni dopaminergici, eseguire questa analisi di vari giorni successivi alla corsia delle uova, i giorni appropriati di analisi di determinati empiricamente.

Ad esempio, abbiamo determinato che il 77%, 87% e il 90% degli animali alfa CLE più GFP mostrano neuroni dopaminergici degenerati rispettivamente al sei, settimo e 10 giorno dopo lo sviluppo. Pertanto, se prevediamo che il transgene di interesse possa aumentare la neurodegenerazione, analizzeremo al sesto giorno. Allo stesso modo, il transgene che potrebbe sopprimere la neurodegenerazione sarà analizzato al settimo e al decimo giorno.

Ti abbiamo appena mostrato come eseguire un saggio di neurodegenerazione della dopamina in sea elegance. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare un marcatore appropriato per la selezione durante gli incroci genetici. Due, usa maschi sani e L quattro HEDIS per le croci.

E tre, assicurati di assegnare un punteggio attento e coerente ai neuroni CEP e DE. Questa procedura consente di individuare rapidamente il fattore genetico che può aumentare o sopprimere la neurodegenerazione indotta dall'alfa alfa CLE. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.