Paradigmi per la caratterizzazione farmacologica di C. elegans Mutanti trasmissione sinaptica

Ciao, sono Cody Locke del Caldwell Laboratory del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università dell'Alabama. Sono Kyle Lee e vi mostrerò come preparare i vermi per i saggi di esposizione a outta carb e PTZ. Sono Bernard Tu e vi mostrerò come eseguire i saggi di outta carb.

Sono Kaylin Berry e sono responsabile dei video su C. elegans. In questa presentazione, commenterò il contenuto e mostrerò il saggio di esposizione al PTZ. Oggi, io e i miei colleghi illustreremo come caratterizzare mutanti della trasmissione sinaptica utilizzando un modello di epilessia basato su C. elegans, dopo esposizione al PTZ e all'aldecarb, con una serie di ceppi mutanti rappresentativi.

Iniziamo dunque. Oggi Kyle Lee ci illustrerà la preparazione dei saggi ALD carb nel primo giorno della procedura. Assicurarsi che almeno 30 vermi allo stadio di giovane adulto per ogni genotipo e per ogni replica siano disponibili per i saggi ALD carb nel secondo giorno.

È preferibile che un sperimentatore selezioni 50 o più vermi allo stadio L4 su piastre NGM fresche, prive di fungicida, seminate con e coli OP50 come fonte alimentare. Coltivare i vermi per 12-24 ore a una temperatura costante e permissiva. La temperatura ottimale è compresa tra 20 e 22 gradi Celsius, anche se è accettabile anche 25 gradi Celsius.

Nel secondo giorno, preparare una soluzione madre di Al Decarb a 100 millimolari e alcol etilico al 70%, quindi distribuire la quantità appropriata di Al Decarb su piastre NGM. Utilizziamo costantemente 0,5 millimolari di Al Decarb aggiungendo 37,5 microlitri di Al Decarb 100 millimolari su piastre di Petri da 60 millimetri non ventilate contenenti 7,5 millilitri di gm. Lasciare asciugare le piastre con Al Decarb per circa 30-60 minuti a temperatura ambiente.

Non è necessario rompere i coperchi dopo che le piastre sono asciutte. Aggiungere volumi costanti di e coli al centro di ogni piastra di alde carb e far asciugare per altri 30-60 minuti. A temperatura ambiente, di solito aggiungiamo 25 microlitri di e coli OP 50.

Questo volume di OP 50 crea un prato di cibo di dimensioni sufficienti per mantenere i vermi in una piccola zona al centro della piastra, evitando il sovraffollamento. Una volta che il prato di cibo è asciutto, procedere con i saggi alba carb. A causa della natura soggettiva dei saggi ALD carb, si raccomanda vivamente di eseguire gli esperimenti in cieco.

Per fare ciò, un collega del sperimentatore principale deve etichettare nuovamente le piastre originali contenenti i vermi da sottoporre a saggio, oppure il collega può trasferire i vermi dalle piastre originali a piastre con etichetta cifrata immediatamente prima di avviare un cronometro. Ora che le piastre sono state etichettate, si procederà con l'analisi, iniziando a contare il numero di vermi paralizzati.

Esistono due approcci principali per definire la paralisi indotta da al decarb acuto. Il primo approccio definisce la paralisi come l'arresto del pompaggio faringeo. In questa nota video, una struttura scura situata all'interno della cavità della faringe del verme, a destra dello schermo.

Questa struttura è chiamata macina e si contrae in modo ritmico attraverso un meccanismo colinergico. La locomozione del verme in questo video è stata fortemente rallentata dall'esposizione ad Al Decarb. Tuttavia, la macina faringea di questo verme si sta ancora muovendo chiaramente.

Pertanto, questo verme non è paralizzato da un'arresto del pompaggio secondo la definizione. Si dovrebbe osservare in questo video che il macinatore faringeo, situato a destra dello schermo, non si contrae con l'arresto del pompaggio, come previsto dalla definizione operativa di paralisi indotta da al Decarb. Questo verme deve essere classificato come paralizzato.

Tuttavia, come il verme nel video precedente, anche questo verme sta esibendo lievi movimenti di foraggiamento da un lato all'altro. Nonostante la sua locomozione sia compromessa dall'Al Decarb, questi movimenti impedirebbero a un sperimentatore di considerare questo verme paralizzato secondo il secondo criterio per definire la paralisi indotta da Al Decarb, ovvero l'immobilità completa del corpo e l'assenza di risposta al tocco. Il secondo approccio alla definizione della paralisi indotta da Al Decarb prevede di stimolare ripetutamente ciascun verme con un filo di platino e verificare la presenza di una risposta.

Se i movimenti del corpo non possono essere rilevati ad occhio nudo, il nostro approccio preferito consiste nel toccare due volte sul capo e due volte sulla coda i nostri vermi ogni 30 minuti per un totale di tre ore. Come potrete osservare, il verme in questo video non muove in modo evidente il proprio corpo. Tuttavia, poiché questo verme risponde alla stimolazione muovendo chiaramente la coda, non definiamo questo verme paralizzato.

In base alla seconda definizione di paralisi indotta da al decarb. Come il verme nel video precedente, questo verme non muove in modo evidente il proprio corpo e richiede quindi un test di stimolazione meccanica. Tuttavia, a differenza del verme nel video precedente, questo verme non risponde in modo chiaro alla stimolazione.

Pertanto, questo verme è paralizzato secondo la seconda definizione di paralisi indotta da aldecarb. Sebbene la differenza tra vermi paralizzati e non paralizzati da aldecarb possa essere sottile, gli sperimentatori dovrebbero essere in grado di identificare alterazioni significative e la trasmissione sinaptica semplicemente osservando un gran numero di vermi rappresentativi esposti ad Al Decarb immediatamente dopo essere stati trasferiti su piastre contenenti Al Decarb. I vermi di tipo selvatico rimangono mobili.

In questo video si vedranno gli stessi vermi di tipo selvatico del video precedente, dopo un'ora di esposizione alla decarbossilazione con Al. Si noti che i vermi stanno rallentando in una certa misura, ma si stanno ancora muovendo in modo evidente.

A differenza dei vermi di tipo selvatico, i mutanti tomasin one mostrati in questo video sono completamente immobilizzati o si muovono a malapena dopo un'ora di esposizione. Questo risultato è coerente con l'ipotesi che i mutanti tomasin one presentino una secrezione eccessiva di acetilcolina dovuta all'incapacità di regolare negativamente il rilascio del neurotrasmettitore alle giunzioni neuromuscolari, con l'eccesso di acetilcolina accumulato nelle fessure sinaptiche alle giunzioni neuromuscolari combinato all'inibizione della degradazione dell'acetilcolina. Bial Decarb rende i mutanti tomasin one ipersensibili, sebbene non mostrato qui, risultati simili sono stati postulati derivare da saggi con alde carb in presenza di alleli con perdita di funzione di on 43, che codifica l'ortologo di C. elegans della proteina chinasi dipendente dal calcio-calmodulina due. Questo video mostra mutanti on 25, che sono carenti nella trasmissione inibitoria GABAergica.

Dopo un'ora di esposizione all'alde carb, simili ai mutanti tomasin uno e M 43, questi mutanti mostrano significativi deficit locomotori indotti dall'alde carb e sembrano essere più compromessi rispetto ai vermi di tipo selvaggio esposti all'alde carb per un identico periodo di tempo. Questo risultato è coerente con l'ipotesi che i mutanti M 25 presentino un'eccessiva stimolazione dei muscoli della parete corporea dovuta alla combinazione dell'esposizione all'alde carb e a una ridotta trasmissione GABAergica, portando a un rapporto maggiore tra trasmissione eccitatoria e inibitoria nelle giunzioni neuromuscolari CL ELs e conseguente paralisi. Tuttavia, poiché i mutanti tomasin uno on 43 e on 25 mostrano sensibilità simili all'alde carb in questo punto temporale.

Nonostante le diverse cause che portano a un'eccessiva stimolazione dei muscoli della parete corporea, un sperimentatore non potrebbe conoscere il meccanismo sottostante all'ipersensibilità senza prima identificare le mutazioni responsabili. Per questo video, siamo tornati ai medesimi vermi di tipo selvatico mostrati in un video precedente, dopo tre ore di esposizione ad al Decarb; in questo punto terminale del nostro saggio ALD carb, si dovrebbe chiaramente osservare che questi vermi, sebbene di tipo selvatico, sono completamente immobilizzati o si muovono a malapena. Attualmente, questi vermi presentano un fenotipo simile a quello dei mutanti TOM one e M 25 osservati un'ora dopo l'esposizione ad alde carb, presumibilmente perché la trasmissione colinergica eccitatoria ha raggiunto livelli comparabili; al contrario, i mutanti Synap Bren one rimangono notevolmente mobili anche dopo tre ore di esposizione ad alde carb.

Questo risultato è coerente con i mutanti Synaptive Bren one, che presentano livelli anomali di secrezione del neurotrasmettitore, i quali mostrano una minore stimolazione colinergica nei muscoli della parete corporea rispetto ai vermi di tipo selvatico dopo esposizione a identici livelli di alde carb in questo momento. I mutanti Point on four, che sono specificamente carenti nella trasmissione colinergica, dovrebbero avere sensibilità simili all'Al Decarb rispetto ai mutanti Synaptive Bren one. Al contrario, i mutanti Tomasin one e O 25 ipersensibili rimangono paralizzati, non diversamente dai vermi di tipo selvatico.

Vale la pena notare che alcuni vermi, in particolare quelli resistenti all'Al Decarb, potrebbero tentare di strisciare fuori dalla piastra. In tal caso, l'operatore può distribuire una quantità costante di acido palmitico, che funge da barriera fisica al movimento dei vermi. Attorno alle piastre di Al Decarb, distribuiamo 25 microlitri di una soluzione contenente 10 milligrammi di acido palmitico per millilitro di etanolo.

Questo conclude il paradigma di esposizione Al Decarb. Ora illustrerò il paradigma di esposizione Penta Lean Terazol. Kaylin Berry ci assisterà negli saggi con PTZ.

La preparazione dei vermi per i saggi con PTZ è essenzialmente la stessa della preparazione dei vermi per i saggi con aldecarb. Le uniche differenze significative tra i due saggi sono le seguenti. Utilizziamo DDH due O come solvente per il PTZ invece dell'etanolo al 70%.

Inoltre, poiché spesso si seminano volumi maggiori di PTZ rispetto all'ALDE carb, si lasciano asciugare le piastre per almeno un'ora prima di aggiungere l'OP 50. L'acido palmitico può essere utilizzato anche con il PTZ. È inoltre importante notare che il PTZ è molto meno stabile dell'alde carb e deve essere conservato a meno 20 gradi Celsius.

Per iniziare l'analisi, contare il numero di vermi in convulsione epilettica alla luce ogni 30 minuti per un totale di un'ora. È preferibile classificare il numero di vermi con diversi tipi di convulsioni in categorie separate, come convulsioni generalizzate, convulsioni anteriori, che chiamiamo scosse della testa, combinazione di convulsioni anteriori con paralisi dei muscoli della parete corporea, che chiamiamo tonico-cloniche o paralisi generalizzata, che chiamiamo tonica-tonica. L'attività simile a crisi, come osservata nel verme a destra, segue spesso convulsioni tonico-cloniche, come osservate nel verme a sinistra tonico.

L'attività simile a una crisi potrebbe derivare semplicemente dall'affaticamento muscolare successivo a convulsioni tonico-cloniche ripetute. Tuttavia, i nostri dati non pubblicati indicano che alcuni vermi possono diventare tonici in presenza di PTZ in modo simile alla paralisi indotta da al decarb, senza aver precedentemente manifestato crisi tonico-cloniche. Qui mostriamo un verme rappresentativo con mutazione nella trasmissione sinaptica che si muove strisciando in assenza di PTZ, un antagonista del recettore GABA e un comune induttore di crisi in vari modelli animali di epilessia e convulsioni.

Si noti che l'estremità o la punta del verme oscilla da un lato all'altro durante la ricerca del cibo. In questo video mostriamo un altro verme della stessa linea mutante di trasmissione sinaptica utilizzata nel video precedente. Si osservi che questo verme, presente in una soluzione contenente 2,5 milligrammi di PTZ per millilitro di acqua, continua principalmente a muovere la testa da un lato all'altro durante la ricerca del cibo.

Tuttavia, questo verme interrompe occasionalmente la ricerca di cibo da un lato all'altro e invece spinge ripetutamente la sua parte anteriore in avanti. Infine, si dovrebbe osservare un verme che presenta la stessa mutazione dei vermi nei due video precedenti, in presenza di 10 milligrammi di PTZ per millilitro di acqua. Si noti che questo verme mostra una riduzione della ricerca di cibo laterale e spinge la sua parte anteriore in avanti con una frequenza e un'intensità maggiori rispetto alla concentrazione più bassa di PTZ.

Questi risultati dimostrano la dipendenza dalla dose di PTZ, che osserviamo in tutti i mutanti della trasmissione sinaptica sensibili al PTZ. È importante notare che l'esposizione al PTZ non è sufficiente per indurre convulsioni di tipo epilettico nei vermi di tipo selvatico. Allo stesso modo, abbiamo tentato, ma non osservato, convulsioni di tipo epilettico indotte da PTZ in vermi con deficit specifici nella trasmissione colinergica, come in *on four*, o in vermi con trasmissione colinergica eccessiva, come in *tomasin one*.

Pertanto, dovrebbe essere possibile caratterizzare ulteriormente i mutanti della trasmissione sinaptica con resistenza all'alde carb, distinguendo tra deficit nella funzione sinaptica generale o deficit specifici nella trasmissione colinergica, in base alla loro sensibilità relativa al PTZ. Forse sorprendentemente, un marcato riduzione della funzione nel mutante ONC 25, che non presenta espressione rilevabile di GABA nei neuroni motori inibitori di C. elegans, non mostra convulsioni epilettiche spontanee come osservato in questo video.

Un mutante ONC 25 con 10 milligrammi di PTZ per millilitro di acqua. Tuttavia, mostra convulsioni tonico-cloniche robuste, sebbene non mostrate precedentemente solo convulsioni con alcuni movimenti precedenti le convulsioni tonico-cloniche associate a ONC 25 e che imitavano le convulsioni dei mutanti synap Bren uno. Pertanto, un sperimentatore non dovrebbe presumere che tutti i mutanti GABA inibitori mostreranno convulsioni tonico-cloniche o attività simile a crisi toniche strettamente correlate in presenza di PTZ, specialmente considerando la probabilità di ottenere alleli mutanti ipomorfi.

Ora che abbiamo dimostrato l'ipersensibilità all'alde carb e al PTZ nei mutanti GABA inibitori, ma solo l'ipersensibilità all'alde carb e una sensibilità normale al PTZ nei mutanti privi di regolazione negativa della trasmissione colinergica, ci si potrebbe chiedere come si comportano i mutanti con perdita di funzione di UNC 43 in presenza di PTZ, dato che anch'essi sono ipersensibili all'alde carb, proprio come gli altri nostri mutanti della trasmissione sinaptica. I mutanti su 43 non mostrano convulsioni evidenti di tipo epilettico in assenza di PTZ, sebbene presentino raramente contrazioni spontanee, non ripetitive, dell'intero corpo. Tuttavia, dopo l'esposizione a 10 milligrammi di PTZ per millilitro di acqua, i mutanti con perdita di funzione su 43 manifestano convulsioni robuste, ripetitive e dipendenti dalla dose dell'intero corpo. Al momento, questi risultati sono ambigui, ma sembrano indicare che su 43 non debba avere un ruolo specifico nella trasmissione GABAergica inibitoria, né un ruolo esclusivo nella regolazione negativa del rilascio dei neurotrasmettitori.

Nel sistema nervoso di C. elegans, vi abbiamo appena mostrato come caratterizzare i mutanti della trasmissione sinaptica di CL elegans utilizzando stimolanti neurali complementari: alde carb, un inibitore della colinesterasi, e PTZ, un antagonista del recettore GABA. Quando si segue un paradigma farmacologico complementare, ricordate che il grado di sensibilità a uno stimolante neurale non può prevedere il grado di sensibilità all'altro stimolante neurale. L'utilizzo di saggi con alde carb dovrebbe aiutare a distinguere i mutanti GABA inibitori, che mostrano movimento oscillatorio della testa in presenza di PTZ ma sono ipersensibili all'alde carb, dai mutanti con deficit generale della funzione sinaptica, che mostrano anch'essi movimento oscillatorio della testa in presenza di PTZ ma sono resistenti all'alde carb. Inoltre, si deve considerare che i mutanti GABA inibitori mostrano movimento oscillatorio della testa in presenza di PTZ, mentre i vermi privi di regolazione negativa della trasmissione colinergica appaiono di tipo selvaggio in presenza di PTZ.

Pertanto, il test con PTZ potrebbe essere utilizzato anche per distinguere tra queste classi di mutanti della trasmissione sinaptica, che sono entrambi ipersensibili al carb Alde. In sintesi, un approccio complementare basato sui test con PTZ e carb Alde dovrebbe permettere a un sperimentatore di caratterizzare i mutanti della trasmissione sinaptica di C. elegans in un modo che non sarebbe possibile usando singolarmente uno dei due farmaci. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.