Paradigmi per la caratterizzazione farmacologica di C. elegans Mutanti trasmissione sinaptica

Ciao, sono Cody Locke del Caldwell Laboratory del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università dell'Alabama. Sono Kyle Lee e ti mostrerò come preparare i vermi per i saggi di esposizione fuori carboidrati e PTZ. Sono Bernard Tu e ti dimostrerò come eseguire i saggi dei carboidrati.

Sono Kaylin Berry e sono responsabile dei video di Sea Elegance. In questa presentazione, narrerò questa presentazione e dimostrerò il test di esposizione PTZ. Oggi i miei colleghi ed io mostreremo come caratterizzare i mutanti a trasmissione sinaptica con un modello di epilessia sea elegance dopo esposizione a PTZ e Alde carb con una serie di ceppi mutanti rappresentativi.

Quindi iniziamo. Kyle Lee ci inizierà oggi mostrando la preparazione dei saggi di carboidrati ALD il primo giorno della procedura. Assicurarsi che almeno 30 vermi allo stadio di giovani adulti di ciascun genotipo e di ciascun replicato siano disponibili per i test di carboidrati ALD il secondo giorno.

È meglio se uno sperimentatore seleziona 50 o più vermi a quattro stadi L su piastre NGM fresche prive di fungicidi posizionate con e coli OP 50 come fonte di cibo. Fai crescere i vermi per 12-24 ore a una temperatura costante e permissiva. Da 20 gradi Celsius a 22 gradi Celsius è la cosa migliore, anche se 25 gradi Celsius sono accettabili.

Il secondo giorno, preparare una soluzione madre da 100 millimolari di Al Decarb e distribuire il 70% di etanolo la quantità appropriata di Al Decarb su piastre NGM. Usiamo costantemente 0,5 millimolari di al Decarb placcando 37,5 microlitri di 100 millimolari di alde carb su piastre di Petri non ventilate da 60 millimetri con 7,5 millilitri in gm. Lasciare asciugare le piastre di carburazione alde per circa 30-60 minuti a temperatura ambiente.

Non è necessario rompere i coperchi dopo che i piatti sono asciutti. Aggiungere volumi costanti di e coli al centro di ciascuna piastra di carboidrati e asciugare per altri 30-60 minuti. A temperatura ambiente, in genere aggiungiamo 25 microlitri di e coli OP 50.

Questo volume di OP 50 crea un prato alimentare di dimensioni sufficienti per mantenere i vermi in un piccolo punto del centro del piatto senza sovraffollamento. Una volta che il prato del cibo è asciutto, procedere con i dosaggi dei carboidrati di alba. A causa della natura soggettiva dei saggi dei carboidrati ALD, si raccomanda vivamente di eseguire gli esperimenti alla cieca.

Per fare questo. Un collega dello sperimentatore principale rietichettava le piastre originali contenenti i vermi da analizzare, oppure il collega poteva trasferire i vermi dalle piastre originali alle piastre di cifratura e carboidrati immediatamente prima di avviare un timer. Ora che le piastre sono state sied boro, ABO procederà con l'analisi per iniziare l'analisi, contare il numero di vermi paralizzati.

Esistono due approcci principali per definire la paralisi acuta indotta da al decarb. Il primo approccio definisce la paralisi mediante cessazione del pompaggio faringeo. In questo video nota, una struttura scura che si trova all'interno del lume della faringe del verme a destra dello schermo.

Questa struttura è chiamata macinatore e si contrae ritmicamente attraverso un meccanismo colinergico. La locomozione del verme in questo video è stata notevolmente rallentata dall'esposizione all'Al Decarb. Eppure il macinatore faringeo di questo verme è ancora chiaramente in movimento.

Pertanto, questo verme non è paralizzato da una cessazione della definizione di pompaggio. Si dovrebbe vedere in questo video che il macinatore faringeo situato a destra dello schermo non si contrae con la cessazione del pompaggio come definizione di lavoro per la paralisi indotta da al Decarb. Questo verme dovrebbe essere classificato come paralizzato.

Tuttavia, come il verme nel video precedente, questo verme mostra lievi movimenti di foraggiamento da un lato all'altro. Nonostante la sua locomozione sia compromessa dall'Al Decarb, questi movimenti impedirebbero a uno sperimentatore di ritenere questo verme paralizzato dal secondo approccio per definire la paralisi indotta dall'Al Decarb, l'immobilità di tutto il corpo e l'insensibilità al tatto. Il secondo approccio per definire la paralisi indotta da al decarb consiste nel pungolare costantemente ogni verme con un filo di platino e controllare la risposta.

Se i movimenti del corpo non possono essere rilevati ad occhio nudo, il nostro approccio preferito è quello di pungolare i nostri vermi due volte sulla testa e due volte sulla coda ogni 30 minuti per un totale di tre ore. Come dovresti vedere, il verme in questo video non sta ovviamente muovendo il suo corpo. Tuttavia, poiché questo verme risponde all'incitamento muovendo chiaramente la coda, non lo chiamiamo paralizzato.

Con la seconda definizione di paralisi indotta da al decarb. Come il verme nel video precedente, questo verme non muove ovviamente il suo corpo e quindi richiede un test di pungolo. Tuttavia, a differenza del verme nel video precedente, questo verme non risponde chiaramente alla sollecitazione.

Pertanto, questo verme è paralizzato dalla seconda definizione di paralisi indotta da al decarbossilare. Sebbene la differenza tra paralizzati e non paralizzati da alde carb possa essere sottile, gli sperimentatori dovrebbero essere in grado di identificare alterazioni sostanziali e trasmissione sinaptica semplicemente osservando un gran numero di vermi rappresentativi esposti ad Al Decarb immediatamente dopo essere stati raccolti su piastre di Al Decarb. I worm di tipo selvaggio sono ancora mobili.

In questo video. Si vedranno gli stessi vermi di tipo selvatico del video precedente dopo un'ora di esposizione ad Al Decarb. Si noti che i vermi stanno rallentando in una certa misura, ma si stanno ancora muovendo chiaramente.

A differenza dei vermi di tipo selvatico, i mutanti di Tomasin one in questo video sono completamente immobilizzati o si muovono a malapena dopo un'ora di esposizione. Questo risultato è coerente con i mutanti della tomasina uno che hanno un'eccessiva secrezione di acetilcolina da un'incapacità di regolare negativamente il rilascio di neurotrasmettitori alle giunzioni neuromuscolari, l'eccesso di acetilcolina e le fessure sinaptiche alle giunzioni neuromuscolari combinate con l'inibizione della degradazione dell'acetilcolina, Bial Decarb rende i mutanti della tomasina uno ipersensibili, sebbene non mostrato qui, risultati simili sono stati postulati per derivare da saggi di carboidrati alde con perdita di alleli funzionali di su 43, che codifica l'ortologa C eleganza della proteina chinasi dipendente da Moulin cal calcio due. Questo video mostra 25 mutanti, che sono carenti nella trasmissione inibitoria GABAergica.

Dopo un'ora di esposizione ad alde carb, simile alla tomasina uno e ai mutanti M 43, questi mutanti dimostrano significative compromissioni locomotorie indotte da alde carb e sembrano essere più colpiti rispetto ai vermi wild type con esposizione ad al Decarb per un periodo di tempo identico. Questo risultato è coerente con i mutanti M 25 che hanno sovrastimolato i muscoli della parete corporea da una combinazione di esposizione ad al Decarb e ridotta trasmissione GABAergica che porta a un maggiore rapporto di trasmissione eccitatoria a inibitoria alle giunzioni neuromuscolari CL ELs e successiva paralisi. Tuttavia, poiché i mutanti di tomasina uno su 43 e su 25 mostrano sensibilità simili ad Al Decarb in questo momento.

Nonostante ci siano diverse cause per la sovrastimolazione dei muscoli della parete corporea, uno sperimentatore non potrebbe conoscere il meccanismo alla base dell'ipersensibilità senza prima conoscere l'identità delle mutazioni causative. Per questo video, siamo tornati agli stessi vermi wild type di un video precedente dopo tre ore di esposizione ad al Decarb in questo punto terminale del nostro test ALD carb, si dovrebbe vedere chiaramente che questi vermi, nonostante siano wild type, sono completamente immobilizzati o si muovono a malapena. Questi vermi sono ora fenotipicamente simili ai mutanti TOM one e M 25 mostrati a un'ora dopo l'esposizione al carboidrato alde, presumibilmente perché la trasmissione colinergica eccitatoria ha raggiunto livelli comparabili in contrasto con i vermi wild type, i mutanti Synap Bren one rimangono considerevolmente mobili a tre ore di esposizione al carboidrato alde.

Questo risultato è coerente con i mutanti Synaptive Bren one, che mancano di livelli normali di secrezione di neurotrasmettitori, avendo meno stimolazione colinergica nei muscoli della parete del corpo rispetto ai vermi di tipo selvatico del legno che seguono livelli identici di esposizione ai carboidrati alde in questo momento. Punto su quattro mutanti, che sono specificamente carenti nella trasmissione colinergica, dovrebbero avere sensibilità simili ad Al Decarb come mutanti Sinaptive Bren uno. Al contrario, i mutanti ipersensibili Tomasin one e O 25 rimangono paralizzati, non diversamente dai vermi wild type.

Vale la pena notare che alcuni vermi, specialmente quelli resistenti all'Al Decarb, possono tentare di strisciare via dal piatto. In questo caso, lo sperimentatore può diffondere una quantità consistente di acido palmitico, una barriera fisica alla locomozione dei vermi. Intorno alle piastre Al Decarb, abbiamo distribuito 25 microlitri di acido palmitico da 10 milligrammi per millilitro di etanolo.

Questo completa il paradigma dell'esposizione all'Al Decarb. Ora, dimostrerò il paradigma di esposizione al Penta Lean Terazol. Kaylin Berry ci aiuterà con i saggi PTZ.

La preparazione dei vermi per i saggi PTZ è essenzialmente la stessa della preparazione dei vermi per i saggi di carboidrati alde. Le uniche differenze significative tra i due test sono le seguenti. Utilizziamo DDH due O come solvente PTZ invece del 70% di etanolo.

Inoltre, poiché spesso piastramo volumi maggiori di PTZ rispetto al carburatore ALDE, lasciamo asciugare le piastre per almeno un'ora prima di aggiungere OP 50. L'acido palmitico può essere utilizzato anche con PTZ. Inoltre, è importante notare che il PTZ è molto meno stabile del carburo alde e deve essere conservato a meno 20 gradi Celsius.

Per iniziare l'analisi, contare il numero di vermi epilettici con convulsioni leggere ogni 30 minuti per un totale di un'ora. È meglio classificare il numero di vermi con diversi tipi di convulsioni in categorie separate, come le convulsioni di tutto il corpo, le convulsioni anteriori, che chiamiamo combinazione di convulsioni anteriori con paralisi muscolare della parete del corpo, che chiamiamo paralisi tonico-clonica o paralisi di tutto il corpo, che chiamiamo tonico tonico. L'attività convulsiva, come si vede con il verme a destra, spesso segue le convulsioni tonico-cloniche, come si vede con il verme sul tono a sinistra.

L'attività simile alle convulsioni potrebbe semplicemente derivare dall'affaticamento muscolare a seguito di convulsioni tonico-cloniche ripetitive. Tuttavia, i nostri dati non pubblicati indicano che alcuni vermi possono diventare tonici con PTZ in modo simile alla paralisi indotta da al decarb senza essere stati precedentemente tonico-clonici. Qui mostriamo un verme mutante a trasmissione sinaptica rappresentativo che striscia in assenza di PTZA antagonista del recettore GABA e induttore di convulsioni comune in vari modelli animali di convulsioni ed epilessia.

Si noti che la punta o il naso del verme oscilla da un lato all'altro durante il foraggiamento. In questo video, mostriamo un altro verme dello stesso ceppo mutante a trasmissione sinaptica utilizzato nel video precedente. Si noti che questo verme, che è in presenza di 2,5 milligrammi di PTZ per millilitro d'acqua, continua per lo più a muovere la testa da un lato all'altro durante il foraggiamento.

Eppure questo verme di tanto in tanto smette di foraggiare da un lato all'altro e spinge invece ripetutamente la sua parte anteriore in avanti. Infine, si dovrebbe vedere un verme che porta la stessa mutazione dei vermi nei due video precedenti in presenza di 10 milligrammi di PTZ per millilitro d'acqua. Si noti che questo verme è diminuito da un lato all'altro e sta spingendo la sua parte anteriore in avanti con una frequenza e un'intensità maggiori rispetto alla minore concentrazione di PTZ.

Questi risultati dimostrano la dipendenza dalla dose di PTZ, che osserviamo con tutti i mutanti a trasmissione sinaptica sensibili a PTZ. È importante sottolineare che l'esposizione al PTZ non è sufficiente per indurre convulsioni epilettiche nei vermi selvatici. Allo stesso modo, abbiamo tentato, ma non osservato, convulsioni epilettiche indotte da PTZ in vermi con deficit specifici nella trasmissione colinergica come su quattro o vermi con eccessiva trasmissione colinergica come la tomasina uno.

Pertanto, dovrebbe essere possibile caratterizzare ulteriormente i mutanti della trasmissione sinaptica con resistenza ai carboidrati alde da deficit nella funzione sinaptica generale o da deficit specifici nella trasmissione colinergica in base alla loro sensibilità relativa alla PTZ. Forse sorprendentemente, una forte riduzione della funzione del mutante ONC 25, che manca di espressione rilevabile di GABA in C elegance. I motoneuroni inibitori non mostrano convulsioni epilettiche spontanee come si vede in questo video.

Un mutante ONC 25 su 10 milligrammi di PTZ per millilitro d'acqua. Tuttavia, presenta robuste convulsioni tonico-cloniche, anche se non mostrate solo convulsioni anteriori con qualche movimento hanno preceduto le convulsioni tonico-cloniche associate a ONC 25 e hanno imitato le convulsioni dei mutanti di synap Bren one. Pertanto, uno sperimentatore non dovrebbe presumere che tutti i mutanti inibitori del GABA mostrino convulsioni tonico-cloniche o attività simile a convulsioni toniche strettamente associate in presenza di PTZ, soprattutto considerando la probabilità di ottenere alleli mutanti ipomorfici.

Ora che abbiamo dimostrato l'ipersensibilità all'alde carb e al PTZ da parte di mutanti inibitori del GABA, ma solo l'ipersensibilità all'alde carb e la normale sensibilità al PTZ da parte di mutanti privi di regolazione negativa della trasmissione colinergica. Ci si potrebbe chiedere come appaiono i mutanti con perdita di funzione UNC 43 su PTZ poiché sono anche ipersensibili al carb Alda come gli altri nostri mutanti a trasmissione sinaptica su 43 mutanti non mostrano evidenti convulsioni epilettiche in assenza di PTZ, sebbene questi mutanti abbiano rare contrazioni non ripetitive, ma comunque spontanee di tutto il corpo ancora dopo l'esposizione a 10 milligrammi di PTZ per millilitro di acqua su 43, I mutanti con perdita di funzione presentano convulsioni corporee complete, robuste, ripetitive e dose-dipendenti. Al momento, questi risultati sono ambigui ma sembrano indicare che l'on 43 non deve avere un ruolo specifico nella trasmissione inibitoria GABAergica o un ruolo solo nella regolazione negativa del rilascio di neurotrasmettitori.

Nel sistema nervoso C elegance, vi abbiamo appena mostrato come caratterizzare i mutanti della trasmissione sinaptica CL elgan con stimolanti neurali complementari, alde carb, un inibitore della colinesterasi e antagonista del recettore GABA PTZA. Quando si segue uno dei due paradigmi farmacologici complementari, ricordare che il grado di sensibilità a uno stimolante neurale non può prevedere il grado di sensibilità all'altro stimolante neurale. L'utilizzo di saggi di carboidrati alde dovrebbe aiutare a distinguere i mutanti inibitori del GABA, che guidano Bob su PTZ, ma sono ipersensibili ai carboidrati Alde dai mutanti con deficit di funzione sinaptica generale, che guidano anche Bob su PTZ, ma sono resistenti al carburatore alde. Inoltre, ci si dovrebbe rendere conto che i mutanti inibitori del GABA guidano Bob su PTZ mentre i vermi che mancano di regolazione negativa della trasmissione colinergica appaiono wild type su PTZ.

Pertanto, il test PTZ potrebbe anche essere impiegato per distinguere tra queste classi di mutanti a trasmissione sinaptica, che sono entrambi ipersensibili al carboidrato Alde. In sintesi, un approccio complementare con saggi di PTZ e carboidrati Alde dovrebbe consentire a uno sperimentatore di caratterizzare i mutanti a trasmissione sinaptica C elegant in un modo impossibile con entrambi i farmaci da soli. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.