Name: Lo screening per aggregazione amiloide di semi-denaturazione detergente-Agarosio elettroforesi su gel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Impara la tecnica SDD-AGE per lo screening di aggregati amiloidei e prioni in campioni su larga scala. Questo metodo biochimico separa polimeri resistenti al SDS usando elettroforesi su gel di agarosio.

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Ringraziamo Simone Alberti per l&#39;assistenza nello sviluppo di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institutes of Health (GM25874), un Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (per SL), e un National Science Foundation predoctoral borsa di formazione (a RH).

<html> Parte 1: Preparazione del gel <ol><li> Montare il vassoio di colata gel. Di serie per elettroforesi DNA orizzontali possono essere utilizzati. Per un gran numero di campioni, ci prepariamo a 20 cm x 24 cm lastra con fino a quattro 50-pettini bene. Assicurarsi che la lastra non ha graffi, come questi possono distorcere l&#39;immagine macchia. </li><li> Creare una soluzione di agarosio 1,5% (media o alta forza di gel, a basso EEO) in TAE 1X. Il volume dovrebbe essere sufficiente per sommergere completamente i denti pettine - si desidera caricare campione il più possibile per massimizzare il rilevamento. Microonde l&#39;impasto fino a quando il agarosio è completamente sciolto. </li><li> Si possono aggiungere rapidamente SDS allo 0,1% da uno stock del 10%. Mescolare. Se alcuni di agarosio si solidifica in questa fase, scioglierla con un piatto caldo e stare attenti per evitare di ebollizione. </li><li> Versare la soluzione nel cassetto casting. Usare un pettine a rastrello eliminare le bolle, come si potrebbe poi interferire con il trasferimento. </li><li> Dopo gel ha stabilito, pettini rimuovere e posizionare il gel nel serbatoio gel. Immergere completamente il gel in TAE 1X contenente 0,1% SDS. </li></ol> Parte 2: Preparazione dei campioni <ol><li> Per high-throughput analisi dei lisati di lievito, si comincia con 2 ml culture cresciute durante la notte con l&#39;agitazione rapida da 96 pozzetti blocchi. In questo caso, ogni cultura è sovraesprimono una proteina di interesse. Quando si analizzano le proteine ​​poco abbondanti, grandi volumi di coltura deve essere utilizzato </li><li> Celle di raccolta per centrifugazione a 2000 RCF per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere le cellule in acqua e centrifugare di nuovo. </li><li> Risospendere in 1 ml di soluzione spheroplasting. Incubare per circa 30 minuti a 30 ° C (si può confermare l&#39;efficienza spheroplasting al microscopio). </li><li> Centrifugare a 800 RCF per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere completamente il surnatante. </li><li> Risospendere sferoplasti pellet in 100 ml di tampone di lisi. </li><li> Coprire il blocco con nastro e vortice ad alta velocità per 2 minuti. </li><li> Pellet residui cellulari a 4000 RCF per 2 minuti. </li><li> Rimuovere con cura il supernatante in un nuovo contenitore, ad esempio, una piastra a 96 pozzetti PCR. </li><li> Se lo si desidera, determinare la concentrazione di proteine ​​del lisati. </li><li> Aggiungi tampone 4X campione per i campioni di generare lisati contenente 1X tampone del campione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Carico gel. Se lo si desidera, salvare la metà del volume del campione e bollire per SDS-PAGE analisi. Al fine di monitorare l&#39;entità del trasferimento in seguito, dotati di un pre-colorato SDS-PAGE marcatore. Inoltre, un marcatore di peso molecolare costituita da proteine ​​molto grandi (ad esempio, pollo pettorale estratto) può essere utilizzato per stimare le dimensioni dei complessi risolto. </li><li> Funzionare a bassa tensione (≤ 3 V / cm lunghezza gel) fino a quando il fronte del colorante raggiunge ~ 1 cm dalla fine del gel. Questo richiederà parecchie ore. E &#39;importante che il gel rimangono fredde, altrimenti la diffusione di proteine ​​a basso peso molecolare (ad esempio, monomeri) possono limitare la loro rilevazione. </li></ol> Parte 3: Trasferimento <ol><li> Tagliare un pezzo di nitrocellulosa per le stesse dimensioni del gel. </li><li> Taglio di 20 pezzi GB004 e GB002 8 pezzi di carta assorbente, per le stesse dimensioni del gel. Tagliare un pezzo aggiuntivo di GB004 per essere usato come uno stoppino, ne fanno circa 20 centimetri più largo del gel. </li><li> Immergere la nitrocellulosa, stoppino, e 4 pezzi di GB002 in TBS 1X. </li><li> In un contenitore di plastica, assemblare una pila di fogli come segue: 20 pezzi di secco GB004, poi 4 pezzi di GB002 secco, poi un pezzo di pre-umido GB002. Stendere la nitrocellulosa in cima a questo stack. </li><li> Sciacquare il gel brevemente sulla barra di colata in acqua per rimuovere l&#39;eccesso tampone di corsa. Poi, con attenzione cominciano a far scorrere il gel fuori dal cassetto nello stack. Facendo scorrere il gel fuori dal cassetto, bagnare la membrana con TBS, se necessario. Il buffer in più aiuta a prevenire le bolle di diventare intrappolato sotto il gel. Una pipetta di trasferimento funziona bene per questo scopo. </li><li> Dopo che il gel è stata spostata la pila, controllare accuratamente per bolle. Se presenti, sollevare il bordo del gel e riapplicare buffer finché le bolle possono essere risolte. </li><li> Mettere i restanti tre pre-bagnate GB002 pezzi sulla parte superiore del gel. Garantire un perfetto contatto tra tutti i livelli facendo rotolare una pipetta saldamente nella parte superiore dello stack. </li><li> Fiancheggiano la pila di trasferimento con due vaschette contenenti TBS. Far passare il pre-stoppino bagnato tutto lo stack in modo tale che entrambe le estremità dello stoppino è immerso in TBS. </li><li> Coprire la pila trasferimento assemblato con un vassoio di plastica ulteriore cuscinetto di peso in più (per esempio, un flacone da 500 ml di acqua). </li><li> Consentire il trasferimento di procedere per un minimo di tre ore, o durante la notte. </li><li> Dopo il trasferimento, la membrana possono essere elaborati da standard di Western blotting. </li></ol> Soluzione Spheroplasting 1,2 M D-sorbitolo 0,5 mM MgCl 2 20 mM Tris, pH 7,5 50 mM BME (aggiungere fresco) 0,5 mg / ml Zymolyase 100T (aggiungere fresco) coration: underline; &quot;&gt; Lysis Buffer 100 mM Tris 7,5 50 mM NaCl 10 mM BME (aggiungere fresco) inibitori della proteasi (aggiungere fresco) Sample Buffer 4X 2X TAE 20% di glicerolo 8% SDS blu di bromofenolo alle preferenze

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
<li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li>
<li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+%28eRF3%29+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li>
<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li>
<li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein%28a%29+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li>
</ol>

SDD-AGE è stato riportato da Kryndushkin et al. 1, per studiare SDS-resistenti complessi del [PSI +] prioni nel lievito, e da allora ha trovato ampio utilizzo studiando sia prioni e non prione aggregati 2-9. Tuttavia, il trasferimento delle proteine ​​ad una elettroforesi membrana a seguito di un gel di agarosio è problematico, e può portare a una immagine distorta macchia 5. Inoltre, la tecnica sommersa elettroblotting più comunemente usato introduce limitazioni pratiche per le dimensioni del gel e quindi il numero di campioni che possono essere elaborati. Abbiamo affrontato questi problemi con l&#39;impiego verso il basso il trasferimento capillare 10, una procedura semplice che utilizza una pila di carta assorbente per asciugare il trasferimento delle proteine ​​dal gel ad una membrana di nitrocellulosa. Trasferimento capillare impedisce la distorsione e permette gel grande per essere elaborati facilmente. Ci sono alcune cose da considerare prima di utilizzare SDD-AGE. Per i campioni grezzi (ad esempio, lisati), immunolocalizzazione di proteine ​​specifiche è necessaria. SDD-AGE non è pienamente denaturare i complessi proteina di interesse, per cui la proteina (s) per essere rilevato deve recare un tag epitopo al di fuori della regione amiloidogenica. Lisati può generalmente essere preparati come lo sarebbero per un normale SDS-PAGE, con due importanti differenze. In primo luogo, una maggiore attenzione deve essere adottate per impedirne la degradazione per proteolisi. Le condizioni di parziale denaturazione usati qui non sono sufficienti a inattivare le proteasi, e possono anche rendere proteine ​​bersaglio più suscettibile alla proteolisi. Utilizzare un completo cocktail inibitore della proteasi in almeno due volte la concentrazione raccomandata. In secondo luogo, il riscaldamento i campioni devono essere evitati. Se un all-monomero controllo negativo è desiderato, per esempio per confermare che alto peso molecolare specie non sono dovuti a modificazioni covalenti, a 10 minuti di incubazione a 95 ° C può essere utilizzato, che consentirà di ripristinare la maggior parte alle proteine ​​amiloidi monomerico.

<table><tbody><tr><td>zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inibitore delle proteasi Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulosa Hybond-C extra</td><td>Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>Carta da trasferimento GB004</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>Carta da trasferimento GB002 (3MM Chr)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio (UltraPure)</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

lo screening per aggregazione amiloide di semi-denaturazione detergente-agarosio elettroforesi su gel

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Aggregazione amiloide è associata a numerose patologie misfolding ed è alla base delle proprietà dei prioni infettivi, che sono conformationally auto-template proteine ​​che si pensa siano ruoli benefico negli organismi inferiori. Amiloidi sono notoriamente difficili da studiare a causa della loro insolubilità ed eterogeneità strutturale. Tuttavia, la risoluzione di polimeri amiloide in base alle dimensioni e insolubilità detergente è stato reso possibile da semi-denaturazione detergente-Agarosio elettroforesi su gel (SDD-AGE). Questa tecnica sta trovando ampio utilizzo per la rilevazione e la caratterizzazione di varianti amiloide conformazionale. Qui, dimostriamo un adattamento di questa tecnica che facilita il suo utilizzo in applicazioni su larga scala, come schermi per i prioni romanzo e altre proteine ​​amiloidogenica. Il nuovo SDD-AGE metodo utilizza trasferimento capillare per una maggiore affidabilità e facilità di utilizzo, e consente a qualsiasi gel dimensionato per essere ospitati. Così, un gran numero di campioni, preparati da cellule o proteine ​​purificate, possono essere trattati simultaneamente per la presenza di SDS-insolubile conformeri di proteine ​​marcate.

SDD-AGE è una tecnica utile per la rilevazione e la caratterizzazione di amiloide-come i polimeri nelle cellule. Qui mostriamo un adattamento che rende questa tecnica suscettibile di applicazioni su larga scala.

Lo screening per aggregazione amiloide di semi-denaturazione detergente-Agarosio elettroforesi su gel

L'aggregazione amiloide è associata a numerose patologie da misfolding proteico e sta alla base delle proprietà infettive dei prioni, che sono...

Ciao, sono Randall Hoffman, studente laureato nel laboratorio di Susan Linus del dipartimento di biologia del MIT. Oggi vi presenterò l'elettroforesi in gel con detergente semi-denaturante, o SDD-AGE. Il nostro laboratorio utilizza questa tecnica per lo screening di prioni e altre proteine alofeniche.La nostra versione dell'età SDD è semplice e affidabile e può essere adattata per analizzare un numero qualsiasi di campioni. Gli amiloidi sono eccezionalmente resistenti alla denaturazione da parte di SDS, il che permette di separarli da altre proteine utilizzando la SDDH. Tuttavia, i dati ottenuti con la SDDH non possono da soli essere utilizzati per confermare che una sostanza sia un amiloide.Per fare ciò, è necessario utilizzare altre tecniche. A tale proposito, permettetemi di mostrarvi. L'S-D-D-H-S-D-D-H può essere eseguita utilizzando apparecchiature standard per l'elettroforesi orizzontale del DNA.Per prima cosa, è necessario assemblare il vassoio per la colatura del gel. Le dimensioni dell'apparecchiatura dipenderanno dal numero di campioni in possesso. Per un elevato numero di campioni, utilizziamo una lastra di 20 per 24 centimetri e fino a quattro pettini da 50 pozzetti.Per preparare il gel, saranno necessari agarosio a bassa EEO con forza di gel media o alta, un buffer 1X TAE e una soluzione stock al 10% di SDS. Preparare una soluzione al 1,5% di agarosio e un buffer 1X TAE. È consigliabile rendere il gel il più spesso possibile per poter caricare la maggior quantità di campione e massimizzare il rilevamento. Riscaldare la miscela al microonde fino a quando l'agarosio si sarà completamente disciolto.Aggiungere rapidamente il 100 XSDS stock allo 0,1% e ruotare per mescolare. Se durante questo passaggio si verifica una solidificazione parziale dell'agarosio, scioglierlo nuovamente su una piastra riscaldata. Fare attenzione a non far bollire la soluzione.Dopo aver aggiunto l'SDS, poiché la soluzione può facilmente schiumare, versare questa soluzione nel vassoio di colata mentre è ancora calda. Quindi utilizzare un pettine per eliminare eventuali bolle d'aria che potrebbero interferire successivamente durante il trasferimento del gel. Una volta che il gel si è completamente raffreddato e solidificato, rimuovere con cura i pettini e posizionare il gel nel serbatoio.Immergere completamente il gel in un XTAE con 0,1% di SDS. A questo punto si è pronti per caricare i campioni. I campioni proteici utilizzati nell'SDDH vengono preparati esattamente come in una SDS-PAGE, con due importanti eccezioni.Prima di tutto, è necessario evitare il riscaldamento dei campioni, che potrebbe denaturare gli aggregati in monomeri proteici. In secondo luogo, prestare attenzione a evitare la degradazione delle proteine. Poiché le condizioni denaturanti utilizzate in questo caso non sono sufficienti ad inattivare tutte le proteasi, si raccomanda di utilizzare almeno il doppio della concentrazione consigliata di un cocktail completo di inibitori delle proteasi.In questa dimostrazione, utilizzeremo lisati di cellule di lievito che sovraesprimono una particolare proteina di interesse. In genere utilizziamo due ml di colture cresciute durante la notte in blocchi da 96 pozzetti disponibili da VWR, ma quando si analizzano proteine a bassa abbondanza, è necessario utilizzare volumi maggiori di coltura.Raccogliere le cellule centrifugando la coltura a 2000 RCF per cinque minuti a temperatura ambiente; dopo la centrifugazione, rimuovere il sopranatante e lavare le cellule risospendendole in acqua e centrifugando nuovamente. Dopo la seconda centrifugazione, rimuovere il sopranatante e risospendere le cellule in soluzione di piastramento fresca. I zy nella soluzione digeriscono le pareti cellulari, consentendo di lisare efficientemente le cellule in un piccolo volume di buffer di lisi. Incubare per 30 minuti a 30 gradi Celsius.Centrifugare le cellule plastiche di riserva a 800 RCF per cinque minuti. Rimuovere completamente il surnatante e risospendere ogni pellet in 100 microlitri di buffer di lisi. Successivamente, coprire il blocco con del nastro e vortexare ad alta velocità per due minuti.Questo consente a tutte le plastiche delle sfere di lisiare i detriti cellulari a 4.000 RCF per due minuti. Trasferire con attenzione il surnatante in una piastra PCR a 96 pozzetti.Normalmente analizziamo centinaia di campioni contemporaneamente nel nostro laboratorio, pertanto ci avvaliamo di un sistema per la manipolazione di liquidi. Se desiderato, determinare la concentrazione proteica dei lisati. Successivamente, aggiungere il buffer campione 4x ai campioni per ottenere lisati contenenti buffer campione 1x e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.Ora caricare i campioni nel gel. Se desiderato, conservare metà dei campioni per l'analisi SDS-PAGE. Inoltre, caricare marcatori del peso molecolare, inclusi marcatori precolorati e un marcatore con peso molecolare molto elevato, come l'estrazione di flettore di pollo.Se lo si desidera, è importante mantenere il gel freddo per evitare la diffusione di proteine a basso peso molecolare; pertanto, si consiglia di eseguire l'elettroforesi in stanza fredda. Far correre il gel a bassa tensione, inferiore a tre volt per centimetro di lunghezza del gel. Eseguire l'elettroforesi per diverse ore fino a quando il fronte colorato raggiunge circa un centimetro dalla fine del gel.Poiché l'amiloide non viene denaturato dal 2% SDS a temperatura ambiente, rimarrà integro mentre altri complessi, inclusa la maggior parte degli aggregati non amiloidi, si dissociano in presenza di 2% SDS. Pertanto, la maggior parte delle proteine sarà monomerica e migrerà rapidamente attraverso il gel, mentre gli amiloidi resistenti all'SDS con alto peso molecolare migreranno più lentamente.Dopo questa fase, il gel sarà pronto per il trasferimento. Sebbene si possano utilizzare diversi metodi di trasferimento, otteniamo i migliori risultati impiegando il trasferimento capillare. Poiché il trasferimento capillare può accogliere gel di qualsiasi dimensione, è pratico analizzare centinaia di campioni mediante trasferimento capillare.Una pila di carte filtranti asciutte serve ad aspirare il tampone attraverso il gel, depositando le proteine su una membrana di nitrocellulosa posizionata tra le carte e il gel. Sarà necessario ritagliare un pezzo di nitrocellulosa, ad esempio high bond C, extra, delle stesse dimensioni del gel. Sarà inoltre necessario ritagliare 20 pezzi di carta filtrante GBO oh four e otto pezzi di carta filtrante GBO oh two delle stesse dimensioni del gel.GB oh quattro è molto spesso e assorbente. Mentre GBO oh due è molto più sottile e ha una trama più fine, il che garantisce un contatto più uniforme con la membrana. Tagliare un pezzo aggiuntivo di GBO oh quattro da utilizzare come stoppino e renderlo largo circa 20 centimetri più del gel immerso.Il nitroso UL WIC e quattro pezzi di GBO oh due e un XTBS in un contenitore di plastica assemblano una pila di fogli nel modo seguente: 20 pezzi di GBO oh quattro secchi. Poi quattro pezzi di GBO oh due secchi. Poi un pezzo di GBO oh due pre-umettato.Posizionare la nitrocellulosa in cima a questo stack. Risciacquare brevemente il gel sul vassoio di polimerizzazione in acqua per rimuovere il tampone di corsa in eccesso. Quindi iniziare con attenzione a far scivolare il gel dal vassoio sullo stack, aggiungendo TBS sul gel mentre lo si fa scivolare dal vassoio sulla membrana, se necessario.Il tampone aggiuntivo aiuta a prevenire che si formino bolle intrappolate nel gel. La pipetta di trasferimento è adatta a questo scopo una volta che il gel è stato completamente spostato sul supporto. Verificare attentamente la presenza di bolle, se presenti.Sollevare il bordo del gel e riapplicare il tampone fino a quando le bolle non vengono eliminate. Posizionare le rimanenti tre pezze di GBO oh due preriscaldate sulla parte superiore del gel. Assicurare un contatto completo tra tutti gli strati arrotolando con fermezza una pipetta sulla superficie del blocco.Posizionare due vassoi rialzati contenenti TBS ai lati della pila di trasferimento, quindi disporre il tampone pre-umettato attraverso la pila in modo che ciascuna estremità del tampone sia immersa nel TBS. Coprire l'intera pila di trasferimento con un ulteriore vassoio di plastica al quale aggiungere un peso aggiuntivo, ad esempio una bottiglia da 500 ml piena d'acqua. Il tampone attingerà il tampone dai vassoi e le carte assorbenti asciutte faranno passare il tampone attraverso il gel nell'arco di diverse ore.Questo farà depositare le proteine sulla membrana; lasciare procedere il trasferimento per almeno tre ore o durante la notte. Al termine del trasferimento capillare, la membrana può essere processata mediante un western blot standard. Qui si osserva una tipica immunoblotting di proteine che sono state sovraespressa in un ceppo di lievito che predispone certe proteine a formare amiloidi.È possibile osservare chiaramente che alcuni dei nostri candidati formano molto bene specie resistenti all'SDS ad alto peso molecolare o ad amiloide, come quelle mostrate qui e qui. Altri, tuttavia, non formano aggregati e sono completamente monomerici, come questi e questi. Inoltre, si può notare che la dimensione dei polimeri amiloidi varia a seconda della proteina, come si vede in queste due bande.Abbiamo appena mostrato un metodo semplice per analizzare aggregati ad alto peso molecolare e insolubili, come gli amiloidi di possibili prioni. Speriamo che la nostra presentazione vi sia piaciuta e che troviate utile questa tecnica per lo studio di proteine immunogeniche di tipo Ami. Grazie per averci seguito e buona fortuna nella vostra ricerca.

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Qui, descriviamo un sistema di lievito che ricostituisce la γ-secretasi umana. Questo sistema consente l'identificazione e lo studio delle mutazioni che influenzano l'attività e lo screening degli inibitori della γ-secretasi (GSI). Utilizzando le proprietà di perdita di funzione dei mutanti familiari della malattia di Alzheimer, è possibile eseguire lo screening per i modulatori della γ-secretasi (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modelli di malattia di Alzheimer per lo screening di geni, mutazioni e sostanze chimiche che influenzano la produzione di amiloide-beta da parte della γ-secretasi

Questo studio delinea metodi sperimentali per caratterizzare biochimicamente il GFAP e le sue mutazioni patogene, concentrandosi sull'assemblaggio, aggregazione e modifica post-traduzionale dei filamenti. Sono state analizzate proteine GFAP ad alta purezza, rivelando intuizioni sui meccanismi della malattia di Alexander che potrebbero fornire un quadro per studiare potenziali bersagli terapeutici e comprendere le mutazioni GFAP e i disturbi correlati.

Approcci sperimentali per l'analisi biochimica della proteina acida fibrillare gliale e delle sue varianti associate alla malattia

Impara la tecnica SDD-AGE per lo screening di aggregati amiloidei e prioni in campioni su larga scala. Questo metodo biochimico separa polimeri resistenti al SDS usando elettroforesi su gel di agarosio.

Lo screening per aggregazione amiloide di semi-denaturazione detergente-Agarosio elettroforesi su gel

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