Lo screening per aggregazione amiloide di semi-denaturazione detergente-Agarosio elettroforesi su gel

Ciao, sono Randall Hoffman, uno studente laureato al Susan Linus Laboratory nel dipartimento di biologia del MIT. Oggi vi presenterò il detergente semi denaturante agro rose, l'elettroforesi su gel o l'età SDD. Il nostro laboratorio utilizza questa tecnica per lo screening dei prioni e di altre proteine alogeniche.

La nostra versione di SDD age è semplice e affidabile e può essere scalata per adattarsi a qualsiasi numero di campioni. Gli amiloidi sono eccezionalmente resistenti alla denaturazione da parte della SDS, che consente loro di essere separati da altre proteine utilizzando la SDDH. Tuttavia, i dati dell'SDDH non possono essere utilizzati di per sé per confermare che qualcosa è amiloide.

Per fare ciò, è necessario utilizzare altre tecniche. Con questo in mente, lascia che te lo mostri. S-D-D-H-S-D-D-H può essere eseguito utilizzando apparecchiature standard per l'elettroforesi orizzontale del DNA.

Innanzitutto, è necessario assemblare il vassoio di colata del gel. Le dimensioni dell'apparecchio dipenderanno dal numero di campioni che hai. Per un gran numero di campioni, utilizziamo una lastra di 20 x 24 centimetri e fino a quattro pettini da 50 pozzetti.

Per preparare il gel, avrai bisogno di una forza di gel media o alta bassa, EEO agros, un tampone XTAE e una soluzione madre al 10% di SDS Make una soluzione AROS all'1,5% e una XTAE. Ti consigliamo di rendere il gel il più denso possibile in modo da poter caricare la maggior parte del campione e massimizzare il rilevamento. Scaldare il composto nel microonde fino a quando l'aros non si sarà completamente sciolto.

Aggiungere rapidamente il materiale 100 XSDS allo 0,1% e agitare per mescolare. Se un po' di agro si solidifica durante questo passaggio, rosso, scioglierlo su una piastra calda. Fate attenzione a non farlo bollire.

Dopo aver aggiunto la SDS poiché la soluzione traboccherà facilmente, versare questa soluzione nel vassoio di colata mentre è ancora caldo. Quindi utilizzare un pettine per eliminare eventuali bolle che potrebbero interferire in seguito durante il trasferimento del gel. Dopo che il gel si è completamente raffreddato e solidificato, rimuovere con cura i pettini e posizionare il gel nel serbatoio.

Immergere completamente il gel in un XTAE con 0,1% di SDS. Ora sei pronto per caricare i tuoi campioni. I campioni di proteine utilizzati in SDDH sono preparati proprio come in una pagina SDS con due importanti eccezioni.

Innanzitutto, si dovrebbe evitare di riscaldare i campioni che potrebbero denaturare gli aggregati in monomeri proteici. In secondo luogo, fai attenzione a evitare la degradazione delle proteine. Poiché le condizioni denaturanti qui utilizzate non sono sufficienti per inattivare tutte le proteasi, si consiglia di utilizzare almeno il doppio della concentrazione raccomandata di un cocktail completo di inibitori della proteasi.

In questa dimostrazione, utilizzeremo lisati provenienti da cellule di lievito che esprimono in eccesso una particolare proteina di interesse. Generalmente usiamo due mil durante la notte. Le colture coltivate in 96 blocchi di pozzetti sono disponibili da VWR, ma quando si analizzano proteine a bassa abbondanza, è necessario utilizzare volumi di coltura maggiori.

Raccogliere le cellule centrifugando la coltura a 2000 RCF per cinque minuti a temperatura ambiente dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare le cellule con Resus sospendendole in acqua e centrifugandole nuovamente dopo la seconda centrifuga, rimuovere il surnatante e resinare le cellule in una soluzione di placcatura di ricambio. Lo zy nella soluzione digerisce le pareti cellulari, il che consentirà di limare le cellule in modo efficiente e un piccolo volume di tampone di lisi. Incubare per 30 minuti a 30 gradi Celsius.

Pellettare le celle di plastica di riserva questa volta a 800 RCF per cinque minuti. Rimuovere completamente il sate e risospendere ogni pellet e 100 microlitri di tampone di lisi. Quindi, coprire il blocco con del nastro adesivo e vorticare ad alta velocità per due minuti.

Questo aiuta tutte le sfere plastiche a LY P fuori dai detriti cellulari a 4.000 RCF. Per due minuti. Trasferire con cura lo S natin in una piastra PCR a 96 pozzetti.

In genere, analizziamo centinaia di campioni alla volta nel nostro laboratorio, quindi per aiutarci in questo è un sistema di manipolazione dei liquidi. Se lo si desidera, determinare la concentrazione proteica dei lisati. Quindi, aggiungere quattro tamponi campione ai campioni per generare lisati contenenti un tampone campione incubato per cinque minuti a temperatura ambiente.

Ora carica i campioni nel gel. Se lo si desidera, salvare metà degli esempi per l'analisi della pagina SDS. Inoltre, caricare i marcatori di peso molecolare, compresi i marcatori prestained e un marcatore di peso molecolare molto elevato come l'estratto di flector di pollo.

Se lo si desidera, è importante mantenere il gel fresco per prevenire la diffusione di proteine a basso peso molecolare, quindi si consiglia di eseguirlo nella cella frigorifera. Far funzionare il gel a bassa tensione a meno di tre volt per centimetro della lunghezza del gel. Far scorrere il gel per diverse ore fino a quando la diare raggiunge circa un centimetro dalla fine del gel.

Poiché l'amiloide non viene denaturata dal 2% di SDS a temperatura ambiente, rimarrà intatta mentre altri complessi, inclusa la maggior parte degli aggregati non amiloidi, si dissociano in presenza del 2% di SDS. Pertanto, la maggior parte delle proteine sarà monomerica e scorrerà rapidamente attraverso il gel. Mentre gli amiloidi ad alto peso molecolare resistenti alla SDS migreranno più lentamente.

Dopodiché, il gel sarà pronto per il trasferimento. Sebbene sia possibile utilizzare più metodi di trasferimento, otteniamo i migliori risultati utilizzando il trasferimento capillare. Poiché il trasferimento capillare può ospitare gel di qualsiasi dimensione, è pratico analizzare centinaia di campioni nel trasferimento capillare.

Una pila di carte assorbenti a secco agisce per disegnare il tampone attraverso il gel che deposita le proteine su una membrana di nitrocellulosa posta tra le carte e il gel. Dovrai tagliare un pezzo di nitrocellulosa, come l'alto legame C, in più delle stesse dimensioni del gel. Dovrai anche tagliare 20 pezzi di GBO oh quattro e otto pezzi di carta assorbente GBO oh due della stessa dimensione del gel.

GB oh four è molto denso e assorbente. Mentre GBO oh two è molto più sottile e ha una consistenza più fine, che garantisce un contatto più uniforme con la membrana. Tagliate un ulteriore pezzo di GBO oh four da utilizzare come stoppino e fatelo largo circa 20 centimetri rispetto al gel immerso.

Il nitroso UL WIC e quattro pezzi di GBO oh due e un XTBS in un contenitore di plastica assemblano una pila di fogli come segue, 20 pezzi di GBO secco oh quattro. Poi quattro pezzi di GBO secco oh due. Poi un pezzo di GBO pre bagnato oh due.

Appoggia la nitrocellulosa sopra questa pila. Sciacquare brevemente il gel sul vassoio di colata in acqua per rimuovere il tampone di scorrimento in eccesso. Quindi iniziare con cautela a far scivolare il gel dal vassoio sulla pila mentre facendo scorrere il gel fuori dal vassoio riempie la membrana con TBS se necessario.

Il tampone extra aiuta a prevenire che le bolle rimangano intrappolate nel gel. La pipetta di trasferimento funziona bene per questo scopo dopo che il gel è stato completamente spostato nella pila. Controllare accuratamente la presenza di bolle, se presenti.

Sollevare il bordo del gel e riapplicare il tampone fino a quando le bolle non possono essere eliminate. Metti i restanti tre pezzi GBO pre-bagnati sopra il gel. Garantire un contatto completo tra tutti gli strati facendo rotolare saldamente una pipetta sulla parte superiore della pila.

Affiancare la pila di trasferimento con due vassoi rialzati contenenti TBS drappeggiare lo stoppino pre-bagnato sulla pila, in modo che entrambe le estremità dello stoppino siano sommerse. In TBS, coprire la pila di trasferimento assemblata con un vassoio di plastica aggiuntivo che sopporta un peso aggiuntivo, come una bottiglia d'acqua da 500 mil. Lo stoppino estrarrà un tampone dai vassoi e le carte assorbenti asciutte attireranno il tampone attraverso il gel nel corso di diverse ore.

Questo depositerà le proteine sulla membrana, consentendo al trasferimento di procedere per un minimo di tre ore o durante la notte. Al termine del trasferimento capillare, la membrana può essere elaborata mediante western blotting standard. Qui si vede un tipico blot di proteine che sono state sovraespresse in un ceppo di lievito che predispone alcune proteine a formare amiloide.

Si può vedere chiaramente che alcuni dei nostri candidati formano molto bene specie resistenti all'amiloide o alla SDS ad alto peso molecolare, come quelle mostrate qui e qui. Altri, invece, non formano aggregati e sono completamente monomerici come questi e questi. Inoltre, puoi vedere che la dimensione dei polimeri amiloidi differisce a seconda della proteina, che puoi vedere in queste due corsie.

Vi abbiamo appena mostrato un metodo semplice per analizzare aggregati insolubili ad alto peso molecolare, come gli amiloidi dei prioni candidati. Ci auguriamo che ti sia piaciuto guardare la nostra presentazione e che questa tecnica ti sia stata utile e che tu abbia studiato le proteine immunogeniche di Amy. Grazie per aver guardato e buona fortuna con la tua ricerca.