Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi
October 27th, 2008
Questo video dimostra a 2 colori montare tutto ibridazione in situ, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale dei 2 geni differenti possono essere visualizzati in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham e David Ish-Horowicz.
Questa procedura inizia con il trattamento con fissazione, metanolo e proteinasi K degli embrioni, seguita da incubazione notturna con sonda a uno diggen o scavo e sonda. Due embrioni di isotiocianato di fluoresceina o ZI vengono incubati con anticorpo dig dopo la reazione cromatica con la fosfatasi alcalina dig. L'attività viene inattivata e gli embrioni vengono incubati.
Con FSE viene eseguita una reazione cromatica con Zi e gli embrioni vengono fissati. Ciao, sono Delphine del laboratorio di Rick Finnel presso il Center for Environmental and Genomic Medicine presso la Texas e m University di Houston. Oggi ti mostreremo la procedura per eseguire l'ibridazione in situ a due coloranti nell'embrione di pollo.
Utilizziamo questa procedura in laboratorio per analizzare gli effetti dei farmaci antiepilettici sui geni gastrici e neurali. Quindi iniziamo Per eseguire l'ibridazione in situ su embrioni di pollo, apri prima un uovo picchiettando il guscio con una pinza e rimuovendo pezzi del guscio. Rimuovere l'albumina densa con una pinza e inclinare la sacca vitellino con una pinza grossa in modo che l'embrione sia rivolto verso l'alto usando le forbici sottili.
Taglia un quadrato di sacco vitellino attorno all'embrione. Togliete l'embrione dal tuorlo con un cucchiaio e mettetelo in un piatto contenente ghiaccio. Freddo dey PBS al microscopio di dissezione Rimuovere con cautela le membrane e il ylk e trasferire l'embrione in un piatto fresco contenente ghiaccio.
Il dey PBS freddo trattiene l'embrione con una pinza e aspira il dey PBS nella cappa aspirante. Sostituiscilo con il 4% di aldeide paraforme in dey PBS e lascia che l'embrione si fissi a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo che gli embrioni sono stati fissati, aspirare la soluzione fissativa e smaltirla correttamente come rifiuto chimico.
Riempi il piatto con dey PBS ghiacciato usando un ago micro capillare con estremità smussata o un coltello da microdissezione per perforare la testa e le cavità cardiache. Per evitare l'intrappolamento della sonda. Mettere gli embrioni in DEP CPBS contenente lo 0,1% tra 20, quindi disidratare gli embrioni in un lavaggio in serie di metanolo per 10 minuti ciascuno in 25%50%75% e 100% di metanolo in PBT.
Ripetere il lavaggio con metanolo al 100%. Gli embrioni possono ora essere conservati a meno 20 gradi Celsius in metanolo. In fiale di vetro scintillante da 20 millilitri.
Per eseguire l'ibridazione in situ, sarà necessario prima reidratare gli embrioni. Per fare questo, lavare gli embrioni per 10 minuti ciascuno in metanolo al 75%50% e 25% in PBT. Infine, lavare due volte per 10 minuti ciascuna.
In PBT, rimuovere la soluzione di PBT dai flaconcini e sostituirla con una soluzione di proteinasi K di cinque microgrammi per millilitro. Tre millilitri per flaconcino. Arrotolare delicatamente il flaconcino per assicurarsi che l'intero contenuto sia esposto alla soluzione di proteinasi K.
Lasciare in soluzione di proteinasi K da uno a cinque minuti a seconda dello stadio dell'embrione. Nel frattempo, preparare una soluzione fissativa ghiacciata utilizzando una pipetta senza RNA, rimuovere la soluzione di proteinasi K e aggiungere due millilitri di soluzione fissativa. Posizionare immediatamente la fiala sul ghiaccio per 20 minuti esatti.
Successivamente, lavare gli embrioni a temperatura ambiente su un mutatore. Eseguire due lavaggi di 10 minuti in PBT seguiti da un lavaggio di 10 minuti in tampone di ibridazione al 50% in PBT. Quindi lavare una volta in tampone di ibridazione al 100%, incubare gli embrioni in due millilitri di tampone di ibridazione per quattro o cinque ore.
A 65 gradi Celsius. Gli embrioni sono ora pronti per essere ibridati con sonde dig e la sintesi della sonda accoppiata fitzy è descritta nel materiale di supporto. La sonda che dovrebbe fornire un segnale forte dovrebbe essere sintetizzata con nucleotidi contenenti FSE, mentre le sonde più deboli dovrebbero essere sintetizzate con nucleotidi contenenti dig
.Pre-avvisare le sonde nel tampone di ibridazione utilizzando una fiala da due millilitri. Rimuovere il tampone di ibridazione dagli embrioni e sostituirlo prontamente con la soluzione della sonda. È importante non lasciare che gli embrioni si secchino e incubino per 16 ore a 65 gradi Celsius.
Dopo la fase di ibridazione della sonda, sostituire la soluzione della sonda con un tampone di ibridazione. Eseguire due lavaggi di 30 minuti a 65 gradi Celsius, quindi lavare per 15 minuti in una miscela uno a uno di ibridazione, tampone e tampone acido maleico di nuovo a 65 gradi Celsius. Dopo questo passaggio, non è più necessario utilizzare condizioni prive di RNA.
Ora sei pronto per eseguire la reazione del colore di scavo seguita dalla reazione del colore Fitz. Per eseguire prima l'ibridazione anticorpale e la reazione cromatica, lavare gli embrioni due volte per 20 minuti ciascuno in tampone di acido maleico. Quindi lavare per un'ora in 2%VBR in tampone di acido maleico.
Infine, osservare per cinque ore nel tampone bloccante Diluire scavare l'anticorpo uno fino a 2000 nel tampone bloccante e incubare gli embrioni in questa soluzione su un mutatore durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo eseguire tre lavaggi di 10 minuti in tampone di acido maleico seguiti da tre lavaggi di un'ora in tampone di acido maleico. Lavare due volte per 20 minuti ciascuna.
In NTMT aggiungere 200 microlitri di substrato N-B-T-B-C-I-P a 10 millilitri. NTMT rimuovere immediatamente NTMT dalla fiala con l'embrione e sostituirlo con uno o due millilitri. Posto tampone N-B-T-B-C-I-P al buio.
Monitorare la reazione del colore dopo 20 minuti e successivamente a intervalli di 20 minuti. Quando il colore blu si è sviluppato in modo appropriato, lavare gli embrioni in PBS per 10 minuti. Quindi sostituire il PBS con il 4% di aldeide paraforme in PBS.
Fissare durante la notte a quattro gradi Celsius. Trasferire l'embrione in un nuovo flaconcino di installazione syn in PBT due volte per 10 minuti ciascuno, seguito da due lavaggi di 10 minuti in tampone di acido maleico. Incubare gli embrioni in tampone di acido maleico per 30 minuti a 65 gradi Celsius.
Ora è il momento di eseguire la seconda incubazione degli anticorpi e la reazione cromatica. Per rilevare la nostra sonda marcata con il secondo attacco, lavare gli embrioni due volte per 10 minuti ciascuno in tampone di acido maleico. Un'ora in BBR al 2% in tampone acido maleico.
E poi cinque ore in tampone bloccante, diluire l'anticorpo anti-FTSE accoppiato alla fosfatasi alcalina da uno a 500 in tampone bloccante e incubare gli embrioni in questa soluzione durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina successiva ho eseguito tre lavaggi di 10 minuti in tampone di acido maleico seguiti da tre lavaggi di un'ora in tampone di acido maleico. Quindi, lavare due volte per 20 minuti ciascuna.
In Tris HCL, preparare cinque millilitri di soluzione di lavoro rossa vettoriale in tris HCL secondo il protocollo del produttore. Rimuovere immediatamente il triss HCL dal flaconcino e sostituirlo con il tampone rosso vettoriale. Posizionare le fiale al buio.
Monitorare la reazione del colore dopo 30 minuti e successivamente a intervalli di 30 minuti, dopo che il colore rosso si è sviluppato, trasferire gli embrioni in PBS. Finalmente sei pronto per fissare e processare gli embrioni. Trasferirli in una capsula di fissaggio contenente il 4% di paraforma, aldeide e fissare per 20 minuti a temperatura ambiente o per una notte a quattro gradi Celsius.
Lavare due volte in PBS 10 minuti per lavaggio per lavorare per la fotografia. Trasferire gli embrioni al 20% di glicerolo in PBS. Questo renderà gli embrioni traslucidi da elaborare per il sezionamento della cera.
Trasferire gli embrioni in PBS, lavare due volte per 10 minuti ciascuno, disidratare in una serie di metanolo per 10 minuti ciascuno, sostituire il metanolo con propanolo e incubare per tre minuti. Rimuovere il propanolo e sostituirlo con 1 2 3 4 tetra hydro nap filine per 20 minuti, seguito da isto, due lavaggi di un'ora ciascuno. Sostituire con una miscela uno a uno di histo clear e cera e incubare a 60 gradi Celsius per un'ora.
Sostituire questa soluzione con cera e procedere per l'istologia. Questo embrione è etichettato con un digo ossigeno in calze, due sonde in blu e una sonda delta fitzy che appare in rosso. La prima reazione cromatica rivela il modello di espressione dei calzini. Due.
Un marcatore per la piastra neurale sviluppato nel laboratorio del Dr.Robin level badge sox due cellule positive appaiono blu dopo la reazione con N-B-T-B-C-I-P. Lo stesso embrione viene quindi processato per la seconda reazione cromatica, che rivela il modello di espressione del delta uno. Un marcatore per la piastra segmentale sviluppato nel laboratorio del Dr.Domingo Enrique Delta one le cellule positive appaiono rosse, a seguito della reazione con il vettore rosso.
Questo embrione è etichettato con una sonda digo in PAC six in blu e una sonda SHH fitzy in rosso. La prima reazione cromatica rivela il modello di espressione di PAC sei, un marcatore per le pieghe neurali e i somiti in via di sviluppo sviluppato nel laboratorio del Dr.Martin Goulding Pac. Sei cellule positive appaiono blu dopo la reazione con N-B-T-B-C-I-P.
La seconda reazione cromatica rivela il modello di espressione del marcatore SHHA per il Noor e la linea mediana ventrale del tubo neurale sviluppato nel laboratorio del Dr.Cliff Tabban. Le cellule SHH positive appaiono rosse, in seguito alla reazione con il vettore rosso. Ti abbiamo appena mostrato come eseguire la colorazione e l'ibridazione nel pollo ry.
Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare soluzioni trattate con profondità C, autoclave, pfas e vi sterile. Al fine di ridurre al minimo il contatto con gli RNA è nei passaggi da tre a cinque. Quindi questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo video dimostra l'ibridizzazione in situ a 2 colori su intero, una tecnica per visualizzare i modelli di espressione spaziale e temporale di due geni diversi in embrioni di pulcino giovani. La procedura prevede la fissazione, il trattamento con metanolo e proteinasi K e l'incubazione con sonde specifiche.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Espressione genica
Contesto
- L'ibridizzazione in situ su intero permette la visualizzazione dell'espressione genica negli embrioni.
- Questo metodo è stato originariamente introdotto da noti ricercatori nel campo.
- Comprendere i modelli di espressione genica è cruciale per gli studi di biologia dello sviluppo.
- Gli embrioni di pulcino servono come organismo modello per tali studi.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare i modelli di espressione di due geni simultaneamente.
- Fornire una metodologia dettagliata per i ricercatori nel campo.
- Migliorare la comprensione delle interazioni geniche durante lo sviluppo embrionale.
Metodi utilizzati
- Fissazione degli embrioni di pulcino.
- Trattamento con metanolo e proteinasi K.
- Incubazione con sonde marcate con digossigenina.
- Reazione a colori con anticorpi per la visualizzazione.
Principali risultati
- Viabilizzazione di successo dei modelli di espressione genica negli embrioni.
- Dimostrazione dell'efficacia del metodo a 2 colori.
- Chiara differenziazione delle posizioni di espressione genica.
- Possibili applicazioni nella ricerca sulla biologia dello sviluppo.
Conclusioni
- L'ibridizzazione in situ su intero a 2 colori è una tecnica preziosa.
- Questo metodo può essere applicato a vari studi sull'espressione genica.
- Ulteriori ricerche possono espandere le sue applicazioni negli studi sullo sviluppo.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables simultaneous visualization of two gene expression patterns in chick embryos, supporting mechanistic de-risking in early target validation. By providing spatial and temporal resolution of gene co-expression, it enhances predictive confidence in pathway analysis during discovery biology. The approach is particularly relevant for neurodevelopmental and cardiovascular target interrogation where embryonic models inform translational relevance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing co-expression patterns of signaling molecules and transcription factors in developing tissues.
- Operational Value: Enables functional target validation through spatial mapping of gene activity in neural tube, somite, and heart primordia.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying mechanistic relationships between genes involved in developmental pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Quantitative Output: Generates spatially resolved, colorimetric readouts enabling comparison of gene expression across experimental conditions.
- Reproducibility: Standardized fixation and hybridization steps support assay standardization across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects embryonic gene expression to postnatal pathophysiology in neurodevelopmental and cardiac disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical models by validating target expression in disease-relevant systems.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming target engagement in developing tissues prior to mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, supporting hypothesis testing and pathway clarification before lead identification efforts.
- Discovery Biology: Enables mechanistic de-risking by visualizing gene co-expression in developing embryos, clarifying functional relationships between targets.
- Screening: Generates spatially resolved expression data that can inform assay design for compound screening in relevant tissues.
- Analytics: Produces dual-colorimetric readouts allowing quantitative comparison of gene expression patterns under different conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by confirming expression of developmental markers in tissues relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for validating multiple gene targets across developmental timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by revealing spatial relationships between co-expressed genes in developing tissues.
- Operational Value: Standardized protocol ensures reproducibility across laboratories and experimental batches.
- Strategic Value: Improves target selection confidence, reducing late-stage failure due to incorrect mechanistic assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated expression in disease-relevant embryonic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological dissection and molecular hybridization techniques.
- Dependent on access to dissection microscopes, hybridization ovens, and colorimetric detection systems.
- Necessitates standardization of probe synthesis and antibody titration across users.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of fixation and permeabilization steps.
- Practical limitations include embryo availability, stage-specific permeability, and signal multiplexing constraints beyond two colors.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:49
Introduction
1:16
Fixing and Dehydrating the Embryos
3:28
Prehybridzation
5:15
Hybridizing Embryos with DIG- and FITC- Coupled Probes
6:41
DIG Antibody Incubation and Color Reaction
9:40
FITC Antibody Incubation and Color Reaction
11:52
Fixation and Processing
13:34
Results
15:08
Conclusion
