Reaggregate Culture Thymus

Ciao, sono Andrea White e vengo dal laboratorio di Graham Anderson ed Eric Jenkinson presso l'MRC Center for Immune Regulation dell'Università di Birmingham. Oggi presento un protocollo per derivare colture di organi timici riaggregati, che può essere utilizzato per studiare le complesse interazioni cellulari che si verificano durante il differenziamento delle cellule T. Prima dell'inizio di questa procedura, i lobi del timo embrionale sono stati isolati e trattati per rimuovere tutti i linfociti.

Questo può essere visto in un video separato. I lobi alienoidi vengono quindi disaggregati per produrre una preparazione di cellule stromali. E infine, le cellule vengono aggregate per formare una coltura di organi fmici riaggregati.

Cominciamo. Dopo cinque-sette giorni di coltura, il LO dovrebbe essere pronto per la disaggregazione per le preparazioni di cellule di banchi Immergere i filtri da 0,8 micrometri in una capsula di Petri contenente RPMI 1640 più il 10% di FCS Utilizzando una pinza, spingere delicatamente i pendii delle fibre che non galleggiano. Usa un mil per animale domestico per trasferire i lobi in un tubo orph da 1,5 mil.

Si consiglia di non utilizzare più di 50 lobi per tubo di orph. Lasciare che i lobi si depositino sul fondo del tubo sotto l'unità di gravità e rimuovere il fluido. Lavare i lobi con un mil di PBS e poi lasciare che i lobi affondino di nuovo sul fondo.

Ripetere l'operazione per un totale di tre lavaggi PBS, rimuovere l'ultimo lavaggio PBS e aggiungere 600 microlitri di soluzione allo 0,25%. Posizionare la provetta einor in un'incubatrice a 37 gradi per 25 minuti. Tritrare delicatamente i lobi usando una punta blu da un mil su un perpet per 10 secondi, quindi rimetterli nell'incubatrice dopo 20 minuti, pipettare i lobi su e giù per disaggregarli completamente.

Dovrebbero essere necessari circa 30 secondi per ottenere una sospensione a singola cella, aggiungere 400 microlitri ghiacciati, RPMI 1640 più 10% FCS per neutralizzare la tripsina imp pellet le celle mediante centrifugazione a mille giri/min, 10 minuti a quattro gradi C, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un mil. RPMI 1640 più 10% FCS se lo si desidera. Conta le cellule.

In genere ci aspetteremmo circa 50.000 cellule per lobo di diossazina, a partire da un E 15 fibroso. Ora siamo pronti per formare le colture di Corgan fmic aggregate in un tubo orph da un milione e mezzo. Cellule stromali fini miste e preparate al momento.

Insieme a CD preselezionati, quattro CD positivi, otto fibrociti positivi. Raccomandiamo un rapporto circa uno a uno tra cellule stromali e fibrociti. Il numero di celle che utilizzerai dipenderà dal numero di celle disponibili e dagli esperimenti da eseguire.

Si consiglia un totale di almeno centomila celle e non più di 1,5 milioni di cellule. Si desidera che gli aggregati V siano abbastanza grandi da essere riproducibili, ma non così grandi da far morire le celle di pellet al centro mediante centrifugazione a mille giri/min per 10 minuti. A quattro gradi C, assemblare con cura il filtro per coltura d'organo.

Rimuovere tutto un nativo SUP in fase con un P 200 per animale. La cella a vortice pelletta per 10 secondi per formare un impasto. Il volume dovrebbe essere di circa uno o due microlitri bocca.

Accarezza il liquame in un animale domestico finemente disegnato, mantenendo la sospensione delle cellule sulla punta dell'animale. Sotto il nostro microscopio da dissezione, imboccare con cura il PET il liquame cellulare al centro di un filtro da 0,8 micrometri. Idealmente, le cellule dovrebbero essere posizionate come una goccia in piedi in un cerchio di uno o due millimetri di diametro.

Se il liquame inizia a diffondersi, lasciare che il fluido nel liquame defluisca attraverso il pos prima di depositare le celle rimanenti. Mettere il piatto in una scatola di plastica per sandwich e sigillare. Per quanto riguarda le colture di organi del timo e il posizionamento di una scatola in un'incubatrice, aggreghiamo le colture in strutture intatte entro 18 ore dalla coltura.

Dopo quattro o cinque giorni di coltura, genereranno sia quattro sottogruppi di citi maturi positivi che CD quattro negativi otto positivi. Iniziare con 50 lobi trattati con diossazina dovrebbe fornire abbastanza cellule stromali per preparare da tre a cinque colture riaggregate. Queste colture appaiono tipicamente come cumuli coerenti di cellule che possono essere spinte via dai filtri usando una pinza senza interromperli.

Abbiamo appena descritto il metodo con cui studiare la selezione positiva da parte delle cellule epiteliali F. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare la selezione negativa mediata da cellule dendritiche. Infine, utilizzando FIBROCITI transgenici TCR o cellule stromali MHC di classe uno o MHC classe due.

Questo sistema consente indagini separate sulla selezione delle cellule T CD quattro positive o CD otto positive. Grazie per esserti sintonizzato.