Reaggregate Culture Thymus

Ciao, sono Andrea White e lavoro nel laboratorio di Graham Anderson ed Eric Jenkinson presso il MRC Center for Immune Regulation dell'Università di Birmingham. Oggi presento un protocollo per ottenere colture organotipiche del timo mediante aggregati ripristinati, che possono essere utilizzate per studiare le complesse interazioni cellulari che avvengono durante la differenziazione dei linfociti T. Prima dell'inizio di questa procedura, i lobi timici embrionali sono stati isolati e trattati per rimuovere tutti i linfociti.

Questo può essere osservato in un video separato. I lobi alienoidi vengono quindi disgregati per produrre una preparazione di cellule stromali. Infine, le cellule vengono aggregate per formare una coltura organica di organoidi ricostituiti.

Iniziamo. Dopo cinque a sette giorni di coltura, l'LO dovrebbe essere pronto per essere disgregato al fine di preparare cellule in sospensione. Immergere i filtri da 0,8 micrometri in una piastra di Petri contenente RPMI 1640 più FCS al 10%. Utilizzando pinzette, spingere delicatamente le pendenze di fibra che non galleggiano via. Utilizzare una pipetta da 1 ml per trasferire i lobi in una provetta Eppendorf da 1,5 ml.

Si consiglia di non utilizzare più di 50 lobi per provetta eend orph. Lasciare sedimentare i lobi sul fondo della provetta per gravità unitaria e rimuovere il mezzo. Lavare i lobi con un millilitro di PBS e quindi lasciare nuovamente affondare i lobi sul fondo.

Ripetere questo procedimento per un totale di tre lavaggi con PBS, rimuovere l'ultimo lavaggio con PBS e aggiungere 600 microlitri di una soluzione al 0,25% di tripsina. Collocare il tubo eppendorf in un incubatore a 37 gradi per 25 minuti. Triturare delicatamente i lobi utilizzando una punta blu da 1 ml su una pipetta per 10 secondi, quindi reinserire in incubatore; dopo 20 minuti, pipettare i lobi su e giù per disgregarli completamente.

Per ottenere una sospensione monocellulare, dovrebbero essere necessari circa 30 secondi. Aggiungere 400 microlitri di RPMI 1640 freddo di ghiaccio, contenente il 10% di FCS, per neutralizzare la tripsina. Impellettare le cellule mediante centrifugazione a 1000 giri al minuto per 10 minuti a 4 gradi C. Rimuovere il sopranatante e risospendere il pellet in 1 ml di RPMI 1640 contenente il 10% di FCS, se desiderato. Contare le cellule.

Normalmente ci aspettiamo circa 50.000 cellule per lobo di dioxazina, partendo da un fegato fibroso di E15. Ora siamo pronti a formare le colture aggregate di fmic Corgan in un tubo orf da una volta e mezza. Cellule stromali fini, miste e appena preparate.

Insieme a fibrociti CD4 positivi e CD8 positivi preselezionati. Si raccomanda un rapporto di circa uno a uno tra cellule stromali e fibrociti. Il numero di cellule da utilizzare dipenderà dal numero di cellule disponibili e dagli esperimenti da eseguire.

Si consiglia un numero totale di cellule compreso tra almeno centomila e non più di un milione e mezzo. È necessario che gli aggregati di V siano abbastanza grandi da essere riproducibili, ma non così grandi che il centro muoia. Raccogliere le cellule in pellet mediante centrifugazione a mille giri al minuto per 10 minuti. A quattro gradi C, assemblare con attenzione il filtro per coltura organotipica.

Rimuovere tutta la supernatante in fase con una P200 per piatto. Vortexare il pellet cellulare per 10 secondi per formare una sospensione. Il volume dovrebbe essere di circa uno-due microlitri.

Trasferire la sospensione in una pipetta finemente affusolata, mantenendo la sospensione cellulare alla punta della pipetta. Sotto il microscopio stereoscopico, trasferire con attenzione mediante pipetta boccale la sospensione cellulare al centro di un filtro da 0,8 micrometri. Idealmente, le cellule dovrebbero essere depositate sotto forma di una goccia in piedi, disposta in un cerchio dal diametro di uno-due millimetri.

Se la sospensione inizia a diffondersi, lasciare drenare il liquido attraverso il pos prima di depositare le cellule rimanenti. Posizionare la piastra in un contenitore di plastica ermetico e sigillare. Per colture organotipiche del timo, collocare il contenitore in un incubatore: le colture aggregate si organizzano in strutture integre entro 18 ore dalla semina.

Dopo quattro o cinque giorni di coltura, genereranno sia sottoinsiemi maturi CD quattro positivi otto negativi che CD quattro negativi otto positivi. Partendo da 50 lobi trattati con dioxazina, si dovrebbe ottenere un numero sufficiente di cellule stromali per preparare da tre a cinque colture di riaggregazione. Queste colture appaiono tipicamente come mucchietti coerenti di cellule che possono essere staccati dai filtri usando pinzette senza alterarli.

Abbiamo appena descritto il metodo per studiare la selezione positiva da parte delle cellule epiteliali F. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare la selezione negativa mediata dalle cellule dendritiche. Infine, utilizzando cellule fibrocitiche transgeniche per il TCR o cellule stromali carenti di MHC Classe I o MHC Classe II.

Questo sistema consente indagini distinte sulla selezione dei linfociti T positivi per CD4 o positivi per CD8. Grazie per aver seguito.