Name: Reaggregate Culture Thymus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Scopri la preparazione di colture di timo riaggregato con 2-dGuo per studiare la differenziazione delle cellule T. Questo metodo permette di esaminare le interazioni cellulari in un ambiente controllato.

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Per ulteriori informazioni sulla preparazione reggregate culture timo si prega di visitare <a href="http://www.springerprotocols.com/">protocolli Springer</a> .

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

reaggregate culture thymus

Reaggregate Thymus Cultures

Nel timo, immaturi CD4 +8 + timociti che esprimono in modo casuale riarrangiati cellule T recettori α-e b-catena di geni sottoposti a selezione di eventi positivi e negativi in ​​base alla loro capacità di riconoscere self-peptide/major complessi di istocompatibilità (MHC) molecole espressa dal timo cellule stromali. L&#39;analisi in vivo del ruolo di cellule stromali del timo durante la selezione intratimica è resa difficile dalla complessità cellulare del microambiente timico in steady-state timo adulto, e dalla mancanza di adeguate strategie di targeting per manipolare l&#39;espressione genica, in particolare, comparti timica stromale. Abbiamo dimostrato che il microambiente timica può essere facilmente manipolate in vitro tramite l&#39;uso di reaggregate culture organo del timo, che permettono la preparazione di lobi timo tridimensionale definito da cellule stromali e linfoidi. Anche se gli altri sistemi in vitro supportano alcuni aspetti di cellule T sviluppo, reaggregate coltura d&#39;organo thymus rimane l&#39;unico sistema in vitro in grado di supportare efficienti MHC di classe I e II-mediata eventi di selezione timocita, e quindi può essere utilizzato come uno strumento efficace per lo studio la regolazione cellulare e molecolare di selezione positiva e negativa nel timo.

In questo video la preparazione di 2-dGuo trattati reaggregate culture timo è dimostrata.

Reaggregate Culture Thymus

Le cellule stromali all'interno dei tessuti linfoidi sono organizzate in strutture tridimensionali che forniscono un'impalcatura ritenuta in grado di controllare la migrazione e...

Ciao, sono Andrea White e lavoro nel laboratorio di Graham Anderson ed Eric Jenkinson presso il MRC Center for Immune Regulation dell'Università di Birmingham. Oggi presento un protocollo per ottenere colture organotipiche timiche ricostituite, che possono essere utilizzate per studiare le complesse interazioni cellulari che avvengono durante la differenziazione dei linfociti T. Prima dell'inizio di questa procedura, i lobi timici embrionali sono stati isolati e trattati per rimuovere tutti i linfociti.Questo può essere osservato in un video separato. I lobi alienoidi vengono quindi disgregati per produrre una preparazione di cellule stromali. Infine, le cellule vengono aggregate per formare una coltura organica di organo fmic ricostituito.Iniziamo. Dopo cinque o sette giorni di coltura, l'LO dovrebbe essere pronto per essere dissociato per preparare cellule in sospensione. Immergere i filtri da 0,8 micrometri in una piastra di Petri contenente RPMI 1640 più 10% di FCS. Utilizzando pinzette, spingere delicatamente le falde fibrose che non si staccano da sole. Usare una pipetta da 1 ml per trasferire le lobi in un tubo Eppendorf da 1,5 ml.Si consiglia di non utilizzare più di 50 lobi per provetta eend orph. Lasciare sedimentare i lobi sul fondo della provetta mediante gravità unitaria ed eliminare il mezzo. Lavare i lobi con un millilitro di PBS e quindi lasciare nuovamente affondare i lobi sul fondo.Ripetere questo per un totale di tre lavaggi con PBS, rimuovere l'ultimo lavaggio con PBS e aggiungere 600 microlitri di una soluzione al 0,25% di tripsina. Collocare il tubo Eppendorf in un incubatore a 37 gradi per 25 minuti. Triturare delicatamente i lobi utilizzando una punta blu da 1 ml su una pipetta per 10 secondi, quindi rimettere in incubazione; dopo 20 minuti, pipettare i lobi su e giù per disgregarli completamente.Per ottenere una sospensione monocellulare, dovrebbero essere necessari circa 30 secondi. Aggiungere 400 microlitri di RPMI 1640 freddo di ghiaccio, contenente il 10% di FCS, per neutralizzare la tripsina; centrifugare le cellule a mille giri al minuto per 10 minuti a quattro gradi C, rimuovere il sopranatante e risospendere il pellet in un millilitro di RPMI 1640 contenente il 10% di FCS, se desiderato. Contare le cellule.Normalmente ci aspettiamo circa 50.000 cellule per lobo di dioxazina, partendo da un fegato fibroso di E15. Ora siamo pronti a formare gli aggregati per colture organotipiche di fmic in un tubo orf di una volta e mezza. Cellule stromali fini, miste, appena preparate.Insieme a fibrociti CD4 positivi e CD8 positivi preselezionati. Si raccomanda un rapporto di circa uno a uno tra cellule stromali e fibrociti. Il numero di cellule da utilizzare dipenderà dal numero di cellule disponibili e dagli esperimenti da eseguire.Si consiglia un numero complessivo di cellule di almeno centomila e non superiore a un milione e mezzo. È necessario che gli aggregati di tipo V siano abbastanza grandi da essere riproducibili, ma non così grandi che il centro muoia. Raccogliere le cellule in pellet mediante centrifugazione a mille giri al minuto per 10 minuti. A quattro gradi C, assemblare con attenzione il filtro per coltura organotipica.Rimuovere tutta la supernatante in fase con una P200 per ogni provetta. Vortexare il pellet cellulare per 10 secondi fino a formare una sospensione. Il volume dovrebbe aggirarsi tra uno e due microlitri.Deporre la sospensione in una punta finemente affilata, mantenendo la sospensione cellulare alla punta della pipetta. Sotto il microscopio stereoscopico, deporre con attenzione la sospensione cellulare al centro di un filtro da 0,8 micrometri. Idealmente, le cellule dovrebbero essere posizionate sotto forma di una goccia in piedi, formando un cerchio dal diametro di uno-due millimetri.Se la sospensione inizia a diffondersi, lasciare drenare il liquido attraverso il pos prima di depositare le cellule rimanenti. Posizionare la piastra in un contenitore ermetico in plastica e sigillare. Per quanto riguarda le colture organotipiche del timo, collocare un contenitore in un incubatore: le colture aggregate si organizzano in strutture integre entro 18 ore dalla coltura.Dopo quattro o cinque giorni di coltura, genereranno sia sottoinsiemi maturi CD quattro positivi otto negativi che CD quattro negativi otto positivi. Partendo da 50 lobi trattati con dioxazina, si dovrebbe ottenere un numero sufficiente di cellule stromali per preparare da tre a cinque colture di riaggregazione. Queste colture appaiono tipicamente come mucchietti coerenti di cellule che possono essere spostati dai filtri usando pinzette senza danneggiarli.Abbiamo appena descritto il metodo per studiare la selezione positiva da parte di cellule epiteliali F. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare la selezione negativa mediata da cellule dendritiche. Infine, utilizzando cellule fibrocitiche transgeniche per il TCR o cellule stromali carenti di MHC Classe I o MHC Classe II.Questo sistema consente indagini distinte sulla selezione dei linfociti T positivi per CD4 o positivi per CD8. Grazie per averci seguito.

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Questo video dimostra la dissezione e la rimozione del timo del feto e la preparazione delle colture ex vivo di 2-dGuo trattati con timo.

La preparazione di 2-dGuo-trattati Organ Culture Timo

Questo video mostra un protocollo per la generazione di cellule T funzionali antigene-specifiche da cellule T immature derivate da iPSC utilizzando un sistema di coltura timica tridimensionale. La co-coltura delle cellule T immature derivate da iPSC con lobi timici fetali di topi endogeni depleti di linfociti ha portato alla maturazione delle cellule T per formare emigranti timici derivati da iPSC CD8αβ+ MHC di classe I+ iPSC.

Sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigranti timici derivati da iPSC

Dettagli Questo protocollo un metodo per isolare le cellule presentanti l'antigene da timo umano attraverso diverse fasi di digestione enzimatica del tessuto seguita dalla densità centrifugazione della sospensione di cellule singole e smistamento finalmente magnetico e / o FACS delle popolazioni cellulari di interesse.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

Qui si descrive un metodo efficace per l'isolamento, l'identificazione e la purificazione delle cellule epiteliali del timo topo (TEC). Il protocollo può essere utilizzato per gli studi di funzione del timo per il normale sviluppo delle cellule T, la disfunzione del timo, e la ricostituzione delle cellule T.

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

Lo studio delle cellule epiteliali midollari del timo in vitro è stato in gran parte infruttuoso, poiché gli attuali sistemi di coltura 2D non imitano lo scenario in vivo. Il sistema di coltura 3D qui descritto - un modello di coltura organotipica della pelle modificata - si è dimostrato superiore nella ricapitolazione della proliferazione, della differenziazione e del mantenimento dell'espressione genica promiscua di mTEC.

3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

Questo articolo descrive la metodologia in vivo e in vitro per caratterizzare i progenitori di sedimentazione timica mediante l'analisi della cinetica di generazione, fenotipo e numero della loro progenie di cellule T.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Questo video dimostra un protocollo per arricchire le cellule epiteliali timiche (TEC) con gradiente di densità per l'isolamento FACS. Mostra anche l'uso di peptidi EAK16-II/EAKIIH6 per promuovere la formazione di aggregati TEC. I microambienti dell'idrogel EAK16-II/EAKIIH6 forniscono la configurazione 3D necessaria per mantenere la sopravvivenza e la funzione dei TEC.

La promozione 3-D di aggregazione delle cellule FACS purificata timica epiteliali con EAK 16-II / EAKIIH6 autoassemblanti idrogel

Descriviamo la preparazione di fette timici che, in combinazione con la citometria di flusso, possono essere utilizzate per modellare selezione positiva e negativa di sviluppare cellule T. Fette timo possono anche essere adattati per l'analisi in situ della migrazione thymocyte, localizzazione, e la segnalazione tramite immunofluorescenza e microscopia a due fotoni.

Preparazione e applicazioni di colture organotipiche timica Slice

Questo articolo descrive un nuovo metodo per generare emigranti timici (iTE) derivati da cellule staminali specifiche dell'antigene tumorale del tumore da un sistema di coltura timica tridimensionale (3D). ITE sono un sottoinsieme omogeneo di cellule T strettamente correlate alle cellule T ingenue con la capacità di proliferazione, formazione della memoria, e la soppressione del tumore.

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

Questo protocollo descrive l'isolamento dei timociti doppi negativi dal timo di topo seguito da trasduzione retrovirale e co-coltura sul sistema di co-coltura della linea cellulare stromale del midollo osseo a 4 esprimenti delta (OP9-DL4) per ulteriori analisi funzionali.

Co-coltura e trasduzione di timociti murini su cellule stromali esprimenti delta-like 4 per studiare oncogeni nella leucemia a cellule T

Qui, descriviamo un protocollo per la formazione di organoidi di timo derivati da iPSC umane cresciuti in idrogel di fibrina 3D con l'obiettivo di supportare la maturazione delle cellule epiteliali timiche (TEC) e il mantenimento prolungato, nonché la timopoiesi in vitro.

Formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali

Scopri la preparazione di colture di timo riaggregato con 2-dGuo per studiare la differenziazione delle cellule T. Questo metodo permette di esaminare le interazioni cellulari in un ambiente controllato.

Reaggregate Culture Thymus

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