Name: La preparazione di 2-dGuo-trattati Organ Culture Timo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Impara a preparare colture di organi timici fetali trattati con 2-dGuo per studiare lo sviluppo delle cellule T. Questa tecnica consente di analizzare le interazioni stromali in vitro.

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Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
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In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

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Erratum: Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

la preparazione di 2-dguo-trattati organ culture timo

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

Nel timo, immaturi CD4 +8 + timociti che esprimono in modo casuale riarrangiati cellule T recettori α-e b-catena di geni sottoposti a selezione di eventi positivi e negativi in ​​base alla loro capacità di riconoscere self-peptide/major complessi di istocompatibilità (MHC) molecole espressa dal timo cellule stromali. L&#39;analisi in vivo del ruolo di cellule stromali del timo durante la selezione intratimica è resa difficile dalla complessità cellulare del microambiente timico in steady-state timo adulto, e dalla mancanza di adeguate strategie di targeting per manipolare l&#39;espressione genica, in particolare, comparti timica stromale. Abbiamo dimostrato che il microambiente timica può essere facilmente manipolate in vitro tramite l&#39;uso di reaggregate culture organo del timo, che permettono la preparazione di lobi timo tridimensionale definito da cellule stromali e linfoidi. Anche se gli altri sistemi in vitro supportano alcuni aspetti di cellule T sviluppo, reaggregate coltura d&#39;organo thymus rimane l&#39;unico sistema in vitro in grado di supportare efficienti MHC di classe I e II-mediata eventi di selezione timocita, e quindi può essere utilizzato come uno strumento efficace per lo studio la regolazione cellulare e molecolare di selezione positiva e negativa nel timo.

Questo video dimostra la dissezione e la rimozione del timo del feto e la preparazione delle colture ex vivo di 2-dGuo trattati con timo.

La preparazione di 2-dGuo-trattati Organ Culture Timo

Nel timo, è noto che le interazioni tra i precursori delle cellule T in via di sviluppo e le cellule stromali, che includono le cellule epiteliali corticali e midollari, svolgano...

Ciao, sono Will Jenkinson del gruppo di Graham Anderson ed Eric Jenkinson presso il MRC Center for Immune Regulation dell'Università di Birmingham. Oggi vi mostrerò una tecnica per l'allestimento di colture organotipiche timiche fetali. Inoltre, vi mostrerò anche come trattare queste colture organotipiche con due dioxazine.E questa è una sostanza che risulta selettivamente tossica per le cellule linfoidi nella coltura d'organo. Questa tecnica ha diverse applicazioni in laboratorio. Un esempio è la produzione di colture d'organo riaggregati.Altre applicazioni includono lo studio delle diverse fasi dello sviluppo dei citi e, utilizzando colture organotipiche del timo fetale, siamo in grado di aggiungere reagenti che inibiscono o stimolano diversi percorsi, il che significa che possiamo studiare il ruolo di molecole specifiche in questo processo. Cominciamo dunque. Il primo passo per preparare le colture organotipiche del timo consiste nel prelevare embrioni di topo di giorno 14 o 15 da una o due femmine gravide.Per prima cosa, spruzzare il topo eutanasizzato con etanolo al 70%. Quindi, utilizzare una pinza per tirare il pelo ed effettuare un'incisione a forma di V nella regione addominale con le forbici, partendo dalla vescica e proseguendo lungo i due corni laterali dell'utero. Rimuovere il corno uterino e collocarlo in una piastra di Petri sterile da 10 centimetri.Tagliare longitudinalmente la parete uterina ed estrarre gli embrioni ancora all'interno delle sacche amniotiche. Lavare in una piastra di Petri contenente 10 ml di PBS utilizzando due paia di pinzette fini. Aprire con attenzione la sacca amniotica ed estrarre l'embrione dalla sacca e dalla placenta.Successivamente, trasferire gli embrioni in una nuova capsula di Petri contenente 10 ml di una miscela 50:50 di PBS con RPMI 1640. In presenza di mezzo con FCS al 10%, sotto un microscopio stereoscopico e con l'embrione immerso nel mezzo, decapitare l'embrione utilizzando pinzette. Aprire la superficie anteriore della parete toracica inserendo le punte di una coppia di pinzette chiuse nella cavità toracica e quindi aprendo le pinzette per esporre la cavità toracica interna.Rimuovere l'intero albero toracico, cuore, polmoni, trachea e timo afferrando delicatamente al di sotto del cuore e posizionare in una piastra da 35 millimetri contenente cinque millilitri di RPMI 1640 più 10% FCS in un embrione al giorno 14-15. I lobi timici rudimentali si trovano appena sopra il cuore su entrambi i lati del tronco qui.Rimuovere i singoli lobi del timo utilizzando pinzette fini ed eliminare anche il tessuto connettivo in eccesso e qualsiasi sangue aderente prima di espanderli nella coltura organotipica. Ora siamo pronti per la coltura organotipica. Per preparare un detossificante linfatico, prelevare un stock di 9 millimolari di due ossazine e preparare 600 microlitri in una piastra di Petri in plastica batteriologica da 90 millimetri.Aggiungere quattro millilitri di mezzo DMEM preriscaldato e ruotare la piastra in modo che l'intera superficie sia ricoperta dal mezzo. Ovviamente, se si desiderano colture linfoidi per lo studio dello sviluppo dei linfociti T, rimuovere le due diossazina con pinzette. Posizionare due tamponi sterili, tagliati in quadrati di un centimetro quadrato, nella piastra.Lasciare che il mezzo penetri nella spugna per circa 30 secondi. Quindi capovolgere la spugna per inumidire entrambi i lati. Ciò garantisce che il mezzo nella piastra possa raggiungere il tessuto, utilizzando nuovamente la pinzetta.Posizionare un filtro pre-sterilizzato da 0,8 micron sulla superficie di ogni spugna. I filtri vanno posizionati con il lato lucido rivolto verso l'alto sui supporti della spugna per trasferire i frammenti di timo sul filtro per coltura d'organo; preferiamo utilizzare una pipetta di vetro per preparare i pipet di vetro. Riscaldare il tubo di vetro sopra una fiamma di bunsen e, quando il vetro è malleabile, rimuoverlo dalla fiamma e tirare su entrambe le estremità per allungare il vetro fino a un massimo di 10 centimetri, lasciando poi raffreddare il vetro.Quindi tirare su ciascuna estremità per spezzare il vetro. Questo produce due pipette di vetro conici. La zona sottile di ciascuna è lunga circa cinque centimetri e presenta una punta di circa 0,5 millimetri di diametro.Per impostare l'apparato della pipetta, inserire un'asticella di plastica nell'altra estremità come boccaglio e introdurre l'estremità smussata di una pipetta di vetro nel tubo. Prelevare con attenzione singole lobi del timo mediante la pipetta a bocca e posizionarli sulla superficie del filtro da 0,8 micron. Per la coltura d'organo, si consiglia di posizionare da cinque a sei lobi del timo su ciascun filtro, per un totale di 10-12 lobi del timo per piastra. Questo consente ampio spazio per la crescita delle colture organotipiche e permette alla dioxazina di eliminare tutte le cellule linfoidi endogene. Una volta preparate le colture, assemblare un coperchio a sandwich utilizzando il coperchio di una piastra di Petri da 10 centimetri come piattaforma e acqua bidistillata appena al di sotto del livello della piattaforma. Posizionare fino a tre piastre all'interno del contenitore e sigillare il coperchio al contenitore con del nastro adesivo.Il coperchio deve presentare due fori di aerazione da cinque millimetri praticati in angoli opposti. Posizionare le scatole in un incubatore a 37 gradi Celsius con 10%CO2 per un periodo di cinque o sette giorni, dopo il quale si procede alla disgregazione e successiva reaggregazione di queste colture per studiare le interazioni nei siti timici stromali in un ambiente tridimensionale controllato. Dopo un periodo di coltura, solitamente compreso tra cinque e sette giorni, le F talks vengono raccolte immergendo i filtri nel mezzo e staccando delicatamente i lobi con pinzette; si può osservare che i f tosi linfoidi sono tipicamente più piccoli e cistici rispetto ai lobi linfoidi non trattati con dioxazina.Ho appena illustrato la tecnica per l'allestimento di colture organotipiche del timo fetale. In questo protocollo, abbiamo mostrato come trattare le colture organotipiche del timo fetale con due dioxazina, un trattamento che esaurisce generalmente tutte le cellule linfoidi dopo cinque-sette giorni di coltura del timo. Utilizziamo queste colture organotipiche per produrre colture organotipiche di riaggregazione.Tuttavia, questa non è l'unica tecnica. Utilizziamo anche colture organotipiche timiche fetali non trattate con dioxazina da trasferire sotto la capsula renale di un topo timico. Inoltre, impiegiamo colture organotipiche timiche linfoidi fetali per studiare lo sviluppo dei linfociti T in condizioni controllate in vitro, libere da qualsiasi effetto secondario che possa verificarsi in vivo.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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In questo video la preparazione di 2-dGuo trattati reaggregate culture timo è dimostrata.

Reaggregate Culture Thymus

Abbiamo sviluppato strumenti di laboratorio nuovi e protocolli per l'acquisizione di immagini intravitale del timo. La nostra tecnica dovrebbe aiutare nell'identificazione di "nicchie" all'interno del timo in cui lo sviluppo delle cellule T si verifica.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Questo video mostra un protocollo per la generazione di cellule T funzionali antigene-specifiche da cellule T immature derivate da iPSC utilizzando un sistema di coltura timica tridimensionale. La co-coltura delle cellule T immature derivate da iPSC con lobi timici fetali di topi endogeni depleti di linfociti ha portato alla maturazione delle cellule T per formare emigranti timici derivati da iPSC CD8αβ+ MHC di classe I+ iPSC.

Sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigranti timici derivati da iPSC

Dettagli Questo protocollo un metodo per isolare le cellule presentanti l'antigene da timo umano attraverso diverse fasi di digestione enzimatica del tessuto seguita dalla densità centrifugazione della sospensione di cellule singole e smistamento finalmente magnetico e / o FACS delle popolazioni cellulari di interesse.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

Qui si descrive un metodo efficace per l'isolamento, l'identificazione e la purificazione delle cellule epiteliali del timo topo (TEC). Il protocollo può essere utilizzato per gli studi di funzione del timo per il normale sviluppo delle cellule T, la disfunzione del timo, e la ricostituzione delle cellule T.

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

Lo studio delle cellule epiteliali midollari del timo in vitro è stato in gran parte infruttuoso, poiché gli attuali sistemi di coltura 2D non imitano lo scenario in vivo. Il sistema di coltura 3D qui descritto - un modello di coltura organotipica della pelle modificata - si è dimostrato superiore nella ricapitolazione della proliferazione, della differenziazione e del mantenimento dell'espressione genica promiscua di mTEC.

3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

Descriviamo la preparazione di fette timici che, in combinazione con la citometria di flusso, possono essere utilizzate per modellare selezione positiva e negativa di sviluppare cellule T. Fette timo possono anche essere adattati per l'analisi in situ della migrazione thymocyte, localizzazione, e la segnalazione tramite immunofluorescenza e microscopia a due fotoni.

Preparazione e applicazioni di colture organotipiche timica Slice

Questo articolo descrive un nuovo metodo per generare emigranti timici (iTE) derivati da cellule staminali specifiche dell'antigene tumorale del tumore da un sistema di coltura timica tridimensionale (3D). ITE sono un sottoinsieme omogeneo di cellule T strettamente correlate alle cellule T ingenue con la capacità di proliferazione, formazione della memoria, e la soppressione del tumore.

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

Forniamo un metodo semplice ed efficiente per trapiantare 2'-deossiguanosina trattata E18.5 tiromusnella capsula renale di un topo nudo. Questo metodo dovrebbe aiutare nello studio sia della funzione epiteliale timica che della maturazione delle cellule T.

Trapianto di subcapsulare renale di 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Topi Nudi

Qui, descriviamo un protocollo per la formazione di organoidi di timo derivati da iPSC umane cresciuti in idrogel di fibrina 3D con l'obiettivo di supportare la maturazione delle cellule epiteliali timiche (TEC) e il mantenimento prolungato, nonché la timopoiesi in vitro.

Formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali

Impara a preparare colture di organi timici fetali trattati con 2-dGuo per studiare lo sviluppo delle cellule T. Questa tecnica consente di analizzare le interazioni stromali in vitro.

La preparazione di 2-dGuo-trattati Organ Culture Timo

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