La preparazione di 2-dGuo-trattati Organ Culture Timo

Ciao, sono Will Jenkinson del gruppo di Graham Anderson ed Eric Jenkinson presso il MRC Center for Immune Regulation dell'Università di Birmingham. Oggi vi mostrerò una tecnica per allestire colture di organi timici fetali. Inoltre, ti mostrerò anche come trattare queste colture di organi con due diossazina.

E questa è una sostanza che è selettivamente tossica per le cellule linfoidi nella coltura dell'organo. Ci sono diverse applicazioni di questa tecnica in laboratorio. Una di queste applicazioni è la produzione di colture di organi riaggregate.

Altre applicazioni includono lo studio delle diverse fasi dello sviluppo dei citi e, utilizzando colture di organi timici fetali, siamo in grado di aggiungere reagenti che inibiscono o stimolano diversi percorsi, il che significa che possiamo studiare il ruolo di molecole specifiche in questo processo. Quindi iniziamo. Il primo passo per preparare le colture di organi del timo è raccogliere embrioni di topo del giorno 14 o 15 da una o due madri gravide.

Per prima cosa, spruzza il topo eutanasia con etanolo al 70%. Quindi usa una pinza per tirare il pelo e fai un'incisione a forma di V nella regione addominale con le forbici partendo dalla vescica e continuando lungo le due corna laterali dell'utero. Rimuovere il corno uterino e metterlo in una capsula di Petri sterile da 10 centimetri.

Tagliare lungo la parete uterina e rimuovere gli embrioni ancora nelle loro sacche amniotiche. Lavarli in una capsula di Petri contenente 10 mil di PBS utilizzando due paia di pinze sottili. Strappare con cautela il sacco amniotico e liberare l'embrione dal sacco e dalla placenta.

Successivamente, trasferire gli embrioni in una capsula di Petro fresca contenente 10 mulini con una miscela 50 50 di PBS con RPMI 1640. Terreni con il 10% di FCS al microscopio da dissezione con l'embrione immerso nel terreno, decapitare l'embrione con una pinza. Aprire la superficie anteriore della parete toracica posizionando le punte di un paio di pinze chiuse nella cavità toracica e aprire le pinze per rivelare la cavità toracica interna.

Rimuovere l'intero albero toracico, il cuore, i polmoni, la trache e il timo afferrando delicatamente sotto il cuore e metterli in un piatto da 35 millimetri contenente cinque mil di RPMI 1640 più il 10% di FCS in un giorno. Da 14 a 15 embrioni. I lobi rudimentali del timo si trovano appena sopra il cuore su entrambi i lati del camion.

Rimuovere i singoli lobi del timo utilizzando una pinza sottile e rimuovere anche il tessuto connettivo in eccesso e l'eventuale sangue aderente prima di espandersi nella coltura degli organi. Ora siamo pronti per la coltura degli organi. Per fare una disintossicazione linfoide, prendi un ceppo di Thor nove millimolari di due diossazine e prepara 600 microlitri in una capsula di Petri di plastica batterica da 90 millimetri.

Aggiungere quattro mil di media DMEM preriscaldato e agitare il piatto in modo che l'intera superficie sia coperta con il supporto. Ovviamente. Se vuoi che le colture linfoidi studino lo sviluppo delle cellule T, lascia fuori le due diossazine usando il forcipe. Posizionare due involucri artistici sterili, spugne, pretagliati a un centimetro quadrato nel piatto.

Lasciare che il supporto si impregni nella spugna per circa 30 secondi. Quindi capovolgere la spugna per bagnare entrambi i lati. Ciò garantisce che il terreno nel piatto abbia accesso al tessuto, ancora una volta, utilizzando una pinza.

Posizionare un filtro pre-sterilizzato né da 0,8 micron sulla superficie di ciascuna spugna. I filtri sono posizionati con il lato lucido rivolto verso l'alto sui supporti in spugna per trasferire le pagnotte di timo al filtro di coltura dell'organo, ci piace usare una pipetta di vetro di controllo matematico per fare animali domestici con pipa di vetro. Scaldare il tubo di vetro sulla fiamma di un panino e del bruciatore e quando il vetro è pable, rimuovere il vetro dalla fiamma e tirare entrambe le estremità per allungare il vetro a non più di 10 centimetri, lasciando raffreddare il vetro.

Quindi tirare ciascuna estremità per far scattare il vetro. Questo produce due animali domestici affusolati per tubi di vetro. L'area sottile di ciascuno è lunga circa cinque centimetri con una punta di circa zero 0,5 millimetri di diametro.

Per configurare l'apparecchio per pipette, posizionare una punta di plastica nell'altra estremità come boccaglio e posizionare l'estremità smussata di una pipetta di vetro nel tubo. Prelevare con cautela i singoli lobi del timo con la pipetta orale e posizionarli sulla superficie del filtro NOR 0,8 micron. Nella coltura d'organo, si consiglia di mettere da cinque a sei lobi del timo su ciascun filtro per un totale di 10-12 lobi del timo per piatto.

Ciò consente molto spazio per la crescita delle colture di organi e consente alle due diossazine di eliminare tutte le cellule linfoidi endogene. Una volta che le colture sono state impostate, assemblare un coperchio per sandwich con un coperchio di una capsula di Petri di 10 centimetri come piattaforma e acqua distillata due volte appena sotto il livello della piattaforma. Metti fino a tre piatti nella scatola e sigilla il coperchio della scatola con del nastro adesivo.

Il coperchio dovrebbe avere due fori per l'aria da cinque millimetri praticati negli angoli opposti. Posizionare le scatole in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 10% di CO2 per cinque-sette giorni, dopodiché disaggreghiamo e poi riaggreghiamo queste colture per studiare le interazioni del sito timico stromale in un ambiente tridimensionale controllato. Dopo un periodo di coltura, in genere da cinque a sette giorni, i discorsi F vengono raccolti immergendo i filtri nel terreno e spingendo via delicatamente i lobi Con una pinza, si può vedere che i f tos linfoidi sono in genere più piccoli e cistici rispetto ai lobi linfoidi non trattati con diossazina.

Quindi vi ho appena mostrato la tecnica per impostare le colture di organi timici fetali. In questo protocollo, vi abbiamo mostrato come trattare le colture di organi timici fetali con due diossazine e questo esaurisce tutte le cellule linfoidi in genere dopo cinque o sette giorni di coltura del telo. Utilizziamo queste colture di organi per produrre colture di organi riaggregate

Tuttavia, questa non è l'unica tecnica. Utilizziamo anche colture di organi timici fetali non trattate con diossazina per trasferirle sotto la capsula renale di un topo timico. Inoltre, utilizziamo colture di organi timici fetali linfoidi per studiare lo sviluppo delle cellule T in condizioni controllate in vitro, che sono prive di effetti secondari che possono verificarsi in vivo.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.