Name: Preparazione e manutenzione dei neuroni dei gangli dorsali in Culture Compartmented (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Impara a preparare e mantenere neuroni dei gangli dorsali in culture compartmented usando embrioni di ratto E15. Questa tecnica consente di studiare la crescita assonale e le interazioni neuronali in modo controllato.

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Vorremmo ringraziare Katharina Cosker e Stephanie Courchesne per utili discussioni.

Preparazione dei reagenti <ol><li> Rivestimento collagene: collagene cappotto p35 piastre di coltura dei tessuti e mettere in forno a 37 ° C per 2 giorni prima ingrassaggio i divisori. La concentrazione finale di collagene deve essere di 0,71 mg / ml diluito in 0,001 N HCl. Poi, aggiungere 1 ml di miscela per piastra. </li><li> Caricatori Grasso: Per riempire il caricatore grasso, una siringa da 60 ml deve prima essere riempita con grasso per vuoto Corning. Usare la siringa per riempire il caricatore grasso, avvolgetela in un foglio e poi in autoclave per 45 minuti. </li><li> Divisori teflon: i divisori possono essere riutilizzati dopo ogni esperimento, ma deve prima essere puliti. Rimuovere il divisore dalla piastra, togliete tutti il ​​grasso residuo e il luogo in acido solforico per 2 giorni. Dopo aver rimosso dal lavaggio, sciacquare con acqua 3X, far bollire per 20 minuti, lasciare asciugare, mettere in un piatto di vetro P100 Petri e autoclave per 20 minuti. </li><li> N2-metilcellulosa: Pesare 1,5 g di metilcellulosa e mettetelo in una bottiglia da 500 ml. Aggiungi un ancoretta e autoclave per 20 minuti a secco (da questo punto tutto il lavoro deve essere sterile). Successivamente, aggiungere 500 ml di siero multimediale gratuito (N 2), e mescolate in una stanza fredda fino a quando non si scioglie. Aliquota in 50 conicals ml e congelare a -20 ° C. Per lavorare stock, aliquota uno dei 50 conicals mL in provette 1 ml e congelare a -20 ° C. </li><li> DRG media: DMEM, 5% di calore siero di cavallo inattivato, streptomicina e 1% di penicillina. </li><li> 100ng/mL DRGN dei media: la concentrazione stock di entrambi fattore di crescita nervosa (NGF) e del cervello-derivato fattore neurotrofico (BDNF) è 1mg/mL. Diluire ciascuna delle neurotrofine 1:10.000 nei media DRG. Culture possono essere coltivate in NGF solo: questo altera il complemento di neuroni che sopravvivono nelle culture. Nota: Quando necessario, la concentrazione di (citosina arabinoside) AraC è 1um e utilizzato ad una concentrazione finale di 0.3uM. Questo inibire la crescita di cellule di Schwann e glia altri. </li><li> 10ng/ml DRGN media: Diluire il 100ng/mL DRGN mezzi di comunicazione (1:10) con i media DRG. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_27_6/951_Figure-01.png" alt="Figura 1" width="392" height="294"> Strumenti di Figura 1. Necessarie per set-up </li></ol> La creazione di camere di compartimenti (avviare questo processo 1-2 giorni prima della dissezione) <ol><li> Fai un graffio nel bel mezzo di un piatto rivestito di collagene p35 con un movimento verso l'esterno. </li><li> 30ul posto di N2-metilcellulosa al centro del graffio. Set piatti da parte fino divisore è ingrassato. </li><li> Allegare una 23-gauge adattatore luer stub al caricatore grasso. Afferrare il divisore in teflon con un paio di hemostats angolo di 90 ° e adagiarlo orizzontalmente con il divisore rivolta verso l'alto sotto un microscopio. Traccia il divisore con grasso facendo in modo che ogni volta che l'adattatore è posto a un nuovo punto di partenza è inserito l'adattatore nella grasso dal passo precedente in modo che ci sia una linea continua di grasso (vedi schema). Una volta che il grasso viene applicato il divisore intero, girare uno dei piatti preparati p35 a testa in giù e posizionarlo in modo che il N2-metilcellulosa si trova sopra il vano centrale. Premere sul fondo del piatto con un paio di pinzette. Assicurarsi di premere sulla parte interna del divisore in quattro angoli (in alto a sinistra, in basso a destra, in alto a destra, in basso a sinistra, indicato nello schema da "X"). <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_2/951_Figure-02.png" alt="Figura 2" width="171" height="183"> Figura 2: Procedura per ingrassare il divisore Nota: è importante per premere con forza sufficiente in modo che il grasso fa un sigillo completo con il piatto, ma se troppa pressione si aggiunge, gli assoni non attraverserà negli scompartimenti laterali. Sollevare il hemostats, capovolgerlo e sbloccare il divisore. Infine, posto il piatto con il divisore saldamente sotto il microscopio di messa a fuoco sul fondo del vano centrale. Con il caricatore grasso, fare una piccola barriera (0,25 centimetri) in modo che una volta che le cellule si trovano nel vano centrale non possono fuoriuscire. </li><li> Dopo aver creato diverse culture, media luogo DRG in ciascuno dei compartimenti laterali e posto in una incubatrice in cui le cellule saranno mantenute. Lasciare le culture di sedersi per diverse ore e poi verificare la presenza di perdite. Se il supporto è trapelato nel vano centrale, quindi la cultura è inutilizzabile. Nota: La prima volta che questa tecnica di apprendimento, è importante impostare le culture più di quelli necessari per un esperimento, come molti si perde. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_3/951_Figure-03.png" alt="Figura 3" width="254" height="191"> Figura 3: la cultura "Good vs leaky" </li></ol> Mantenere i neuroni DRG nelle culture compartimenti <ol><li> Giorno 1: Sostituire DRG media negli scomparti laterali con 100ng/mL DRGN supporti + AraC. Eseguire la dissezione e aggiungere le celle a scomparto centrale (100.000 cellule). </li><li> Giorno 2: Aggiungi 10ng/ml media + AraC verso l'esterno del divisore Teflon fino a quando il flusso dei media oltre la barriera grasso e liquidi gli scambi con il vano centrale. </li><li> Giorno 3: Sostituire i media nei compartimenti laterali per 100ng/mL DRGN omettendo il Arac e il surround con 10ng/ml DRGN omettendo il AraC. </li><li> Giorno 6: sostituire i media nei compartimenti laterali per 1ng/mL + Arac e il surround con DRG supporti + AraC. </li><li> Giorno 9: Usa per la sperimentazione. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_5/951_Figure-04.png" alt="Figura 4" width="267" height="148"> Figura 4: immagini IHC di corpi cellulari e gli assoni distali Nota: Quando si cambiano i media, è importante per aspirare il liquido dalla parte superiore di ogni singolo vano laterale. Inoltre, non cambia il contenuto del vano centrale stessa, solo dal surround, e lasciate fluire oltre la barriera del grasso verso il centro. </li></ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+of+the+Local+Environment+of+Somas+and+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites.</a> Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+use+the+Erk5+pathway+to+mediate+a+retrograde+survival+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response.</a> Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).</li>
<li>Heerssen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+motors+transport+activated+Trks+to+promote+survival+of+target-dependent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons.</a> Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2006).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Ure, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).</li>
</ol>

In questo video, abbiamo dimostrato come preparare e mantenere camere compartimenti per l&#39;uso nei neuroni DRG coltura. Fatto correttamente, questo sistema consente la separazione del corpo cellulare dal assone al fine di studiare meccanismi attraverso i quali neurotrofine segnale attraverso lunghi assoni. Poiché non vi è l&#39;isolamento fluidico tra i compartimenti, permette per la stimolazione selettiva o il trattamento di un compartimento senza altri compartimenti essere colpiti. Culture camera compartimentate in grado di supportare ...

<table><tbody><tr><td>collageno</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>metilcellulosa N2 400CPS</td><td>Reagente</td><td>Sel-Win Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>divisore in teflon</td><td>Altro</td><td>Tyler Research</td><td>CAMP10</td><td>sono disponibili molti altri tipi di divisori</td></tr><tr><td>rastrello a perno</td><td>Strumento</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-PR</td><td></td></tr><tr><td>caricatore per grasso</td><td>Strumento</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-GLSS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reagente</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-01</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Reagente</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>grasso ad alto vuoto</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>AraC</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1768</td><td></td></tr><tr><td>adattatore luer a stelo da 23 gauge</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>427565</td><td></td></tr><tr><td>pinze emostatiche ad angolo di 90&amp;#x00B0;</td><td>Strumento</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-7035</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione e manutenzione dei neuroni dei gangli dorsali in culture compartmented

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

I neuroni estendere i processi assoni che sono molto lontane dal corpo cellulare a innervare tessuti bersaglio, dove sono richiesti obiettivi derivati ​​fattori di crescita per la sopravvivenza neuronale e la funzione. Neurotrofine sono specificamente tenuti a mantenere la sopravvivenza e la differenziazione dei neuroni sensoriali che innervano ma il problema di come questi target-derivati ​​neurotrofine comunicare al corpo cellulare dei neuroni che innervano è stata un&#39;area di ricerca attiva da oltre 30 anni. Il modello più comunemente accettata di come i segnali neurotrofina raggiungere il corpo cellulare propone di segnalazione endosomi portare questo segnale retrogrado lungo l&#39;assone. Al fine di studiare il trasporto retrogrado, un sistema di coltura è stato originariamente ideato da Robert Campenot, in cui corpi cellulari sono isolati dal loro assoni. La tecnica di preparazione di queste camere compartimenti per la coltura dei neuroni sensoriali ricapitola la stimolazione selettiva di terminazioni neuronali che si verifica in vivo seguente comunicato del target di derivazione neurotrofine. Retrograda di segnalazione eventi che richiedono lunga distanza retrograda dipendente microtubuli hanno importanti implicazioni per il trattamento di patologie neurodegenerative.

Qui si descrive la tecnica di preparazione e mantenimento di camere compartimenti per la coltura dei neuroni sensoriali dei gangli delle radici dorsali.

Preparazione e manutenzione dei neuroni dei gangli dorsali in Culture Compartmented

I neuroni estendono processi assonali lontani dal corpo cellulare per innervare i tessuti bersaglio, dove i fattori di crescita derivati dal bersaglio sono necessari per...

Questa procedura inizia creando un graffio al centro di una piastra rivestita con collagene mediante un rastrello a perni, e pipettando 30 microlitri di metilcellulosa al centro dei graffi. Ungere ogni divisore utilizzando un caricatore di grasso e fissarlo a una piastra rivestita con collagene. Inserire 100.000 cellule provenienti da embrioni di ratto E15 nel compartimento centrale.Dopo nove giorni, le cellule avranno esteso assoni nel compartimento laterale e saranno pronte per gli esperimenti. Ciao, sono Maria Murphy del laboratorio della dottoressa Rosalyn Siegel del Dipartimento di Oncologia Pediatrica presso l'Istituto di Ricerca sul Cancro Dana-Farber. Oggi vi mostreremo una procedura per la preparazione e la manutenzione di neuroni dei gangli delle radici dorsali in colture compartimentate.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il segnale dei neurotrofini. Cominciamo. Prima di preparare le camere compartimentate, le piastre per colture cellulari P 35 devono essere rivestite con collagene.Per fare ciò, aggiungere un millilitro di una soluzione di collagene 0,71 milligrammi per millilitro in HCl 0,001 N alle piastre e incubare a 37 gradi Celsius per

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Biologia

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

Questo video mostra una procedura per isolare i neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) da embrioni di ratto e co-coltivarli con i precursori delle cellule di Schwann per generare cellule di Schwann mature. I DRG isolati vengono elaborati per isolare i neuroni e le cellule gliali. Le cellule isolate vengono coltivate per purificare i neuroni, che vengono poi co-coltivati con cellule simili a cellule di Schwann (SCLC) in un terreno di co-coltura. L'interazione con i neuroni DRG porta alla...

Isolamento di neuroni DRG e cocoltura con precursori cellulari di Schwann per generare cellule di Schwann

Questo video dimostra la costruzione di un sistema di coltura cellulare a tre compartimenti utilizzando collagene e grasso non reattivo. Questo sistema viene utilizzato per osservare le interazioni tra le cellule di glioma e gli assoni in tempo reale.

Preparazione di piastre di coltura compartimentate rivestite di collagene per colture cellulari neuronali

Il video dimostra la co-coltura dei neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) con le cellule di Schwann. I neuroni DRG vengono prima cresciuti su una membrana pre-stirata per la crescita degli assoni allineati. Vengono quindi introdotte le cellule di Schwann, che si attaccano agli assoni, isolandoli e promuovendo la sopravvivenza e la funzione delle cellule neurali.

Co-coltura di cellule di Schwann con neuroni DRG su una membrana pre-stirata

Questo video mostra un metodo per raccogliere neuroni dai gangli della radice dorsale (DRG). Il DRG della colonna vertebrale di un ratto viene isolato, trattato con enzimi e quindi dissociato meccanicamente per ottenere una sospensione unicellulare. I neuroni vengono separati dalle cellule gliali mediante centrifugazione a gradiente di densità e coltivati in un mezzo di crescita.

Una tecnica per la raccolta e la dissociazione dei gangli della radice dorsale per le colture neuronali

Questo video mostra il modello di cocoltura di un espiante di ganglio della radice dorsale e cellule di Schwann. In condizioni di cocoltura, l'acido ascorbico promuove la differenziazione delle cellule di Schwann in forme mielinizzanti. Le cellule mielinizzanti di Schwann avvolgono gli assoni più volte per creare una guaina mielinica, essenziale per la funzione nervosa.

Co-coltura di un espiante di ganglio della radice dorsale con cellule di Schwann per la mielinizzazione dei neuroni

Questo video mostra una tecnica per isolare e coltivare le cellule dei gangli della radice dorsale (DRG) dalla colonna vertebrale del ratto. I DRG asportati dalla colonna vertebrale vengono trattati con enzimi e dissociati meccanicamente per ottenere una sospensione unicellulare. Le cellule vengono coltivate in un terreno contenente inibitori e fattori di crescita che limitano la proliferazione delle cellule gliali e promuovono la crescita neuronale, rispettivamente.

Stabilire una coltura cellulare primaria di gangli della radice dorsale da una colonna vertebrale di ratto

Questo protocollo descrive l'isolamento dei neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) isolati dai ratti e la coltura dei neuroni DRG su un sistema statico di coltura cellulare pre-allungata per migliorare l'allineamento degli assoni, con successiva co-coltura di cellule di Schwann (SC) per promuovere la mielinizzazione.

Un approccio per migliorare l&#39;allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

Colture primarie di radice dorsale (DRG) i gangli sono frequentemente utilizzati per studiare funzioni fisiologiche o eventi relativi alla patologia nei neuroni sensoriali. Qui, noi dimostrare l'uso di colture di DRG lombare per rilevare il rilascio dei neurotrasmettitori dopo tipo del ricevitore di neuropeptide FF 2 stimolazione con un agonista selettivo.

Isolamento dei gangli di radice dorsale e colture primarie per lo studio del rilascio di neurotrasmettitore

Qui presentiamo un sistema di coltura motrice mista ex-vivo per lo studio della migrazione delle cellule glioma umane (hGC) in tempo reale. Questo modello fornisce la capacità di osservare le interazioni tra hGC e assoni mielinati e non mielinati all'interno di una camera compartimentata.

Monitoraggio in tempo reale della migrazione delle cellule del Glioma umano sulle coculture di Asse-Olgon-Oligodendroce

Questo protocollo fornisce una tecnica per raccogliere e coltivare il ganglio radicale dorsale (DRG) espiantato da ratti Sprague Dawley adulti in un dispositivo multicompartimentale (MC).

Raccolta, inclusione e coltura dei gangli della radice dorsale in dispositivi multicompartimentali per studiare le caratteristiche neuronali periferiche

Impara a preparare e mantenere neuroni dei gangli dorsali in culture compartmented usando embrioni di ratto E15. Questa tecnica consente di studiare la crescita assonale e le interazioni neuronali in modo controllato.

Preparazione e manutenzione dei neuroni dei gangli dorsali in Culture Compartmented

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