Name: Il modello di encefalopatia ipossico ischemica di ischemia perinatale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara a indurre un modello di encefalopatia ipossico-ischemica in cuccioli di ratto Sprague-Dawley postnatali mediante microchirurgia e legatura dell'arteria carotide comune sinistra.

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Finanziato dalla American Heart Association e March of Dimes.

Questo protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Stanford University e si attiene alle linee guida dell&#39;Istituto Nazionale di Sanità per l&#39;uso di animali da esperimento. Neonatale Rat modello HIE <ol><li> Giorni post-parto (PND) 7 Sprague-Dawley ratti (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) sono completamente anestetizzati con isoflurano (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL; 3-4% per l&#39;induzione e 1-2% per manutenzione). </li><li> Una piccola incisione viene fatta nel collo (Extra Sottile Forbici Iris # 14088-10, Fine Science Strumenti Inc, Foster City, CA) per esporre la sinistra arteria carotide comune (CCA). </li><li> Il CCA è legatura con una sutura di seta 5-0 (5-0 seta, Ethicon, Somer, NJ). </li><li> L&#39;incisione viene chiusa con adesivo cianoacrilato (Elmers Products Inc, Columbus, OH). L&#39;incisione è coperta di nastro e l&#39;anestesia è fermato. I cuccioli sono tornati alle loro diga e ha permesso di recuperare per 1-2 ore. </li><li> I cuccioli vengono poi poste in una camera ipossica che contiene l&#39;8% di ossigeno equilibrato con il 92% di azoto per 100 minuti a 37 ° C. 8% di azoto dei gas oxygen/92% (Airgas, Sacramento, CA) che attraverso un tubo nella gabbia del mouse dotato di un coperchio di plastica. La copertina è fatta per adattarsi alla gabbia e ha due fori di 2 cm di diametro, una delle quali per ricevere il tubo collegato alla bombola di ossigeno 8% del gas e un altro permette al gas di flowout. La camera si trova in un bagno d&#39;acqua ed è riscaldato prima dell&#39;uso e un termometro all&#39;interno di esso deve registrare 37 ° C prima di ipossia. </li><li> Alla fine di 100 minuti di ipossia, i cuccioli sono tornato di nuovo ai loro diga per il recupero. </li><li> 24 ore dopo la fine di ipossia, i cuccioli sono eutanasia da anestesia profonda con isoflurano. Tessuto cerebrale è perfuso con soluzione fisiologica fredda, seguita da una soluzione di fredda 1% TTC in tampone fosfato, pH 7.4 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). TTC devono essere tenuti al riparo dalla luce. </li><li> Cervelli sono stati rimossi e raffreddati per 1-2 minuti in ghiaccio, e quattro sezioni coronali 3 mm tra i (livelli 1-4) vengono tagliati, a partire rostralmente a livello del opticchiasm e infundibolo, corrispondente al bregma 1,8 ~ 2,0 mm Livello di il cervello di topo adulto. </li><li> Sezioni di cervello sono immersi in una TTC e incubate a 37 ° C per 8 minuti, seguita da fissazione in paraformaldeide 4% / PBS durante la notte. TTC perché è sensibile alla luce, tenere le fette al riparo dalla luce durante questo periodo. </li><li> Le sezioni colorate TTC vengono scansionati e digitalizzati. Utilizzando immagini J (NIH, Bethesda, MD), i seguenti sono misurati per ogni livello: area di infarto (area senza macchia), l&#39;area dell&#39;emisfero ipsilaterale, e la zona dell&#39;emisfero controlaterale. La percentuale dell&#39;area infartuata per fetta è calcolato come: (area di infarto / area di emisfero ipsilaterale), A 1, A 2, A 3 e A 4. Il volume percentuale di infarto è calcolato come la somma (A 1 + A 2 + A 3 + A 4) * 3 mm. Aree di lesioni corticali o striato può anche essere quantificato separatamente in modo simile. </li></ol> Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/old/955_2008_9_2_2/955_Fig-01.png" alt="Figura 1" width="660" height="190" /> Figura 1. Rappresentante HIE livelli coronale 1-4 macchiata di TTC. TTC sezioni colorate coronali dimostrare area di infarto (in bianco).

<ol><li>Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+immaturity+on+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat.</a> Annals of neurology. 9 (2), 131-141 (1981).</li>
<li>Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+Hypoxic-Ischemic+Brain+Damage%3A+Evolution+of+an+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perinatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage: Evolution of an Animal Model.</a> Dev Neurosci. 27 (2-4), 81-86 (2005).</li>
<li>Bona, E., Hagberg, H., Loberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+moderate+hypothermia+after+neonatal+hypoxia-ischemia%3A+short-+and+long-term+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Protective effects of moderate hypothermia after neonatal hypoxia-ischemia: short- and long-term outcome.</a> Pediatric research. 43 (6), 738-738 (1998).</li>
<li>Trescher, W. H., Ishiwa, S., Johnston, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hypothermia+and+hyperthermia+on+attentional+and+spatial+learning+deficits+following+neonatal+hypoxia-ischemic+insult+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+brain+research%22%5BJournal%5D)">Effects of hypothermia and hyperthermia on attentional and spatial learning deficits following neonatal hypoxia-ischemic insult in rats.</a> Behavioural brain research. 151 (1-2), 209-209 (2004).</li>
<li>Mishima, K., Ikeda, T., Yoshikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+post-hypoxic-ischemic+hypothermia+markedly+delays+neonatal+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+development%22%5BJournal%5D)">Brief post-hypoxic-ischemic hypothermia markedly delays neonatal brain injury.</a> Brain development. 19 (5), 326-326 (1997).</li>
<li>Young, R. S., Olenginski, T. P., Yagel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+graded+hypothermia+on+hypoxic-ischemic+brain+damage%3A+a+neuropathologic+study+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">The effect of graded hypothermia on hypoxic-ischemic brain damage: a neuropathologic study in the neonatal rat.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 14 (6), 929-929 (1983).</li>
<li>Bederson, J. B., Pitts, L. H., Germano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+2%2C3%2C5-triphenyltetrazolium+chloride+as+a+stain+for+detection+and+quantification+of+experimental+cerebral+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 17 (6), 1304-1304 (1986).</li>
<li>Cai, J., Kang, Z., Liu, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+therapy+reduces+apoptosis+in+neonatal+hypoxia-ischemia+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model.</a> Neuroscience letters. 441 (2), 167-167 (2008).</li>
<li>Grow, J., Barks, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+hypoxic-ischemic+cerebral+injury+in+the+term+infant%3A+current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+perinatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts.</a> Clinics in perinatology. 29 (4), 585-585 (2002).</li>
<li>Aden, U., Halldner, L., Lagercrantz , H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggravated+brain+damage+after+hypoxic+ischemia+in+immature+adenosine+A2A+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Aggravated brain damage after hypoxic ischemia in immature adenosine A2A knockout mice.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 34 (3), 739-739 (2003).</li>
</ol>

Il modello di roditore postnatale HIE è un modello stabilito che l&#39;ipossia cerebrale ricapitola che si verificano nel periodo peri-natale dei neonati. Ampi studi istologici e caratterizzazione immunocitochimica hanno dimostrato che il roditore 7 giorni vecchio ha la maturità analogo cervello per modellare terzo trimestre di gravidanza 7 feto umano. Il modello di HIE roditore è stato molto istruttivo per comprendere i meccanismi di danno cerebrale perinatale da ipossia 2, dove interventi come l&#39;ipotermia sono st...

<table><tbody><tr><td>Cuccioli di ratto Sprague-Dawley</td><td>Animale</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Chirurgia</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gas al 8% di ossigeno / 92% di azoto</td><td>Chirurgia</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-trifenil tetrazolio cloruro</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) pH 7,4</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

il modello di encefalopatia ipossico ischemica di ischemia perinatale

The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

Encefalopatia ipossico-ischemica (HIE) è la conseguenza di asfissia sistemica che si verificano al momento della nascita. Venticinque per cento dei neonati con HIE sviluppare gravi e permanenti conseguenze neuropsicologiche, compreso il ritardo mentale, paralisi cerebrale ed epilessia. Gli esiti di HIE sono devastanti e permanenti, il che rende fondamentale per identificare e sviluppare strategie terapeutiche per ridurre le lesioni cerebrali nei neonati con HIE. A tal fine, il modello di ratto neonatale per ipossico-ischemica danno cerebrale è stato sviluppato per questo modello condizione umana. Il modello HIE è stato convalidato da Vannucci et al 1 e da allora è stato ampiamente usato per identificare i meccanismi di danno cerebrale perinatale risultante da ipossia-ischemia 2 e per testare potenziali interventi terapeutici 3,4. Il modello HIE è un processo in due fasi e prevede la legatura della carotide comune sinistra seguita da esposizione a un ambiente ipossico. Flusso ematico cerebrale (CBF) nell&#39;emisfero ipsilaterale alla legatura dell&#39;arteria carotide non diminuisce a causa del flusso collaterale sangue attraverso il circolo di Willis, ma con la tensione di ossigeno inferiore, la CBF nell&#39;emisfero ipsilaterale diminuisce significativamente e si traduce in unilaterali danno ischemico . L&#39;uso di 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) per colorare ed identificare tessuto ischemico cerebrale è stato originariamente sviluppato per i modelli adulti di ischemia cerebrale roditori 5, e viene utilizzato per valutare il grado di infarctin cerebrale in momenti primi fino a 72 ore dopo l&#39;evento ischemico 6. In questo video, dimostriamo la ipossico-ischemica modello lesioni nel cervello di ratto post-natale e la valutazione della dimensione dell&#39;infarto mediante colorazione TTC.

Il modello di ratto post-natale per ipossico-ischemica lesioni cerebrali è un consolidato modello di umano neonatale encefalopatia ipossico ischemica (HIE). In questo articolo, si descrive il modello di HIE in post-natale cuccioli di ratto.

Il modello di encefalopatia ipossico ischemica di ischemia perinatale

L'encefalopatia ipossico-ischemica (HIE) è la conseguenza di un'asfissia sistemica che si verifica alla nascita. Il venticinque per cento dei neonati con HIE sviluppa forme gravi di ...

Per indurre questo modello di encefalopatia ipossica-ischemica postnatale, i cuccioli di ratto Sprague Dawley di sette giorni subiscono un intervento microchirurgico con legatura dell'arteria carotide comune sinistra. Dopo un periodo di recupero di una o due ore, i cuccioli vengono collocati in una camera ipossica a 37 gradi Celsius per 100 minuti.I cuccioli vengono quindi restituiti alla madre fino al momento dell'eutanasia. Dopo due passaggi di perfusione sistemica, i cervelli vengono rimossi e tagliati in sezioni spesse tre millimetri. Le sezioni vengono quindi colorate utilizzando una soluzione al 1% di cloruro di trifenil tetrazolo, o soluzione TTC, al fine di rivelare l'area di infarto.Ciao, sono Hi tango del laboratorio Andre presso il Dipartimento di Neurologia e Scienze Neurologiche della Stanford University School of Medicine. Oggi vi mostreremo un procedimento per il modello di lesione cerebrale ipossico-ischemica nel neonato. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare i meccanismi dell'encefalopatia ipossico-ischemica nel cervello neonatale, con l'obiettivo finale di sviluppare nuovi trattamenti.Iniziamo. Per iniziare la procedura, anestetizzare completamente un ratto spray dolly di sette giorni dopo la nascita. Con isoflurano, utilizziamo il 4% per l'induzione e dall'1 al 2% per il mantenimento.Dopo alcuni minuti, eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi per verificare che il cucciolo sia anestetizzato. Quindi sterilizzare il collo del cucciolo utilizzando applicatori di cotone per applicare il 10% di iodopovidone, seguito da alcol isopropilico al 70%. Successivamente, utilizzare forbici sterili per iride extra sottili di fine science tools per praticare una piccola incisione di circa cinque millimetri a sinistra della linea mediana, esponendo l'arteria carotide comune sinistra o CCA mediante dissezione ottusa.Assicurarsi di rimuovere il tessuto connettivo e il nervo vago, che potrebbero intrecciarsi con l'arteria carotide comune (CCA). Successivamente, utilizzare un filo di seta cinque zero di Ethicon per legare l'arteria carotide comune (CCA).Il colore del vaso sopra il sito di legatura dovrebbe diventare bianco immediatamente dopo la legatura. Dopo la legatura, chiudere l'incisione con adesivo a base di cianoacrilato e coprire con un cerotto. Quindi interrompere l'anestesia e assicurarsi che il cucciolo riprenda conoscenza.Posizionare il piccolo in una scatola di recupero su un tappetino riscaldato. Ripetere la procedura su ulteriori piccoli secondo necessità. Osservare i piccoli per almeno cinque minuti prima di restituirli alla madre.Lasciare i cuccioli recuperare per uno o due ore prima dell'esperimento. Assemblare una camera ipossica contenente l'8% di ossigeno, bilanciato con il 92% di azoto. A tale scopo, procurarsi una gabbia per topi dotata di un coperchio in plastica con due fori del diametro di due centimetri.Un foro riceve il tubo collegato alla bombola di gas misto, che contiene l'8% di ossigeno e il 92% di azoto. L'altro foro permette al gas di fuoriuscire; posizionare la camera in un bagno d'acqua e quindi inserire un termometro all'interno della camera. Il termometro deve registrare 37 gradi Celsius prima dell'inizio dell'ipossia.Dopo che i cuccioli si sono ripresi, posizionarli nella camera ipossica per 100 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, riportare i cuccioli dalla madre 24 ore dopo la fine dell'ipossia ed eutanasia i cuccioli mediante anestesia profonda con iso fluorina. Quindi effettuare una perfusione intracardiaca attraverso il ventricolo sinistro utilizzando soluzione fisiologica fredda, seguita da una soluzione di 1% di TTC freddo in P-B-S-T-T-C, sensibile alla luce e che deve essere protetta dall'esposizione alla luce.Dopo il passaggio di perfusione, posizionare la testa su ghiaccio per uno o due minuti, quindi esporre il cervello utilizzando una lametta raffreddata con ghiaccio per sezionare il tessuto cerebrale a quattro livelli. Utilizzare una spatola per prelevare le fette di cervello e immergerle nella soluzione di TTC.Posizionare le sezioni in un incubatore a 37 gradi Celsius per otto minuti per consentire la colorazione con TTC. Successivamente, trasferire le sezioni in paraformaldeide al 4% in PBS, coprendo le sezioni. Poiché il TTC è sensibile alla luce, collocare le sezioni a quattro gradi Celsius e lasciarle fissare durante la notte dopo la fissazione notturna.Scansionare e digitalizzare le sezioni colorate con TTC ed eseguire l'analisi dei risultati. Di seguito sono riportati risultati rappresentativi di encefalopatia ipossico-ischemica, livelli coronali da uno a quattro colorati con TTC. Le aree bianche non colorate indicano le zone di infarto utilizzando ImageJ. Per ogni livello vengono misurati: l'area di infarto A e l'area dell'emisfero ipsilaterale B. Sulla base di queste misurazioni, la percentuale di area infartuata per sezione viene calcolata come rapporto tra l'area di infarto e l'area dell'emisfero ipsilaterale, ovvero A uno su B uno, A due su B due, A tre su B tre e A quattro su B quattro.Quindi, la percentuale di volume dell'infarto viene calcolata come la somma di a 1, 2, 3 e quattro, moltiplicata per tre millimetri, divisa per la somma di B 1, 2, 3 e quattro moltiplicata per tre millimetri. Le aree di danno corticale o SAL possono essere quantificate separatamente in modo analogo. Vi abbiamo appena mostrato come generare un modello di encefalopatia ipossico-ischemica di ischemia perinatale.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di limitare l'anestesia a non più di 10 minuti per ogni legatura dell'arteria carotidea comune, di posizionare sempre un termometro nella camera ipossica e di mantenere la temperatura a 37 gradi centigradi. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.

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Modelli animali di grandi dimensioni hanno buoni valori di traslazione nell'esame della fisiologia e farmacologia di asfissia neonatale. Utilizzando suinetti appena nati, sviluppiamo un protocollo sperimentale per simulare asfissia neonatale che presenta i vantaggi di studiare l'emodinamica sistemica e regionali, trasporti ossigeno con vie biochimiche e patologiche e correlazioni.

Un modello di asfissia neonatale suina

Il video mostra la procedura per la creazione di un modello murino per studiare la lesione cerebrale ipossico-ischemica neonatale. Delinea i passaggi per indurre chirurgicamente l'ischemia e sottoporre l'animale all'ipossia per esacerbare il danno cerebrale. Infine, mostra come valutare le lesioni cerebrali risultanti, assicurando che il modello murino sia preparato per ulteriori indagini scientifiche.

Stabilire un modello murino di lesione cerebrale ipossico-ischemica neonatale

Fonte: Jantzie, L. L., et. al. Modellazione dell'encefalopatia del prematuro utilizzando l'ipossia-ischemia prenatale con lipopolisaccaride intra-amniotico nei ratti. J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra un protocollo per indurre condizioni ipossico-ischemiche e infiammatorie nei ratti fetali limitando il flusso sanguigno uterino e iniettando LPS, modellando la neuroinfiammazione e lo sviluppo cerebrale interrotto rilevanti per gli studi sulla nascita pretermine.

Induzione di condizioni ipossico-ischemiche e infiammatorie per modellare l'encefalopatia nei ratti prenatali

L'encefalopatia ipossico-ischemica a seguito di asfissia perinatale può essere studiata utilizzando modelli animali. Dimostriamo le procedure necessarie per stabilire un modello di suinetto di encefalopatia ipossico-ischemica neonatale.

Un modello di Piglet neonatale Hypoxic-ischemica Encefalopatia

I modelli di ictus tromboembolico sono strumenti vitali per ottimizzare la terapia di ricanalizzazione. Qui riportiamo un modello murino di ictus trombotico basato sull'insulto ipossico-ischemico cerebrale transitorio (tHI), che innesca trombosi e infarto e risponde favorevolmente alla fibrinolisi mediata dall'attivatore del plasminogeno tissutale (tPA) in una finestra terapeutica simile a quelle dei pazienti con ictus.

Un trombotica Stroke modello basato sulla transitoria cerebrale ipossia-ischemia

L'encefalopatia del prematuro comprende le anomalie del sistema nervoso centrale associate a lesioni da parto pretermine. Questo rapporto descrive un modello di ratto clinicamente rilevante di ipossia-ischemia sistemica transitoria in utero e somministrazione intra-amniotica di lipopolisaccaridi (LPS) che imita la corioamnionite e l'impatto correlato degli stimoli infettivi e della sottoperfusione placentare sullo sviluppo del SNC.

Modellazione Encefalopatia di prematurità Utilizzando prenatale ipossia-ischemia con Lipopolisaccaride intra-amniotico in ratti

L'ictus neonatale è una causa significativa di lesione cerebrale precoce che richiede un modello traslazionale con modelli di lesione focale coerenti e un'elevata riproducibilità per consentire lo studio. Questo studio descrive la procedura chirurgica dettagliata per la creazione di una lesione da ischemia-riperfusione focale unilaterale non emorragica nei roditori equivalenti a termine.

Transient Medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale Modello di Stroke neonatale nei ratti P10

Abbiamo effettuato l'occlusione unilaterale dell'arteria carotica postnatale giorno 7-10 CD-1 del mouse cuccioli per creare un modello di (HI) hypoxic-ischemica neonatale e studiato gli effetti del trauma cranico HI. Abbiamo studiato le funzioni neurobehavioral in questi topi rispetto ai topi normali non azionato.

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Questo manoscritto descrive un metodo per registrazioni EEG video continue utilizzando elettrodi di profondità multipli in topi neonatali sottoposti a ipossia-ischemia.

Elettroencefalogramma video continuo durante l'ipossia-ischemia nei topi neonatali

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Il modello di encefalopatia ipossico ischemica di ischemia perinatale

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