Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick
2 febbraio 2009
Questo video dimostra tutta montare immunoistochimica, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale di un antigene può essere visualizzata in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell.
Questo video illustra le diverse fasi dell'immunohistochimica su preparato intero nell'embrione di pollo, utilizzando anticorpi secondari coniugati con la perossidasi di rafano (HRP). Innanzitutto, l'embrione viene fissato in paraformaldeide. Successivamente, l'attività perossidasi endogena viene inibita.
L'embrione viene quindi incubato con un anticorpo primario. Dopo diversi lavaggi, l'embrione viene incubato con un anticorpo secondario coniugato alla HRP; la reazione cromogenica viene rivelata utilizzando il substrato DAB e la colorazione anticorpale appare di colore arancione. Il vantaggio di questo metodo rispetto all'uso di anticorpi fluorescenti consiste nel fatto che gli embrioni possono essere processati per la sezione in paraffina, consentendo così lo studio dei siti antigenici in sezione trasversale.
Ciao, sono Delphine del Laboratorio di FIN presso il Centro di Medicina Ambientale e Genomica di Texas A&M a Houston. Oggi vi mostreremo un procedimento per eseguire immunomarcature con anticorpi marcati con HRP su embrioni di pesce zebra. Utilizziamo questo procedimento in laboratorio per studiare la morfologia degli embrioni dopo il trattamento con farmaci antiepilettici.
Cominciamo. Per eseguire un'immunohistochimica su preparato intero in embrioni di pollo, aprire innanzitutto un uovo colpendo il guscio con una pinzetta ed eliminando pezzi di guscio. Rimuovere l'albume spesso con la pinzetta e inclinare il sacco vitellino con pinzette grossolane in modo che l'embrione risulti rivolto verso l'alto.
Successivamente, utilizzare forbici fini per tagliare un quadrato della sacca vitellina intorno all'embrione. Rimuovere l'embrione dal tuorlo con un cucchiaio e posizionarlo in una piastra contenente PBS sotto un microscopio stereoscopico. Rimuovere con cura le membrane presenti nel tuorlo e trasferire l'embrione in una piastra nuova contenente PBS.
Dopo aver trasferito l'embrione, fissarlo con pinzette e spilli per insetti ed aspirare il PBS. Sostituire con PFA al 4% in PBS e lasciare fissare l'embrione per un'ora a temperatura ambiente per ridurre al minimo il rischio di contaminazione microbica. Utilizzare H2O deionizzata D in tutti i passaggi successivi dopo la fissazione dell'embrione, aspirare la soluzione fissante e smaltirla correttamente come rifiuto chimico.
Riempire la piastra con BS. Successivamente, utilizzando un bisturi da microdissezione, tagliare un quadrato attorno all'embrione per rimuovere le membrane extraembrionali. Rimuovere i perni metallici con pinzette dopo che i perni sono stati tolti. Utilizzare una pipetta Pasteur con estremità smussata per trasferire l'embrione in un vial da scintillazione contenente PBT.
Lavare l'embrione con PBT tre volte per 10 minuti ciascuna. Rimuovere il PBT dal viallo per scintillazione e sostituirlo con PBTX contenente H2O2 0,3% per inattivare la perossidasi endogena potenziale. Incubare per due ore a temperatura ambiente su un agitatore.
Lavare l'embrione con PBT prima tre volte per 10 minuti ciascuna, poi tre volte per 30 minuti ciascuna. Per colorare l'embrione con l'anticorpo, iniziare lavando l'embrione per un'ora in buffer bloccante o in 1% BSA 1% NGS.
Utilizziamo il NGS perché l'anticorpo secondario è prodotto in capra. Incubare sul mutator per un'ora a temperatura ambiente; dopo l'incubazione, diluire l'anticorpo primario uno a uno nel buffer di blocco e incubare l'embrione in questa soluzione per due giorni a quattro gradi Celsius. Sul mutator.
Il fattore di diluizione dell'anticorpo primario dipende dalla scelta dell'anticorpo primario. In questo caso utilizziamo un anticorpo proveniente dalla banca ibridoma per studi dello sviluppo, fornito come super natin. Lo diluiamo in rapporto uno a uno nel buffer di blocco.
Successivamente, eseguire tre lavaggi di 10 minuti ciascuno in PBT seguiti da tre lavaggi di un'ora ciascuno in PBT. Dopo i lavaggi, diluire l'anticorpo secondario uno a 2.500 nel buffer di blocco. In questo caso, anticorpo caprino anti-US IgG coniugato con perossidasi e incubare l'embrione in questa soluzione tutta la notte a quattro gradi Celsius su agitatore.
Eseguire tre lavaggi di 10 minuti ciascuno in PBT seguiti da tre lavaggi di un'ora ciascuno in PBT per sviluppare la reazione cromogenica nell'embrione colorato. Eseguire prima due lavaggi di 20 minuti ciascuno in tampone tris (100 millimolare tris, HCl pH 7,4). Successivamente, rimuovere l'ultimo lavaggio con tampone TS dal vial contenente l'embrione e sostituirlo con cinque millilitri di soluzione DAB.
Mantenerlo al buio sul mutatore per 20 minuti. Smaltire la punta einor nel secchio contenente una soluzione di candeggina al 10%. Per decontaminare il DAB, aggiungere 16 microlitri.
Aggiungere la soluzione madre di H2O2 al vial contenente gli embrioni in DAB. Mantenere al buio. Dopo 10 minuti, osservare la reazione al microscopio quando la reazione cromogenica è completa. Smaltire il DAB nel contenitore con candeggina e sostituirlo con cinque millilitri di soluzione nuova.
Acqua del rubinetto. Successivamente, eseguire due lavaggi in PBS di 10 minuti ciascuna per la preparazione alla ripresa fotografica e al taglio in paraffina. Disidratare l'embrione colorato mediante una serie di etanolo al 25%, 50%, 75% e 100%, per 10 minuti ciascuno.
Dopo la disidratazione, sostituire l'etanolo con 0,5-1 millilitro di olio di legno di cedro. Questo renderà l'embrione traslucido, facilitando la ripresa fotografica nell'olio di legno di cedro. Dopo la ripresa fotografica, riposizionare l'embrione nel vial e sostituire l'olio di legno di cedro con etanolo al 100%.
Infine, sostituire l'etanolo con verde brillante FCF al 5% in etanolo al 100% e incubare per tre minuti. Questo passaggio renderà visibili gli embrioni per l'istologia. Sostituire la soluzione di verde brillante FCF con etanolo al 100% e procedere con l'istologia.
Ecco tre esempi di embrioni colorati. Questi embrioni allo stadio 11 sono etichettati con 15.3 B nine o meno. Uno specifico anticorpo per la corda nodale sviluppato nel laboratorio di Jane dod e Tom Gessel.
Dopo due minuti in DAB, l'embrione è ancora trasparente. Dopo 20 minuti in DAB, appare una leggera marcatura nel cordone nodale. Infine, dopo 40 minuti, la marcatura del cordone nodale è completa.
In questo esempio, mostriamo come PAC sette, un anticorpo sviluppato nel laboratorio di Tom Jessel, riconosca le fasi iniziali della chiusura del tubo neurale nonché le cellule della cresta neurale cranica provenienti dal mesencefalo. Qui l'embrione è marcato con la sonda Croc 20 del laboratorio di David Wilkinson, seguita non da un singolo anticorpo. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire l'immunohistochimica su embrioni interi.
Questa procedura può essere utilizzata anche su embrioni che sono stati precedentemente trattati per ibridazione in situ su preparato intero. In questo caso, fissare brevemente l'embrione per un'ora dopo l'ibridazione in situ e quindi procedere con la colorazione immunoistochimica. Ecco fatto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo video illustra l'immunohistochimica su preparato intero, una tecnica utilizzata per visualizzare i modelli di espressione spaziale e temporale di antigeni in embrioni di pollo giovani. Il metodo comprende diversi passaggi, tra cui la fissazione e l'incubazione con anticorpi, per rivelare i risultati della colorazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Immunoeistochimica
Sfondo
- L'immunohistochimica su preparato intero permette lo studio della distribuzione degli antigeni negli embrioni.
- Questa tecnica è stata inizialmente introdotta da Jane Dodd e Tom Jessell.
- Fornisce informazioni sui processi di sviluppo e sull'espressione genica.
- Gli anticorpi secondari coniugati con la perossidasi di rafano (HRP) potenziano la visualizzazione degli antigeni.
Scopo dello studio
- Mostrare la procedura di immunohistochemia su preparato intero.
- Visualizzare l'espressione dell'antigene negli embrioni di pollo.
- Confrontare i vantaggi di questo metodo rispetto alle tecniche con anticorpi fluorescenti.
Metodi Utilizzati
- Fissazione degli embrioni in paraformaldeide.
- Eliminazione dell'attività perossidasi endogena.
- Incubazione con anticorpi primari e secondari.
- Reazione cromogenica rivelata mediante substrato DAB per la visualizzazione.
Risultati principali
- La colorazione con anticorpi appare arancione, indicando un rilevamento dell'antigene avvenuto con successo.
- Gli embrioni possono essere processati per la sezione in paraffina dopo la colorazione.
- Questo metodo permette studi trasversali dei siti antigenici.
- Dimostra l'efficacia degli anticorpi coniugati con HRP nella colorazione.
Conclusioni
- L'immunohistochimica su preparato intero è una tecnica preziosa per lo studio degli embrioni di pollo.
- Fornisce una chiara visualizzazione dei modelli di espressione degli antigeni.
- Il metodo è vantaggioso per successive analisi istologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'immunohistochimica su preparati interi in embrioni di pollo consente la mappatura spaziale dell'espressione degli antigeni, supportando la validazione degli obiettivi in neuroscienze dello sviluppo. Il metodo offre una riduzione del rischio meccanicistica collegando bersagli molecolari a risultati fenotipici in un sistema rilevante per la malattia. La compatibilità con la sezionatura in paraffina permette ai gruppi di lavoro multidisciplinari di correlare i dati immunohistochimici con l'analisi istologica, migliorando la continuità traslazionale nella valutazione preclinica dei bersagli.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione della distribuzione dell'antigene nel tubo neurale e nei somiti in via di sviluppo.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico attraverso l'osservazione diretta dell'interazione con il bersaglio in embrioni integri.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia sul bersaglio fornendo dati di espressione con risoluzione spaziale per l'identificazione dei composti promettenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera pattern di colorazione standardizzati e riproducibili utilizzando anticorpi secondari coniugati con perossidasi (HRP) e substrato DAB.
- Output quantitativo: Consente una valutazione semi-quantitativa dei siti antigenici tramite l'intensità del colore, supportando l'ottimizzazione del saggio.
- Riutilizzo della piattaforma: Compatibile con la sezionatura in paraffina, consentendo che lo stesso campione colorato possa essere utilizzato in molteplici flussi analitici successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Applicabile allo studio degli effetti embriotossici di composti, come farmaci antiepilettici, in un modello vertebrale.
- Continuità traslazionale: Collega la fase di scoperta a quella preclinica consentendo un tracciamento coerente dell'antigene tra preparati interi e sezioni.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce se i fenotipi osservati si correlano con la modulazione del bersaglio nei tessuti in via di sviluppo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta e preclinico, sostenendo le fasi iniziali di validazione del bersaglio e di sviluppo dei saggi prima dell'ottimizzazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi rivelando l'espressione spaziotemporale dell'antigene nel cervello in via di sviluppo e nel tubo neurale.
- Screening: Fornisce letture standardizzate di immunohistochimica che supportano la valutazione riproducibile di composti in sistemi embrionali.
- Analisi: Produce un segnale cromogenico rilevabile mediante microscopia in campo chiaro, consentendo l'analisi quantitativa delle immagini per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento dei biomarcatori permettendo di convalidare la localizzazione dell'antigene sia in preparati interi che in sezioni istologiche.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una piattaforma riutilizzabile dotata di capacità istologiche, applicabile in diversi progetti volti allo studio della tossicità dello sviluppo o dell'espressione del bersaglio.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando la presenza dell'antigene a strutture embrionali specifiche.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso passaggi standardizzati di fissazione, bloccaggio e incubazione con anticorpi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo una conferma istologica della modulazione del bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base al profilo di interazione con bersagli nello sviluppo, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione di embrioni, nell'immunohistochimica e nella rivelazione cromogenica.
- È subordinato all'accesso a microscopi, mutatori e sistemi di ventilazione per la manipolazione di DAB e H2O2.
- Necessita di standardizzazione delle diluizioni degli anticorpi e dei protocolli di lavaggio tra i diversi gruppi di lavoro.
- L'adattamento ad altre specie potrebbe richiedere un'ottimizzazione dei passaggi di permeabilizzazione e di bloccaggio.
- I limiti pratici includono tempi di incubazione più lunghi e la necessità di smaltire con attenzione il DAB per prevenire artefatti.
