Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick
2 febbraio 2009
Questo video dimostra tutta montare immunoistochimica, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale di un antigene può essere visualizzata in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell.
Questo video mostra le diverse fasi dell'immunoistochimica dell'intero Mount in embrioni di pollo utilizzando anticorpi secondari coniugati HRP. In primo luogo, l'embrione viene fissato nella paraformaldeide. Quindi l'attività endogena della perossidasi viene estinta.
L'embrione viene quindi incubato in anticorpi primari. Dopo diversi lavaggi, l'embrione viene incubato in anticorpi secondari coniugati alla reazione cromatica HRP viene rivelata utilizzando il substrato DAB e la colorazione degli anticorpi appare arancione. Il vantaggio di questo metodo rispetto all'uso di anticorpi fluorescenti è che gli embrioni possono essere processati per il sezionamento in cera, consentendo così lo studio dei siti antigenici in sezione trasversale.
Ciao, sono Delphine del Laboratorio di FIN presso il Center for Environmental and Genomic Medicine at Texas a and m a Houston. Oggi vi mostreremo una procedura per eseguire anticorpi ormonali, colorazioni in embrioni di guance utilizzando anticorpi coniugati HRP. Utilizziamo questa procedura in laboratorio per studiare la morfologia degli embrioni dopo il trattamento con farmaci antiepilettici.
Quindi iniziamo a eseguire l'immunoistochimica dell'intera montatura su embrioni di pollo. Per prima cosa apri un uovo picchiettando il guscio con una pinza e rimuovendo i pezzi del guscio. Rimuovere l'albumina densa con una pinza e inclinare il sacco vitellino con una pinza grossa in modo che l'embrione sia rivolto verso l'alto.
Quindi unisci le forbici sottili per tagliare un quadrato di sacco vitellino attorno all'embrione. Rimuovere l'embrione dal tuorlo con un cucchiaio e metterlo in un piatto contenente PBS al microscopio da dissezione. Rimuovere con cura le membrane nel tuorlo e trasferire l'embrione in un piatto fresco contenente PBS.
Dopo aver trasferito l'embrione, bloccarlo con una pinza e spilli per insetti e aspirare il PBS. Sostituiscilo con il 4% di PFA in PBS e lascia che l'embrione fissi un'ora a temperatura ambiente per ridurre al minimo la potenziale contaminazione microbica. Utilizzare D deionizzato H2O quando tutti i passaggi successivi dopo che l'embrione è stato fissato, aspirare la soluzione fissativa e smaltire correttamente come rifiuto chimico.
Riempi il piatto con BS. Successivamente, usando un coltello da microdissezione, taglia un quadrato attorno all'embrione per rimuovere le membrane embrionali in eccesso. Rimuovere i perni degli insetti con una pinza dopo che i perni sono stati rimossi. Utilizzare una pipetta da pascolo smussata per trasferire l'embrione in una fiala a scintillazione contenente PBT.
Lavare l'embrione con PBT tre volte per 10 minuti ciascuna. Rimuovere il PBT dal flaconcino di scintillazione e sostituirlo con PBTX contenente lo 0,3% di H 2 0 2 per inattivare la potenziale perossidasi endogena. Incubare per due ore a temperatura ambiente su un mutatore.
Lavare l'embrione con PBT prima tre volte per 10 minuti ciascuna, poi tre volte per 30 minuti ciascuna. Colorare l'embrione con anticorpi. Inizia lavando l'embrione per un'ora in tampone bloccante o 1% BSA 1% NGS.
Usiamo l'NGS perché l'anticorpo secondario viene allevato nella capra. Incubare il mutatore per un'ora a temperatura ambiente dopo l'incubazione, diluire l'anticorpo primario uno a uno nel tampone bloccante e incubare l'embrione in questa soluzione per due giorni a quattro gradi Celsius. Sul mutatore.
Il fattore di diluizione degli anticorpi primari dipende dalla scelta dell'anticorpo primario. Qui utilizziamo un anticorpo proveniente dagli studi sullo sviluppo ibrido DOMA bank, che viene fornito come super natin. Lo diluiamo uno a uno nel tampone di blocco.
Successivamente, eseguire tre lavaggi di 10 minuti in PBT seguiti da tre lavaggi di un'ora in PBT. Dopo il lavaggio, diluire l'anticorpo secondario da uno a 2.500 in tampone bloccante. In questo caso, la perossidasi coniugata capra anti-US IgG e incubare l'embrione in questa soluzione durante la notte a quattro gradi Celsius sul mutatore.
Eseguire tre lavaggi di 10 minuti in PBT seguiti da tre lavaggi di un'ora in PBT per sviluppare la reazione cromatica dell'embrione colorato. Primi due lavaggi di 20 minuti in tris tampone 100 millimolare, HCL pH 7,4. Successivamente, rimuovere l'ultimo lavaggio tampone TS dalla fiala contenente l'embrione e sostituirlo con cinque millilitri di soluzione DAB.
Tienilo al buio sul mutageno per 20 minuti. Smaltire la punta dell'einor nel secchio contenente una soluzione di candeggina al 10%. Per decontaminare il DAB, aggiungere 16 microlitri.
Stock H 2 0 2 alla fiala contenente gli embrioni in DAB. Tenerlo al buio Dopo 10 minuti, monitorare la reazione al microscopio quando la reazione cromatica è completa. Smaltire il DAB in un secchio di candeggina, sostituirlo con cinque millilitri.
acqua del rubinetto. Successivamente, eseguire due lavaggi di 10 minuti in PBS per elaborare la fotografia e il sezionamento della cera. Disidratare l'embrione colorato in una serie di etanolo, 25%50%75% e 100% per 10 minuti ciascuno.
Dopo la disidratazione, sostituire l'etanolo con olio di cedro da 0,5 a un millilitro. Questo renderà il processo di traslucidità dell'embrione per la fotografia in olio di legno di cedro. Dopo la fotografia, rimettere l'embrione nella fiala e sostituire l'olio di legno di cedro con etanolo al 100%.
Infine, sostituire l'etanolo con il 5% di FCF verde veloce in etanolo al 100% e incubare per tre minuti. Questo passaggio renderà gli embrioni visibili per l'istologia. Sostituire la soluzione Fast Green FCF con etanolo al 100% e procedere per l'istologia.
Ecco tre esempi di embrioni colorati. Questi embrioni allo stadio 11 sono etichettati con 15.3 B nove o meno. Uno è un anticorpo specifico per il cordone linfonodale sviluppato nel laboratorio di Jane Dod e Tom Gessel.
Dopo due minuti in DAB, l'embrione è ancora trasparente. Dopo 20 minuti in DAB, appare una leggera etichettatura nel cordone nodale. Infine, dopo 40 minuti, l'etichettatura del cordone nodale è completa.
In questo esempio, mostriamo come il PAC sette, un anticorpo sviluppato nel laboratorio di Tom Jessel, riconosce le prime fasi della chiusura del tubo neurale e le cellule della cresta neurale cranica che emergono dal mesencefalo. Qui l'embrione viene etichettato con la sonda Croc 20 del laboratorio di David Wilkinson, seguita da nessun anticorpo. Ti abbiamo appena mostrato come eseguire l'immunoistochimica a montatura intera senza controllo degli embrioni.
Questa procedura può essere utilizzata anche su embrioni che sono stati precedentemente processati per l'ibridazione in situ a montatura intera. In questo caso, fissare brevemente l'embrione per un'ora dopo l'ibridazione in situ e poi procedere con la colorazione degli anticorpi. Quindi questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo video illustra l'immunohistochimica su preparato intero, una tecnica utilizzata per visualizzare i modelli di espressione spaziale e temporale di antigeni in embrioni di pollo giovani. Il metodo comprende diversi passaggi, tra cui la fissazione e l'incubazione con anticorpi, per rivelare i risultati della colorazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Immunoeistochimica
Sfondo
- L'immunohistochimica su preparato intero permette lo studio della distribuzione degli antigeni negli embrioni.
- Questa tecnica è stata inizialmente introdotta da Jane Dodd e Tom Jessell.
- Fornisce informazioni sui processi di sviluppo e sull'espressione genica.
- Gli anticorpi secondari coniugati con la perossidasi di rafano (HRP) potenziano la visualizzazione degli antigeni.
Scopo dello studio
- Mostrare la procedura di immunohistochemia su preparato intero.
- Visualizzare l'espressione dell'antigene negli embrioni di pollo.
- Confrontare i vantaggi di questo metodo rispetto alle tecniche con anticorpi fluorescenti.
Metodi Utilizzati
- Fissazione degli embrioni in paraformaldeide.
- Eliminazione dell'attività perossidasi endogena.
- Incubazione con anticorpi primari e secondari.
- Reazione cromogenica rivelata mediante substrato DAB per la visualizzazione.
Risultati principali
- La colorazione con anticorpi appare arancione, indicando un rilevamento dell'antigene avvenuto con successo.
- Gli embrioni possono essere processati per la sezione in paraffina dopo la colorazione.
- Questo metodo permette studi trasversali dei siti antigenici.
- Dimostra l'efficacia degli anticorpi coniugati con HRP nella colorazione.
Conclusioni
- L'immunohistochimica su preparato intero è una tecnica preziosa per lo studio degli embrioni di pollo.
- Fornisce una chiara visualizzazione dei modelli di espressione degli antigeni.
- Il metodo è vantaggioso per successive analisi istologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'immunohistochimica su preparati interi in embrioni di pollo consente la mappatura spaziale dell'espressione degli antigeni, supportando la validazione degli obiettivi in neuroscienze dello sviluppo. Il metodo offre una riduzione del rischio meccanicistica collegando bersagli molecolari a risultati fenotipici in un sistema rilevante per la malattia. La compatibilità con la sezionatura in paraffina permette ai gruppi di lavoro multidisciplinari di correlare i dati immunohistochimici con l'analisi istologica, migliorando la continuità traslazionale nella valutazione preclinica dei bersagli.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione della distribuzione dell'antigene nel tubo neurale e nei somiti in via di sviluppo.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico attraverso l'osservazione diretta dell'interazione con il bersaglio in embrioni integri.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia sul bersaglio fornendo dati di espressione con risoluzione spaziale per l'identificazione dei composti promettenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera pattern di colorazione standardizzati e riproducibili utilizzando anticorpi secondari coniugati con perossidasi (HRP) e substrato DAB.
- Output quantitativo: Consente una valutazione semi-quantitativa dei siti antigenici tramite l'intensità del colore, supportando l'ottimizzazione del saggio.
- Riutilizzo della piattaforma: Compatibile con la sezionatura in paraffina, consentendo che lo stesso campione colorato possa essere utilizzato in molteplici flussi analitici successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Applicabile allo studio degli effetti embriotossici di composti, come farmaci antiepilettici, in un modello vertebrale.
- Continuità traslazionale: Collega la fase di scoperta a quella preclinica consentendo un tracciamento coerente dell'antigene tra preparati interi e sezioni.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce se i fenotipi osservati si correlano con la modulazione del bersaglio nei tessuti in via di sviluppo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta e preclinico, sostenendo le fasi iniziali di validazione del bersaglio e di sviluppo dei saggi prima dell'ottimizzazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi rivelando l'espressione spaziotemporale dell'antigene nel cervello in via di sviluppo e nel tubo neurale.
- Screening: Fornisce letture standardizzate di immunohistochimica che supportano la valutazione riproducibile di composti in sistemi embrionali.
- Analisi: Produce un segnale cromogenico rilevabile mediante microscopia in campo chiaro, consentendo l'analisi quantitativa delle immagini per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento dei biomarcatori permettendo di convalidare la localizzazione dell'antigene sia in preparati interi che in sezioni istologiche.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una piattaforma riutilizzabile dotata di capacità istologiche, applicabile in diversi progetti volti allo studio della tossicità dello sviluppo o dell'espressione del bersaglio.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando la presenza dell'antigene a strutture embrionali specifiche.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso passaggi standardizzati di fissazione, bloccaggio e incubazione con anticorpi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo una conferma istologica della modulazione del bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base al profilo di interazione con bersagli nello sviluppo, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione di embrioni, nell'immunohistochimica e nella rivelazione cromogenica.
- È subordinato all'accesso a microscopi, mutatori e sistemi di ventilazione per la manipolazione di DAB e H2O2.
- Necessita di standardizzazione delle diluizioni degli anticorpi e dei protocolli di lavaggio tra i diversi gruppi di lavoro.
- L'adattamento ad altre specie potrebbe richiedere un'ottimizzazione dei passaggi di permeabilizzazione e di bloccaggio.
- I limiti pratici includono tempi di incubazione più lunghi e la necessità di smaltire con attenzione il DAB per prevenire artefatti.
