Una tecnica per la raccolta seriale del liquido cerebrospinale dalla Magna Cisterna in Mouse

La procedura inizia con l'anestetizzazione del topo e la preparazione del sito chirurgico. Il topo viene quindi posizionato prono sullo strumento stereotassico. Un'incisione sagittale della pelle è stata praticata inferiormente all'occipite e il tessuto sottocutaneo e i muscoli del collo attraverso la linea mediana sono separati senza mezzi termini.

Quindi la parte posteriore del corpo viene distesa in modo che il corpo formi un angolo di 135 gradi con la testa fissa, la dura madre dello sterno magna CI viene penetrata con il capillare di vetro e il liquido cerebrospinale verrà raccolto. Dopo il campionamento del liquido cerebrospinale, i muscoli vengono riallineati e la pelle viene suturata, circa un millilitro di soluzione salina di NACL allo 0,9% viene iniettato per via sottocutanea per prevenire la disidratazione e il topo viene tenuto al caldo fino a quando non si riprende. Ciao, mi chiamo Liu e vengo dal laboratorio della dottoressa Karen Duff presso il Top Institute della Columbia University.

Oggi ti mostrerò come raccogliere la colonna vertebrale cerebrale del liquido dal sistema mag del topo. Con questa tecnica, possiamo raccogliere campioni seriali di liquido cerebrospinale fino a tre volte dallo stesso topo con un intervallo di due o tre mesi. Nel nostro laboratorio, utilizziamo questa tecnica per determinare i livelli di CSFA beta o tau a diverse età dei nostri modelli murini transgenici di Alzheimer e correliamo questi valori con quelli del cervello.

Infine, siamo interessati al potenziale dei livelli di CSFA beta o tau come potenziali marcatori biologici per la progressione della malattia e anche per gli studi terapeutici nei topi. Quindi iniziamo. Per questa procedura, è necessario realizzare dei capillari con una micro pipetta polare.

I capillari utilizzati qui sono in vetro silicato BOA B 175 10 di Sutter Instruments che tira i capillari su una micropipetta Sutter P 87 flaming polar con l'indice di calore impostato a 300 e l'indice di pressione impostato a tre 30. Il capillare di vetro è lungo cinque centimetri e ha una punta affusolata. La punta del capillare viene tagliata con le forbici in modo che il suo diametro interno sia di circa 0,5 millimetri.

La procedura chirurgica inizia con l'anestetizzazione del topo con ketamina 100 milligrammi per chilogrammo e xilazina 10 milligrammi per chilogrammo somministrata per via intraperitoneale durante l'anestesia, mantenendo il topo riscaldato in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo aver determinato che l'animale è completamente anestetizzato con un riflesso di ritiro del pizzico del dito del piede, rasare il collo, quindi posizionare il mouse sullo strumento stereotassico come questo di David kink. A diretto contatto con il termoforo, inserire una sonda di temperatura rettale in modo che il calore del tappetino possa essere regolato in base alla temperatura corporea del mouse.

Fissare la testa con gli adattatori per la testa, tamponare la pelle del collo con il 10% di iodio povidone e il 70% di etanolo tre volte e praticare un'incisione sagittale inferiore alla parte posteriore della testa o dell'occipite. I passaggi successivi devono essere eseguiti al microscopio da dissezione utilizzando una pinza smussata. Separare il tessuto sottocutaneo e i muscoli M dai servizi ventori e M retto capita dorsale grande in modo che la dura dello sterno grande sia esposta Utilizzare correttamente un paio di micro divaricatori per tenere separati i muscoli.

Infine, appoggia il mouse con la testa a un angolo di 135 gradi rispetto al corpo. Il mouse è ora pronto per la raccolta del liquido cerebrospinale. Questa tecnica di raccolta del liquido cerebrospinale dallo sterno Magno è stata pubblicata in precedenza.

C figura uno A al microscopio di dissezione. La dura madre appare come un triangolo inverso scintillante e chiaro attraverso il quale sono visibili il midollo allungato e un vaso sanguigno principale. Arteria durale, spinella C, figura uno, B.Si può vedere la pulsazione circolatoria del midollo e dello spazio liquorale adiacente.

Asciugare la dura con un batuffolo di cotone sterile, penetrare nel capillare nello sterno magna CI attraverso la dura dura laterale agli spinelli dell'arteria dorsale. Ci sarà un notevole cambiamento nella resistenza quando il capillare viene inserito correttamente e il liquido cerebrospinale fluirà quindi nel capillare. Dopo che il liquido cerebrospinale è stato raccolto, rimuovere con cura il capillare e collegarlo con una siringa da tre millilitri utilizzando un tubo di polietilene con un diametro interno di un millimetro.

Iniettare il liquido cerebrospinale in una provetta da 0,5 millilitri. Etichettare il tubo e congelarlo immediatamente su ghiaccio secco. Una volta congelato, trasferisci il liquido cerebrospinale in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.

La tecnica di campionamento appena dimostrata è estremamente delicata e consente di prelevare successivi campioni di liquido cerebrospinale dallo stesso topo nell'arco di due o tre mesi di intervallo. Pertanto, dopo il campionamento del collo, i muscoli e la pelle devono essere riallineati e chiusi con punti di sutura. Dopo che l'incisione è stata suturata, iniettare circa un millilitro di soluzione salina 0,9% NACL per via sottocutanea per reidratare il topo.

Mantieni il mouse riscaldato a circa 37 gradi Celsius fino a quando non si riprende. Monitora il suo peso il primo giorno e il settimo giorno dopo l'intervento chirurgico. Ti ho appena mostrato come raccogliere il liquido cerebrospinale dal sistema mag del topo.

Quando si esegue questa procedura, ci sono tre cose importanti da ricordare. Per prima cosa, posiziona correttamente la testa e il corpo del topo sul telaio stereotassico in modo che l'ator del Cy Magna possa essere esposto il più possibile. In secondo luogo, evitare accuratamente i vasi sanguigni quando si penetra il durometro con il capillare.

In caso contrario, il campione verrà contaminato dal sangue. Ultimo ma non meno importante, ricordati di tenere i topi al caldo durante l'intera procedura per prevenire l'ipotermia. L'ipotermia non è solo dannosa per i topi, ma può anche influenzare in modo significativo i risultati inducendo una produzione beta o una relazione di ipofosforilazione alta.

Ok, questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.