Name: Protocollo per la coltura neuroni simpatico da Rat gangli cervicale superiore (SCG) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Impara a isolare e coltivare neuroni simpatici primari dai gangli cervicali superiori di cuccioli di ratto neonati. Questo protocollo utilizza trattamento enzimatico e piastre rivestite con collagene per studi neurobiologici.

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NZ ringrazia laboratorio membri Subhas Biswas, Andrew Sproul, e Ryan Willet per la formazione lei in dissezione e la raccolta neuroni simpatici. Supportato anche da finanziamenti del NIH-NINDS.

1. Preparazione per la dissezione: <ol><li> Selezionare il piatto appropriata cultura (10 cm o piastre 6-24-bene o bene, ecc) a seconda della natura dei vostri esperimenti, e il cappotto con coda di topo collagene 24 ore prima della dissezione. I metodi per la preparazione di ratto coda di collagene e di utilizzarlo per i piatti della cultura cappotto sono stati descritti altrove (1). </li><li> Preparare una soluzione di tripsina 0,25% in tampone fosfato (PBS) (nessun EDTA) e filtro sterilizzare. Preparare 1 ml di aliquote e conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare una soluzione contenente 2,5 mM ciascuno di uridina e 5-FDU in distillata / deionizzata H 2 O. Filtro-sterilizzare e preparare aliquote di 50 microlitri. Conservare a -20 º C. </li><li> Preparare Completa Media: terreno di coltura RPMI 1640 con 10% di siero siero di cavallo (calore inattivare incubando in un 56 º C bagnomaria per 30 minuti) e il 5% di siero fetale bovino. </li><li> Preparare finale Medio: terreno di coltura RPMI 1640 con 1% di siero siero di cavallo + NGF (concentrazione 100ηg/ml finale) + penicillina / streptomicina (1 / 250) + 1 / 250 soluzione uridine/5-FDU (10 microM concentrazione finale) . Nota: questo mezzo dovrebbero essere costituito fresca prima di utilizzare ogni volta. Per un esperimento in un 24-ben formato piatto, si dovranno preparare 12 ml di questo mezzo. Si raccomanda di preparare un piccolo extra. NGF può essere acquistato da una varietà di fonti commerciali (vedi tabella alla fine di questo protocollo). </li><li> Attrezzatura: Uno avrà bisogno di un microscopio da dissezione e fonte di luce. Un doppio illuminatore in fibra ottica a collo d&#39;oca con punte di messa a fuoco è preferito. Inoltre, si dovranno pulire e sterilizzare (in autoclave o immersione in etanolo al 70% per almeno 20 minuti) i seguenti strumenti di dissezione: due coppie di micro-dissezione pinze in acciaio inox, e un paio di forbici da dissezione (anche in acciaio inox e sia da Roboz). Due aghi da siringa sterile (26 gague x 1 ½ pollici o simili) sarà anche necessario. E &#39;necessario configurare un&#39;area dissezione, che è un 3 pezzi &quot;x3&quot; di polistirolo avvolto in un foglio di alluminio e ricoperta da una Kimwipe. Spruzzare la scheda con il 70% di etanolo per la decontaminazione. Infine, la preparazione del falò lucidato pascolo pipetta di vetro. Al fine di fuoco lucidare, prendere la pipetta di vetro e tenere la punta della fiamma per alcuni secondi, durante la rotazione. Al momento dell&#39;ispezione, la punta sarà più liscia e l&#39;apertura sarà più stretta. Ciò è necessario per il passaggio in cui le cellule saranno dissociate. Eseguire fuoco lucidatura in una cappa di coltura cellulare in modo che la pipetta rimane sterile. </li></ol> 2. Dissezione di Superiore gangli cervicali: <ol><li> Raccogliere cuccioli di ratto neonatale che sono di età P0 e P1. </li><li> Rapidamente strofinare il cucciolo per dissezione con il 70% di etanolo per ridurre la probabilità di contaminazione. </li><li> Rapidamente decapitare cucciolo con un paio di forbici affilate (questo passaggio non sarà mostrato nel video). Tenere la testa con pinza sterile contro garza sterile per drenare brevemente il sangue in eccesso. </li><li> Posizionare la testa sul pad dissezione con il lato ventrale rivolto verso l&#39;alto e la fine caudale orientata verso di voi. La trachea reciso deve essere facilmente visibile. Utilizzare gli aghi siringa sterile per proteggere la testa mozzata al pad dissezione nel modo seguente: spingere un pin anche se il tetto della bocca nel tappetino e spingere il secondo perno se reciso la trachea nel pad. Posizionare il cuscinetto sotto il microscopio da dissezione e iniziare la dissezione. </li><li> Utilizzando entrambe le pinze (una in ogni mano) la pelle chiara di distanza e grasso intorno alla trachea, facendo attenzione a non andare troppo in profondità. In questo modo si espongono un paio di muscoli correndo quasi parallele l&#39;una all&#39;altra su entrambi i lati della trachea. Nota: durante la dissezione, è necessario irrigare con acqua fredda PBS sterile o freddo, i livelli di free RPMI 1640 medium consegnato con una sterile, pipetta Pasteur per lavare via il sangue in eccesso e per mantenere l&#39;area pulita e umida. Ciò può essere fatto solo una volta o più volte a seconda di quanto velocemente si lavora. Per un dissettore esperienza, ci vogliono solo circa 2-3 minuti per sezionare fuori un paio di gangli. </li><li> Utilizzare le pinze per tagliare e rimuovere il muscolo da una parte per primo. </li><li> Una volta che il muscolo viene rimosso, l&#39;arteria carotide diventerà visibile. Spesso è la luce rosata e contiene sangue. Può apparire di colore più chiaro di altri vasi sanguigni che si può vedere nelle vicinanze e per questo motivo l&#39;arteria carotide può non essere evidente subito. Questa arteria costeggia la trachea e si biforca in quella che sembra una &quot;Y&quot; a forma di nastro. Questa biforcazione è un importante punto di riferimento e, una volta individuato, sarà relativamente facile trovare il SCG. </li><li> Recidere l&#39;arteria alla fine più caudale e sollevarla leggermente con la pinza (l&#39;altra estremità è ancora attaccato). Una volta fatto questo, vedrai una forma di mandorla, lucida massa alla ricerca di piccole di tessuto che è vagamente collegato al arteria proprio nel punto di biforcazione e che ha thread-come pre-e / o post-gangliari connettivi. Questo è il ganglio cervicale superiore. Usare un secondo paio di pinze con l&#39;altra mano per staccare delicatamente e mettere in un piatto cultura piccolo (35 mm) contenenti freddo, i livelli di free RPMI 1640 medium. </li><li> Successivamente, estrarre il ganglio sull&#39;altro lato della trachea seguendo lo stesso protocollo. </li></ol> 3. Pulizia dei gangli: <ol><li> Una volta che tutti i gangli sono state asportate, dovrebbero essere liberati il ​​più possibile di tessuti estranei. </li><li> Sotto il microscopio dissezione, si può vedere che i gangli hanno attaccato i pezzi di carotide, tessuto adiposo o altro. Lavora con pinze in ogni mano per prendere in giro via questi materiali indesiderati. Luogo pulito gangli in una sterile 15 ml conica, tubo di polipropilene, contenente RPMI 1640 medium. </li><li> I connettivi pre e / o post-gangliari deve essere tagliato via. Ogni ganglio ha circa 10.000 neuroni. Una volta che i neuroni sono placcati, saranno ricrescere i loro neuriti. </li></ol> 4. Stabilire cultura Simpatico Neuron: <ol><li> Centrifugare i gangli a 200xg per 2 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere i gangli in 0,5 a 1 ml di soluzione tripsina 0,25%. Posto a 37 ˚ C a bagno-maria o incubatore per 30 minuti. Questo aiuterà dissociare le cellule nei gangli. </li><li> Dopo 30 minuti, aggiungere 10 ml di terreno completo per diluire fuori e neutralizzare la tripsina e centrifugare a 200xg per 2 minuti. </li><li> Gettare il surnatante e risospendere in 2 ml di media finale. </li><li> Ulteriori dissociare le cellule dei gangli triturazione su e giù con il fuoco lucidato pascolo pipetta di vetro. Triturare i gangli 20 volte e posizionare il tubo in ghiaccio per qualche minuto. </li><li> Nel frattempo, il fuoco, lucidare la pipetta di più per rendere l&#39;apertura più stretta (circa 2 / 3 a 1 / 2 mm di diametro). Attendere qualche minuto fino a quando si raffredda e triturare i gangli 20 volte di più. Come si continua, il medium diventa progressivamente più nuvolosa indicando che le cellule vengono dissociate. Ripetere questa operazione una o due volte più a seconda di quanto bene le cellule si dissociano. Dopo qualche tempo, noterete che tutti i gangli sono dissociate in neuroni dei gangli intatto e non sono visibili nel tubo. Ci possono essere alcuni materiali tessuto che non si dissociano. A questo punto, lasciare che il tubo di sedersi in ghiaccio per qualche minuto in modo che i detriti non dissociato possono depositarsi sul fondo. Ora attentamente raccogliere quasi tutti i media dalla parte superiore e luogo in un altro tubo. Per assicurarsi di non raccogliere i detriti non dissociato, lasciare circa 50 microlitri sul fondo della provetta. Aggiungere più del mezzo finale per il tubo contenente cellule dissociate: questo volume dipende dal tipo di targa una cultura sta usando per la cultura i neuroni. Ad esempio: se un 24-ben piatto è da utilizzare, poi piatto 0,5 gangli per bene (~ 10.000 neuroni per pozzetto) in 0,5 ml di terreno finale per pozzetto. Un disordine ratto tipico consiste di 12 cuccioli, che darebbe 24 gangli. Questo è sufficiente per seminare uno a 24 pozzetti e il volume totale dei media finale è di 12 ml. Nota: i gangli contengono anche una piccola popolazione di cellule gliali e altri tipi di cellule che saranno presenti nella cultura. Utilizzando Uridine/5-FDU nel medio finale impedisce la loro proliferazione e promuovere la loro morte. </li><li> Nutrire le cellule ogni 48 ore, sostituendo 2 / 3 del mezzo con fresco RPMI +1% siero di cavallo + NGF e uridine/5-FDU. Nota: In un primo momento, la cultura contiene neuroni simpatici che guardano intorno senza neuriti. Neuriti breve diventano visibili 24 ore dopo la dissezione e progressivamente diventano più densi e più ramificate nel tempo. </li></ol>

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. (1998).</li>
<li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li>
<li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nerve+Growth+Factor%3A+purification+as+a+30%2C000-molecular-weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li>
<li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chat+in+the+Trophic+Web%3A+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li>
<li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+%28NGF%29+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li>
<li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).</li>
<li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Noi usiamo ratti Sprague Dawley per le nostre culture. Prendetevi il tempo e attenzione durante la pulizia dei gangli. Rimuovere tutti, detriti vasi sanguigni e grasso. Questo passo è importante per garantire una cultura che è più o meno omogeneo e privo di tipi di cellule estranee. L&#39;aggiunta di uridine/5-FDU in gran parte eliminare eventuali cellule rimanenti non neuronali (mitosi) che contaminano la cultura, o almeno sopprimere la proliferazione. Inoltre, durante la fase di dissociazione, di pazienza e il tempo di sep...

<table><tbody><tr><td>Pinzette, acciaio inossidabile #5</td><td>Strumento</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4976</td><td></td></tr><tr><td>Forbici, DEAVER dritte con lame affilate-smussate da 43 mm - 5,5</td><td>Strumento</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6760</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 con L-Glutamina</td><td>Reagente</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Reagente</td><td>SAFC Global</td><td>12103c</td><td></td></tr><tr><td>Siero equino da donatore</td><td>Reagente</td><td>JRH Biosciences</td><td>12449</td><td>Inattivare termicamente incubando in bagnomaria a 56&amp;#x00B0;C per 30 minuti.</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina senza EDTA</td><td>Reagente</td><td>Difco Laboratories</td><td>MT 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-5&amp;rsquo; deossiuridina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8791</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reagente</td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per dissezione e sorgente luminosa</td><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette in polipropilene da 15 ml</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari</td><td>Strumento</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocollo per la coltura neuroni simpatico da rat gangli cervicale superiore (scg)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

I gangli cervicale superiore (SCG) nei ratti sono piccole, lucide, a mandorla strutture che contengono neuroni simpatici. Questi neuroni fornire innervazioni simpatico per la testa e del collo e costituiscono una popolazione ben caratterizzato e relativamente omogenea (4). Neuroni simpatici dipendono dal fattore di crescita nervosa (NGF) per la crescita sopravvivenza, differenziazione e assonale e la diffusa disponibilità di NGF facilita la loro cultura e la manipolazione sperimentale (2, 3, 6). Per queste ragioni, colture di neuroni simpatici sono stati utilizzati in una vasta gamma di studi tra cui lo sviluppo neuronale e la differenziazione, i meccanismi della morte cellulare programmata e patologiche, e trasduzione del segnale (1, 2, 5 e 6). Sezionare la SCG di ratto appena nati e dei neuroni simpatici coltura non è molto complicata e può essere imparato abbastanza rapidamente. In questo articolo, descriveremo in dettaglio come sezionare la SCG da cuccioli di ratto appena nati e di utilizzarle per stabilire le culture di neuroni simpatici. L&#39;articolo si descrivono anche le fasi preparatorie e reagenti vari e le attrezzature che sono necessarie per raggiungere questo obiettivo.

Questo è un protocollo che descrive come isolare e colture primarie di neuroni simpatici gangli cervicale superiore (SCG) di cuccioli di ratto appena nati.

Protocollo per la coltura neuroni simpatico da Rat gangli cervicale superiore (SCG)

I gangli cervicali superiori (SCG) nei ratti sono piccole strutture lucide a forma di mandorla che contengono neuroni simpatici. Questi neuroni forniscono...

Questa procedura inizia con l'isolamento dei gangli simpatici cervicali superiori da ratti neonati al tempo zero. Ogni cervello possiede due gangli simpatici cervicali superiori. Da una singola nidiata di piccoli ratti è possibile ottenere circa 24 gangli.La dissociazione dei gangli inizia con immersioni e un trattamento di 30 minuti. Un'ulteriore dissociazione viene ottenuta mediante ripetute pipettature con una pipetta di vetro levigata a fiamma, ottenendo una sospensione di singole cellule. I neuroni simpatici vengono quindi seminati su piatti rivestiti con collagene ENC.Ciao, sono Nila Zurin del laboratorio del Dott. Lloyd Green del Dipartimento di Patologia e Biologia Cellulare dell'Università di New York. Oggi dimostreremo come isolare e coltivare neuroni simpatici primari dai gangli cervicali superiori di cuccioli rossi neonati. Nel nostro laboratorio, utilizziamo solitamente queste cellule per studiare l'apoptosi in risposta alla privazione del fattore di crescita nervoso.Iniziamo. Cominciamo la procedura rivestendo una piastra per colture con collagene di coda di ratto 24 ore prima di eseguire la dissezione. A seconda della natura dell'esperimento, si utilizza una piastra per colture a 24 o a 48 pozzetti.Successivamente verranno preparati i mezzi e l'attrezzatura delle soluzioni. Questi materiali e reagenti possono essere trovati nel protocollo scritto che accompagna questo video. È importante notare che la soluzione di uridina e 5-FDU deve essere preparata immediatamente prima dell'uso.Continuare la preparazione con la fiamma. Lucidare le pipette di vetro per i passaggi di tazione. La punta della pipetta di vetro viene tenuta nella fiamma per alcuni secondi mentre viene ruotata, in modo da restringerla e levigarla.La lucidatura iniziale a fiamma deve essere eseguita in una cappa sterile per colture cellulari. Per iniziare la dissezione, raccogliere cuccioli di ratto neoonatali da P zero a P uno. Un cucciolo di ratto neoonatale viene rapidamente passato con etanolo al 70% per ridurre la contaminazione.Dopo la decapitazione, la testa viene posizionata sul tappetino di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto e l'estremità cefalica orientata verso di voi. La trachea recisa dovrebbe essere facilmente visibile. Aghi sterili per siringa vengono utilizzati per fissare la testa recisa al tappetino di dissezione nel modo seguente.Inserire un perno attraverso il palato nella base e un secondo perno attraverso il midollo spinale reciso nella base. Dopo aver posizionato la base per dissezione sotto la lente e aver guardato attraverso gli oculari, utilizzare due paia di pinze per rimuovere la pelle e il grasso intorno alla trachea. Facendo attenzione a non andare troppo in profondità, si esporranno due muscoli che corrono quasi paralleli l'uno all'altro su entrambi i lati della trachea.Durante la dissezione, sarà necessario irrorare con PBS sterile freddo o con mezzo RPMI 1640 freddo privo di siero, somministrati mediante una pipetta Pasteur sterile, per rimuovere il sangue in eccesso. Questa operazione può essere eseguita una o più volte, a seconda della velocità di lavoro. Successivamente, si utilizzano le pinzette per tagliare e rimuovere il muscolo da un lato per primo.Dopo aver rimosso il muscolo, l'arteria carotide diventerà visibile. Questa arteria corre lungo la trachea e si biforca in quello che assomiglia a un nastro a forma di Y. Questa biforcazione rappresenta un punto di riferimento importante e, una volta individuata, sarà relativamente facile trovare i gangli cervicali superiori.L'arteria viene recisa all'estremità più protetta e sollevata leggermente con la pinzetta. L'altra estremità dell'arteria rimane attaccata. Una volta effettuato ciò, il ganglio cervicale superiore diventerà visibile.Si dovrebbe osservare che si tratta di una piccola massa di tessuto di forma ovale e aspetto lucido, approssimativamente allentata all'arteria nel punto di biforcazione, e che presenta connessioni pregangliari e/o postgangliari simili a filamenti. Una seconda paio di pinzette viene utilizzato per staccare delicatamente il ganglio cervicale superiore e posizionarlo in una piccola piastra di coltura da 35 millimetri contenente mezzo RPMI 1640 freddo privo di siero. Successivamente, il ganglio viene estratto anche dall'altro lato della trachea seguendo lo stesso protocollo.Dopo aver dissezionato tutti i gangli, questi vengono liberati il più possibile dai tessuti estranei. Osservando attraverso la lente d'ingrandimento, si può notare che ai gangli sono attaccati frammenti di grasso dell'arteria carotidea o di altri tessuti; si utilizzano pinzette per rimuovere con delicatezza questi materiali indesiderati. Anche i connettivi pre e/o post-gangliari vengono eliminati.Ogni ganglio contiene circa 10.000 neuroni. Una volta seminati i neuroni, rigenereranno i loro neuriti puliti. I gangli vengono quindi posizionati in un tubo conico sterile da 15 millilitri in polipropilene contenente mezzo RPMI 1640.Successivamente, si stabilisce la coltura di neuroni simpatici. I gangli vengono centrifugati a 200 G per due minuti e il soprannatante viene scartato. I gangli vengono risospesi in 0,5-1 millilitro di soluzione di tripsina al 0,25% e quindi posti in un bagno termico o in un incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti per favorire la dissociazione delle cellule all'interno dei gangli.Dopo 30 minuti, vengono aggiunti 10 millilitri di mezzo completo al fine di diluire e neutralizzare la tripsina. Le soluzioni vengono quindi centrifugate a 200 ×g per due minuti. Il sopranatante viene quindi eliminato e i gangli vengono risospesi in due millilitri di mezzo finale.Utilizzando una delle punte di pipetta già preparate e arrotondate alla fiamma con apertura larga, le cellule vengono ulteriormente dissociate aspirando e rilasciando i gangli su e giù per 20 volte. Il tubo viene quindi posto sul ghiaccio per alcuni minuti. Successivamente, la pipetta viene nuovamente arrotondata alla fiamma per rendere l'apertura ancora più stretta.Dopo che la pipetta si è raffreddata, i gangli vengono triturati altre 20 volte. Il mezzo diventerà progressivamente più torbido, indicando che le cellule si stanno dissociando. Questo passaggio viene ripetuto una o due volte in più, a seconda dell'efficacia della dissociazione cellulare.Dopo un certo tempo, i gangli si saranno dissociati in neuroni e nel tubo non saranno visibili gangli integri. A questo punto potrebbe esserci del materiale tissutale che non si dissocia. Il tubo viene lasciato in posa sul ghiaccio per alcuni minuti in modo che eventuali detriti non associati possano depositarsi sul fondo.Si preleva con attenzione quasi tutto il soprannatante, tranne circa 50 microlitri, e lo si trasferisce in un altro tubo. Si lasciano 50 microlitri sul fondo del tubo per evitare il trasferimento di detriti non associati. Si aggiunge altro mezzo finale al tubo contenente le cellule dissociate.Il volume di mezzo finale aggiunto dipende dal tipo di piastra per colture utilizzata per coltivare i neuroni. Ad esempio, se si utilizza una piastra a 24 pozzetti, si deve seminare un ganglio per pozzetto in 0,5 millilitri di mezzo finale per pozzetto.Una nidiata tipica di ratti è composta da 12 cuccioli, il che fornisce 24 gangli. Questo quantitativo è sufficiente per seminare una piastra a 24 pozzetti, e il volume totale del mezzo finale è di 12 millilitri. L'uso di uridina cinque FDU nel mezzo finale impedirà la proliferazione e promuoverà la morte di una piccola popolazione di cellule gliali e di altri tipi cellulari.Nella coltura, le cellule vengono alimentate ogni 48 ore sostituendo i due terzi del mezzo. Con RPMI fresco più 1% di siero equino più NGF e uridina e cinque FDU. Inizialmente, la coltura contiene neuroni simpatici che appaiono rotondi, senza neuriti.I neuroni brevi diventano visibili 24 ore dopo la dissezione e nel tempo diventano progressivamente più densi e ramificati. Abbiamo appena mostrato come isolare e coltivare neuroni simpatici primari dai gangli cervicali superiori di ratti neonati. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di dedicare tempo e attenzione alla pulizia dei gangli, rimuovendo tutti i detriti, i vasi sanguigni e il tessuto adiposo.Questo passaggio è importante per garantire una coltura più o meno omogenea e priva di tipi cellulari estranei. In secondo luogo, durante il passaggio di dissociazione, siate pazienti e dedicate il tempo necessario a separare i neuroni in modo che non si trovino in grandi aggregati. Una volta che si sono depositati sulle piastre, la presenza di grandi aggregati renderà difficoltosa la procedura.In applicazioni successive, come la sezione o l'infezione dei neuroni, anche la colorazione immunoistochimica potrebbe risultare ostacolata, e tutti gli esperimenti che richiedono il conteggio dei neuroni risulteranno difficili da eseguire. Infine, non è necessario aggiungere al mezzo penicillina-streptomicina. Ogni volta che le colture vengono alimentate, l'aggiunta di penicillina-streptomicina è sufficiente solo la prima volta in cui le cellule vengono seminate.Aggiungere uridina cinque FDU fresca al mezzo ogni volta che si effettua il cambio del mezzo. Il nostro laboratorio ha utilizzato colture di neuroni simpatici per studiare l'apoptosi in risposta alla privazione del fattore di crescita nervoso. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Noi descriviamo un protocollo per l'utilizzo di proteine ​​morfogenetiche dell'osso-7 (BMP-7) o Matrigel per indurre selettivamente la crescita dendritica in primarie neuroni simpatici dissociate dai gangli cervicale superiore (SCG) di ratti perinatali.

Indurre crescita dendritica in colture di neuroni simpatici

Il protocollo descrive un sistema modello efficiente e riproducibile per studiare herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) latenza e riattivazione. Il dosaggio utilizza omogenei culture neurone simpatico e consente la dissezione molecolare del virus-neurone interazioni utilizzando una varietà di strumenti interferenza tra RNA e l'espressione di proteine ​​ricombinanti.

A primaria del sistema cultura Neuron per lo Studio della latenza del virus Herpes Simplex e la riattivazione

Questo video mostra una procedura per isolare i neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) da embrioni di ratto e co-coltivarli con i precursori delle cellule di Schwann per generare cellule di Schwann mature. I DRG isolati vengono elaborati per isolare i neuroni e le cellule gliali. Le cellule isolate vengono coltivate per purificare i neuroni, che vengono poi co-coltivati con cellule simili a cellule di Schwann (SCLC) in un terreno di co-coltura. L'interazione con i neuroni DRG porta alla...

Isolamento di neuroni DRG e cocoltura con precursori cellulari di Schwann per generare cellule di Schwann

Questo video descrive l'isolamento e la coltura delle cellule di Schwann dalle radici spinali dei topi. Le cellule isolate vengono quindi coltivate in terreni specifici. Le cellule di Schwann vengono isolate tramite digestione differenziale e aderenza. Successivamente vengono trasferiti su vetrini coprioggetti rivestiti di matrice extracellulare per l'attaccamento e la proliferazione.

Isolamento delle cellule di Schwann dalle radici spinali del topo

Questo video mostra una tecnica per isolare e coltivare le cellule dei gangli della radice dorsale (DRG) dalla colonna vertebrale del ratto. I DRG asportati dalla colonna vertebrale vengono trattati con enzimi e dissociati meccanicamente per ottenere una sospensione unicellulare. Le cellule vengono coltivate in un terreno contenente inibitori e fattori di crescita che limitano la proliferazione delle cellule gliali e promuovono la crescita neuronale, rispettivamente.

Stabilire una coltura cellulare primaria di gangli della radice dorsale da una colonna vertebrale di ratto

Qui descriviamo una delle cellule di Schwann (SC) saggio transizione, in cui SC sono in grado di sviluppare lungo gli assoni si estendono.

Analizzando lo sviluppo delle cellule di Schwann Murine lungo gli assoni in crescita

Questo protocollo descrive l'isolamento dei neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) isolati dai ratti e la coltura dei neuroni DRG su un sistema statico di coltura cellulare pre-allungata per migliorare l'allineamento degli assoni, con successiva co-coltura di cellule di Schwann (SC) per promuovere la mielinizzazione.

Un approccio per migliorare l&#39;allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

Colture primarie di radice dorsale (DRG) i gangli sono frequentemente utilizzati per studiare funzioni fisiologiche o eventi relativi alla patologia nei neuroni sensoriali. Qui, noi dimostrare l'uso di colture di DRG lombare per rilevare il rilascio dei neurotrasmettitori dopo tipo del ricevitore di neuropeptide FF 2 stimolazione con un agonista selettivo.

Isolamento dei gangli di radice dorsale e colture primarie per lo studio del rilascio di neurotrasmettitore

Questo articolo descrive l'isolamento e la tatura dei neuroni simpatici del ratto embrionale dai gangli cervicali superiori. Fornisce anche protocolli dettagliati per la colorazione immunocitomica e per la preparazione di estratti neuronali per l'analisi spettrometrica di massa.

Ticare i neuroni simpatici dei ratti da Ganglia cervicale superiore embrionale per l'analisi morfologica e proteomica

I gangli ciliari (CG) fanno parte del sistema nervoso parasimpatico. Le colture neuronali dei neuroni CG del pulcino hanno dimostrato di essere modelli cellulari efficaci nello studio delle interazioni nervose del nervo. Descriviamo un protocollo dettagliato per la dissezione, la dissociazione e la cultura in vitro dei neuroni CG da embrioni di pulcino.

Isolamento e cultura dei neuroni del Ganglione Ciliario

Il presente protocollo descrive un modello murino di ablazione dell'innervazione adrenergica mediante l'identificazione e la resezione del ganglio cervicale superiore.

Tecnica chirurgica per ganglionectomia cervicale superiore in modello murino

Impara a isolare e coltivare neuroni simpatici primari dai gangli cervicali superiori di cuccioli di ratto neonati. Questo protocollo utilizza trattamento enzimatico e piastre rivestite con collagene per studi neurobiologici.

Protocollo per la coltura neuroni simpatico da Rat gangli cervicale superiore (SCG)

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