Protocollo per la coltura neuroni simpatico da Rat gangli cervicale superiore (SCG)

Questa procedura inizia con l'isolamento dei gangli simpatici cervicali superiori da ratti neonati al tempo zero. Ogni cervello possiede due gangli simpatici cervicali superiori. Da una singola nidiata di piccoli ratti è possibile ottenere circa 24 gangli.

La dissociazione dei gangli inizia con immersioni e un trattamento di 30 minuti. Un'ulteriore dissociazione viene ottenuta mediante ripetute pipettature con una pipetta di vetro levigata a fiamma, ottenendo una sospensione di singole cellule. I neuroni simpatici vengono quindi seminati su piatti rivestiti con collagene ENC.

Ciao, sono Nila Zurin del laboratorio del Dott. Lloyd Green del Dipartimento di Patologia e Biologia Cellulare dell'Università di New York. Oggi dimostreremo come isolare e coltivare neuroni simpatici primari dai gangli cervicali superiori di cuccioli rossi neonati. Nel nostro laboratorio, utilizziamo solitamente queste cellule per studiare l'apoptosi in risposta alla privazione del fattore di crescita nervoso.

Iniziamo. Cominciamo la procedura rivestendo una piastra per colture con collagene di coda di ratto 24 ore prima di eseguire la dissezione. A seconda della natura dell'esperimento, si utilizza una piastra per colture a 24 o a 48 pozzetti.

Successivamente verranno preparati i mezzi e l'attrezzatura delle soluzioni. Questi materiali e reagenti possono essere trovati nel protocollo scritto che accompagna questo video. È importante notare che la soluzione di uridina e 5-FDU deve essere preparata immediatamente prima dell'uso.

Continuare la preparazione con la fiamma. Lucidare le pipette di vetro per i passaggi di tazione. La punta della pipetta di vetro viene tenuta nella fiamma per alcuni secondi mentre viene ruotata, in modo da restringerla e levigarla.

La lucidatura iniziale a fiamma deve essere eseguita in una cappa sterile per colture cellulari. Per iniziare la dissezione, raccogliere cuccioli di ratto neoonatali da P zero a P uno. Un cucciolo di ratto neoonatale viene rapidamente passato con etanolo al 70% per ridurre la contaminazione.

Dopo la decapitazione, la testa viene posizionata sul tappetino di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto e l'estremità cefalica orientata verso di voi. La trachea recisa dovrebbe essere facilmente visibile. Aghi sterili per siringa vengono utilizzati per fissare la testa recisa al tappetino di dissezione nel modo seguente.

Inserire un perno attraverso il palato nella base e un secondo perno attraverso il midollo spinale reciso nella base. Dopo aver posizionato la base per dissezione sotto la lente e aver guardato attraverso gli oculari, utilizzare due paia di pinze per rimuovere la pelle e il grasso intorno alla trachea. Facendo attenzione a non andare troppo in profondità, si esporranno due muscoli che corrono quasi paralleli l'uno all'altro su entrambi i lati della trachea.

Durante la dissezione, sarà necessario irrorare con PBS sterile freddo o con mezzo RPMI 1640 freddo privo di siero, somministrati mediante una pipetta Pasteur sterile, per rimuovere il sangue in eccesso. Questa operazione può essere eseguita una o più volte, a seconda della velocità di lavoro. Successivamente, si utilizzano le pinzette per tagliare e rimuovere il muscolo da un lato per primo.

Dopo aver rimosso il muscolo, l'arteria carotide diventerà visibile. Questa arteria corre lungo la trachea e si biforca in quello che assomiglia a un nastro a forma di Y. Questa biforcazione rappresenta un punto di riferimento importante e, una volta individuata, sarà relativamente facile trovare i gangli cervicali superiori.

L'arteria viene recisa all'estremità più protetta e sollevata leggermente con la pinzetta. L'altra estremità dell'arteria rimane attaccata. Una volta effettuato ciò, il ganglio cervicale superiore diventerà visibile.

Si dovrebbe osservare che si tratta di una piccola massa di tessuto di forma ovale e aspetto lucido, approssimativamente allentata all'arteria nel punto di biforcazione, e che presenta connessioni pregangliari e/o postgangliari simili a filamenti. Una seconda paio di pinzette viene utilizzato per staccare delicatamente il ganglio cervicale superiore e posizionarlo in una piccola piastra di coltura da 35 millimetri contenente mezzo RPMI 1640 freddo privo di siero. Successivamente, il ganglio viene estratto anche dall'altro lato della trachea seguendo lo stesso protocollo.

Dopo aver dissezionato tutti i gangli, questi vengono liberati il più possibile dai tessuti estranei. Osservando attraverso la lente d'ingrandimento, si può notare che ai gangli sono attaccati frammenti di grasso dell'arteria carotidea o di altri tessuti; si utilizzano pinzette per rimuovere con delicatezza questi materiali indesiderati. Anche i connettivi pre e/o post-gangliari vengono eliminati.

Ogni ganglio contiene circa 10.000 neuroni. Una volta seminati i neuroni, rigenereranno i loro neuriti puliti. I gangli vengono quindi posizionati in un tubo conico sterile da 15 millilitri in polipropilene contenente mezzo RPMI 1640.

Successivamente, si stabilisce la coltura di neuroni simpatici. I gangli vengono centrifugati a 200 G per due minuti e il soprannatante viene scartato. I gangli vengono risospesi in 0,5-1 millilitro di soluzione di tripsina al 0,25% e quindi posti in un bagno termico o in un incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti per favorire la dissociazione delle cellule all'interno dei gangli.

Dopo 30 minuti, vengono aggiunti 10 millilitri di mezzo completo al fine di diluire e neutralizzare la tripsina. Le soluzioni vengono quindi centrifugate a 200 ×g per due minuti. Il sopranatante viene quindi eliminato e i gangli vengono risospesi in due millilitri di mezzo finale.

Utilizzando una delle punte di pipetta già preparate e arrotondate alla fiamma con apertura larga, le cellule vengono ulteriormente dissociate aspirando e rilasciando i gangli su e giù per 20 volte. Il tubo viene quindi posto sul ghiaccio per alcuni minuti. Successivamente, la pipetta viene nuovamente arrotondata alla fiamma per rendere l'apertura ancora più stretta.

Dopo che la pipetta si è raffreddata, i gangli vengono triturati altre 20 volte. Il mezzo diventerà progressivamente più torbido, indicando che le cellule si stanno dissociando. Questo passaggio viene ripetuto una o due volte in più, a seconda dell'efficacia della dissociazione cellulare.

Dopo un certo tempo, i gangli si saranno dissociati in neuroni e nel tubo non saranno visibili gangli integri. A questo punto potrebbe esserci del materiale tissutale che non si dissocia. Il tubo viene lasciato in posa sul ghiaccio per alcuni minuti in modo che eventuali detriti non associati possano depositarsi sul fondo.

Si preleva con attenzione quasi tutto il soprannatante, tranne circa 50 microlitri, e lo si trasferisce in un altro tubo. Si lasciano 50 microlitri sul fondo del tubo per evitare il trasferimento di detriti non associati. Si aggiunge altro mezzo finale al tubo contenente le cellule dissociate.

Il volume di mezzo finale aggiunto dipende dal tipo di piastra per colture utilizzata per coltivare i neuroni. Ad esempio, se si utilizza una piastra a 24 pozzetti, si deve seminare un ganglio per pozzetto in 0,5 millilitri di mezzo finale per pozzetto.

Una nidiata tipica di ratti è composta da 12 cuccioli, il che fornisce 24 gangli. Questo quantitativo è sufficiente per seminare una piastra a 24 pozzetti, e il volume totale del mezzo finale è di 12 millilitri. L'uso di uridina cinque FDU nel mezzo finale impedirà la proliferazione e promuoverà la morte di una piccola popolazione di cellule gliali e di altri tipi cellulari.

Nella coltura, le cellule vengono alimentate ogni 48 ore sostituendo i due terzi del mezzo. Con RPMI fresco più 1% di siero equino più NGF e uridina e cinque FDU. Inizialmente, la coltura contiene neuroni simpatici che appaiono rotondi, senza neuriti.

I neuroni brevi diventano visibili 24 ore dopo la dissezione e nel tempo diventano progressivamente più densi e ramificati. Abbiamo appena mostrato come isolare e coltivare neuroni simpatici primari dai gangli cervicali superiori di ratti neonati. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di dedicare tempo e attenzione alla pulizia dei gangli, rimuovendo tutti i detriti, i vasi sanguigni e il tessuto adiposo.

Questo passaggio è importante per garantire una coltura più o meno omogenea e priva di tipi cellulari estranei. In secondo luogo, durante il passaggio di dissociazione, siate pazienti e dedicate il tempo necessario a separare i neuroni in modo che non si trovino in grandi aggregati. Una volta che si sono depositati sulle piastre, la presenza di grandi aggregati renderà difficoltosa la procedura.

In applicazioni successive, come la sezione o l'infezione dei neuroni, anche la colorazione immunoistochimica potrebbe risultare ostacolata, e tutti gli esperimenti che richiedono il conteggio dei neuroni risulteranno difficili da eseguire. Infine, non è necessario aggiungere al mezzo penicillina-streptomicina. Ogni volta che le colture vengono alimentate, l'aggiunta di penicillina-streptomicina è sufficiente solo la prima volta in cui le cellule vengono seminate.

Aggiungere uridina cinque FDU fresca al mezzo ogni volta che si effettua il cambio del mezzo. Il nostro laboratorio ha utilizzato colture di neuroni simpatici per studiare l'apoptosi in risposta alla privazione del fattore di crescita nervoso. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.