Isolamento e la coltura di cellule post-Natal Neuron cerebellare granuli mouse progenitore e Neuroni

Questa procedura inizia rimuovendo il cervelletto da P quattro a P cinque. Le meningi di topi neonati e il plesso coroideo vengono rimossi da ciascun cervelletto, che successivamente vengono raccolti in un tubo conico da 15 millilitri. I cervelletti vengono dissociati con la papaina e portati a una sospensione monocellulare mediante agitazione delicata.

Questa sospensione viene filtrata per gravità attraverso una maglia di nylon con una dimensione dei pori di 70 micron. Il flusso filtrato viene delicatamente stratificato sopra un gradiente discontinuo di perca e centrifugato per separare le cellule granulari dalla glia in neuroni e neuroni del gene Perkin. Le cellule presenti all'interfaccia del gradiente vengono raccolte e seminate preliminarmente in piastre rivestite con poli-l-lisina.

Per rimuovere ulteriormente le cellule gliali, le cellule granulari vengono raccolte, contate e seminate a densità desiderate su coprivetri rivestiti di poli-l-lisina o su piastre di coltura in plastica. Ciao, sono Hey Young Lee del laboratorio del Dott. Lloyd Green del Dipartimento di Anatomia Patologica dell'Università di Columbia. Oggi vi mostreremo una procedura per l'isolamento e la coltura di neuroni granulari cerebellari da topi postnatali.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la proliferazione e la differenziazione dei progenitori neurogenici dei granuli. Cominciamo dunque. Questa procedura inizia con l'uso di etanolo al 70% nell'area di dissezione per dissociare le cellule granulari del cervelletto; utilizziamo il sistema di dissociazione di Papin.

All'inizio di un nuovo kit, preparare la soluzione inibitrice di albumina OVO equate MOID. Per fare ciò, prelevare 32 millilitri di soluzione salina equilibrata di Earl o EBSS, fornita nel kit, e aggiungerla alla miscela di albumina OVO moid. Metterla da parte durante la preparazione degli altri componenti per consentire la dissoluzione del contenuto.

Successivamente, aggiungere cinque millilitri di EBSS a una provetta di papaina proveniente dal kit di dissociazione. Ogni provetta è sufficiente per dissociare da quattro a quindici cervelletti di topi P5. Quindi, collocare la provetta di papaina in un incubatore con 5% di CO₂ a 37 gradi Celsius per cinque-dieci minuti, fino a quando la papaina si sarà completamente sciolta e la soluzione apparirà limpida.

Mantenere la soluzione a temperatura ambiente durante la dissezione. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di EBSS al vial 1D NAS del kit. Mescolare delicatamente agitando leggermente il vial.

Dato che il DNAS è sensibile alla denaturazione meccanica, aggiungere 250 microlitri di questa soluzione al flaconcino di pepane per ottenere una concentrazione finale di 20 unità per mil e dello 0,005% di DNA; conservare il DNA rimanente per l'uso nei passaggi successivi. Una volta pronti strumenti e reagenti, procedere con la dissezione dei cervelletti e la rimozione delle meningi per questa procedura. Vengono utilizzati topi C57 neri sei tra i giorni postnatali quattro e sei.

Questa fascia d'età è ottimale per la coltura di cellule granulari perché il numero di progenitori delle cellule granulari dello strato granulare esterno o EGL è massimo. Iniziare prelevando con pipetta 15 millilitri di HBSS con glucosio in una piastra di coltura tissutale in plastica da 60 millimetri e 10 millilitri in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Porre il tubo sul ghiaccio, pulire la testa del cucciolo con etanolo al 70%. Utilizzare forbici da dissezione per rimuovere la testa.

Trasferire la testa nell'incubatore e trattenerla con pinzette in modo che la parte posteriore del cranio sia chiaramente visibile. Inserire le forbici da microdissezione nel forame magno per accedere al cervello, quindi tagliare in linea retta verso gli occhi. Utilizzare pinzette fine Dumont.

Punto cinque, utilizzare la pinzetta per rimuovere la pelle e sollevare il cranio per esporre il cervello. Quindi staccare il cervelletto e la parte circostante del mesencefalo. Trasferirlo nella piastra contenente HBSS glucosio.

Si noti che è più facile manipolare il cervelletto e rimuovere le meningi se il cervelletto è ancora attaccato al tessuto circostante. Successivamente, posizionare il tessuto sotto un microscopio stereoscopico. Quindi, utilizzare un paio di pinzette per fissare il cervelletto alla piastra.

Utilizzare pinzette fini Dumont numero cinque per staccare delicatamente le meningi dal cervelletto e dalle zone tra i lobi. Si noteranno vasi sanguigni sulla superficie del cervelletto.

Questi vasi sanguigni rappresentano un buon metodo per identificare le meningi. Continuare a rimuovere le meningi finché il cervelletto non assume un aspetto bianco opaco. Successivamente, separare il cervelletto dal resto del mesencefalo.

Posizionarlo sul lato ventrale ed eliminare il plesso corioideo, che ha l'aspetto di un nastro di colore rossastro tra il cervelletto ventrale e il mesencefalo adiacente. Non appena il cervelletto è stato dissezionato, collocarlo in HBSS glucosio freddo nel tubo conico da 15 millilitri posto sul ghiaccio. Dopo aver dissezionato tre cervelli, sostituire la soluzione di dissezione con HBSS glucosio fresco.

Man mano che acquisirai maggiore familiarità con la dissezione del cervelletto, cerca di ridurre il tempo di dissezione a non più di sei minuti per ogni cucciolo. Al termine delle dissezioni, procedi con la preparazione della sospensione cellulare. Passaggio per generare una sospensione cellulare a partire dalle dissezioni del cervelletto.

Innanzitutto, rimuovere l'HBSS con glucosio dal tubo e sostituirlo con la soluzione di papaina. Sebbene il kit raccomandi di tagliare il tessuto in piccoli pezzi, abbiamo riscontrato che ciò non è necessario a quest'età. Collocare il tessuto e la soluzione di papaina in un incubatore a 5% CO₂ e 37 gradi per 15-20 minuti.

Per quattro a otto cervelletti, incubare per 15 minuti. Per un numero maggiore, incubare fino a mezz'ora. Agitare delicatamente il tubo ogni tre o quattro minuti.

Al termine dell'incubazione, iniziare il passaggio di rotazione: ricoprire una punta sterile per pipetta aerosol P 1000 con FBS aspirando e dispensando due volte. Ora centrifugare la miscela. Assicurarsi di pipettare delicatamente per evitare la formazione di bolle d'aria.

Circa 10 movimenti su e giù con la pipetta sono sufficienti per dissociare il tessuto. La soluzione dovrebbe diventare torbida. Lasciare riposare la sospensione per 30-60 secondi in modo che eventuali frammenti grandi di tessuto non dissociato si depositino sul fondo del tubo.

Sebbene le pipette di vetro lucidate a fuoco possano essere utilizzate per la titolazione, abbiamo riscontrato che i puntali sterili P1000 rivestiti con siero funzionano altrettanto bene. Successivamente, trasferire le cellule in sospensione in un nuovo tubo conico da 15 ml utilizzando un puntale di pipetta rivestito con siero, avendo cura di non prelevare i pezzi di tessuto non associati presenti sul fondo. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a circa 200 ×g per cinque minuti.

A temperatura ambiente durante la centrifugazione, preparare il mezzo di sospensione per la risospensione. Per fare ciò, aggiungere 2,7 millilitri di EBSS in un tubo sterile. Quindi aggiungere 300 microlitri della soluzione ricostituita di inibitore albumina OVO MOID.

Infine, aggiungere 150 microlitri della soluzione di DNA. Al termine della centrifugazione, scartare il soprannatante e risospendere immediatamente il pellet cellulare nella soluzione diluita di inibitore dell'albumina del DNA. Utilizzare nuovamente una punta di pipetta rivestita con siero per risospendere il pellet.

Ora preparare un gradiente di densità discontinuo. A tale scopo, aggiungere cinque millilitri della soluzione inibitrice di albumina oval MOID in un tubo conico da 15 millilitri. Sovrapporre la sospensione cellulare sulla soluzione aggiungendo delicatamente le cellule lungo il lato del tubo, quindi centrifugare a circa 70 G per sei minuti.

A temperatura ambiente, le cellule dissociate si depositano sul fondo del tubo mentre i frammenti di membrana rimangono all'interfaccia. Se si desidera ottenere colture arricchite in cellule granulari, non è necessaria ulteriore purificazione. Scartare il sopranatante e risospendere immediatamente il pellet in quattro millilitri di mezzo con FBS al 10% aggiungendo 50 microlitri di DNAasi.

Filtrare questa sospensione per gravità attraverso una maglia di nylon con una dimensione dei pori di 70 micron. Questo passaggio rimuove le cellule non neuronali di grandi dimensioni e consente di ottenere una migliore sospensione di cellule singole. Successivamente, saltare il seguente passaggio di separazione su gradiente pericoloso e procedere direttamente al passaggio di semina cellulare.

O se si desidera ulteriormente purificare le cellule granulari da glia e grandi interneuroni, procedere al gradiente per call. Passaggio: eliminare il sopranatante e sospendere immediatamente il pellet in due millilitri di HBSS con glucosio e 50 microlitri di DNAasi.

Di nuovo, filtrare la sospensione attraverso una maglia di nylon. Prima di iniziare la separazione su gradiente di percoll, preparare due pipette Pasteur con la punta arrotondata a fiamma. Riscaldare delicatamente la punta di una pipetta fino a quando il bordo risulta liscio e il diametro interno è ridotto a circa metà delle dimensioni originali. Fare attenzione a non rendere l'apertura troppo piccola.

Ora preparare il gradiente di percoll. Aggiungere 10 ml di soluzione di percoll al 35% in un tubo conico sterile da 50 ml. Successivamente, caricare 10 ml di percoll al 60% in una siringa sterile da 10 ml con ago spinale sterile applicato.

Aggiungere delicatamente la soluzione al 60% per pozzetto sotto la soluzione al 35% facendo toccare la punta della siringa al fondo del tubo. Prestare attenzione a mantenere un'interfaccia netta tra i due strati. Successivamente, aggiungere le cellule sulla parte superiore del gradiente.

Utilizzando una pipetta levigata a fuoco, aggiungere delicatamente le cellule lungo il lato del tubo senza disturbare l'interfaccia. Dopo aver stratificato attentamente le cellule, posizionare il tubo nella centrifuga. Iniziare la centrifugazione a circa 18 G. Aumentare la velocità di un passo ogni 20 secondi in modo da impiegare circa due minuti per raggiungere 1800 G. Dopo 10 minuti a 1800 G, ridurre gradualmente la velocità di un passo ogni 20 secondi.

Al termine della centrifugazione, rimuovere e scartare lo strato superiore dell'interfaccia del gradiente. Questa interfaccia contiene grandi cellule ggl bikini e interneuroni. Successivamente, utilizzare una pipetta flame-polished per rimuovere con attenzione le cellule presenti all'interfaccia.

Trasferire le cellule in una provetta da 50 ml. Se il volume dovesse essere superiore a 15 ml, suddividerle in due provette da 50 ml e risospendere in tre volumi di HB S'S glucosio, mescolando per inversione ripetuta. Centrifugare quindi per cinque minuti a 1100 ×g. Rimuovere ora il soprannatante e aggiungere 4 ml di mezzo contenente 10% di FBS e 50 microlitri di D ns reus.

Sospendere delicatamente il pellet utilizzando una pipetta levigata a fiamma per ottenere una sospensione monocellulare. Una volta risospesi, procedere con il prepl. Le cellule preplano le cellule raccolte su una piastra rivestita con polilisina per 20 minuti.

In un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Durante l'incubazione, le astroglie e le cellule più pesanti si depositeranno e aderiranno alle piastre, mentre i neuroni granulari piccoli e le cellule progenitrici neuronali rimarranno in sospensione o debolmente aderenti. Dopo 20 minuti, battere delicatamente sulla piastra per staccare le cellule granulari debolmente aderenti.

Quindi trasferire la sospensione cellulare in una nuova piastra rivestita con poli-l-lisina e ripetere l'incubazione. Successivamente, raccogliere i neuroni granulari e le cellule progenitrici neuronali in un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 200 ×g per cinque minuti. Quindi risospendere il pellet in 1 ml di mezzo privo di siero e contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Infine, aggiungere mezzo privo di siero per raggiungere la densità cellulare desiderata per la semina a densità media. Per piastre a sei pozzetti, utilizzare circa 3,5-4 milioni di cellule per piastre a quattro pozzetti.

Utilizzare 650.000 cellule. Mantenere le cellule in un incubatore a 37 gradi con 5% CO2. Cambiare completamente il mezzo 24 ore dopo il semina iniziale, quindi ogni due o tre giorni successivamente.

Ecco alcune immagini di colture sane di neuroni granulari e cellule progenitrici, a 24 ore dal seeding e a sei giorni dal seeding. Queste cellule possono essere mantenute in coltura fino a due settimane.

Si noti che entro 24 ore dal seeding, le cellule sane si distribuiranno uniformemente attorno ai coverslip o al fondo della piastra e svilupperanno prolungamenti. L'aggregazione cellulare e la presenza di varicosità sui prolungamenti indicano che le cellule sono in condizioni non ottimali o che il substrato di poli-l-lisina è tossico. Come mostrato nel diagramma, i progenitori dei neuroni granulari iniziano a differenziarsi subito dopo il seeding ed esprimono marcatori specifici.

Rappresentativo della loro differenziazione. La proliferazione dei progenitori dei neuroni granulari può essere notevolmente prolungata aggiungendo sonic hedgehog al mezzo. È possibile aggiungere anche laminina come substrato, oltre alla polilisina, per favorire l'outgrowth dei neuriti.

Queste caratteristiche della coltura di cellule granulari offrono un sistema per lo studio sia della biologia dei neuroni granulari sia della regolazione della differenziazione delle cellule progenitrici in neuroni. Vi abbiamo appena mostrato come isolare e coltivare progenitori e neuroni granulari cerebellari MAO. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che il rendimento approssimativo è di 4-5 × 10¹⁰.

Dei sei cellule per cucciolo, le densità di semina possono variare tra e cinque volte il centro delle cinque cellule per centimetro quadrato. Pertanto, se il passaggio del gradiente al percoll viene omesso, otto cuccioli di topo al quinto giorno postnatale possono fornire un numero sufficiente di cellule per sei piastre di coltura a quattro pozzetti; secondo la mia esperienza, l'uso del passaggio con gradiente al percoll ridurrà la resa cellulare di circa il 25-30%. Tuttavia, la percentuale di neuroni granulari nelle colture aumenta dal 90-95% al 99%. Le cellule granulari arricchite ottenute senza il passaggio di separazione tramite gradiente al percoll sono state utilizzate per studiare la regolazione della proliferazione e della differenziazione dei progenitori dei neuroni granulari. Tuttavia, se le colture devono essere mantenute per più giorni in vitro, si raccomanda l'inclusione del passaggio con gradiente al percoll al fine di ridurre la contaminazione dei neuroni granulari da parte di cellule non neuronali in proliferazione.

Inoltre, assicurarsi che le soluzioni utilizzate per preparare il gradiente per cot siano fresche, poiché un'errata tamponatura provoca una maggiore morte cellulare. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.