Name: Isolamento e la coltura di cellule post-Natal Neuron cerebellare granuli mouse progenitore e Neuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: Impara a isolare e coltivare neuroni granulari cerebellari e progenitori da topi postnatali usando papaina e gradiente Percoll. Questo protocollo consente studi di neuroscienza sullo sviluppo neuronale in vitro.

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Ringraziamo Barbara Carletti e Anna Marie Kenney per i preziosi suggerimenti. HYL è sostenuta dalla borsa di formazione &quot;Gli ormoni: Biochimica e Biologia Molecolare&quot;, DK07328. Sostenuto in parte dal NIH concedere 5R01 NS16951 (CAM).

Parte 1: Impostazione (1-2 giorni prima della dissezione) (Non mostrato in video) <ol><li> PREPARAZIONE SOLUZIONI CULTURA E MEDIA: <ul><li> 4X CMF-PBS-EDTA (calcio e magnesio libero-tampone fosfato-EDTA per diluizioni Percoll): litro, aggiungere 32 g di NaCl, 1,2 g di KCl, 8 g di glucosio, 2 g di NaH 2 PO 4, 1 g di KH 2 PO 4, 8 ml al 2% NaHCO stock 3, 10 ml EDTA 1M (pH 8,0) a distillata / deionizzata. Regolare il volume di 1 litro e il pH a 7,4. Filtro sterilizzare. </li><li> HBSS-GLUCOSIO: Aggiungi glucosio (6 grammi / litro) al calcio e magnesio Salt libero di Hank Soluzione Balance (HBSS) e filtro sterile. 500 ml può essere conservato a 4 ° C per un massimo di un mese. </li><li> MEDIA CULTURA: mezzo privo di siero (SFM) e il 10% medio FBS. A 48 ml di Neurobasal A-Media aggiungere 500 microlitri 100X GlutaMAX I, 500 microlitri 100X penicillina-streptomicina (finale 100 unità penicillina e streptomicina 100 mg), 6,25 microlitri 2 M KCl (finale 250 mM). Diviso in 2 aliquote di 9 ml e 40 ml. Per preparare al 10% medio FBS, aggiungere 1 ml di calore FBS inattivato aliquota al 9 ml. Per preparare SFM, aggiungere 800 ml di siero senza supplemento B-27 per l&#39;aliquota 40 ml. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane. Per ottenere i migliori risultati rendono mezzi freschi per ciascun esperimento. </li></ul></li><li> PREPARAZIONE DILUIZIONI Percoll: <ul><li> Percoll è fornito come liquido e deve essere acidificato prima dell&#39;uso. Per preparare il brodo, aggiungere 1N HCl a poco a poco alla soluzione Percoll per un periodo di 1-2 ore fino a pH 7,4 viene raggiunto. Aggiunta del HCl troppo rapidamente farà sì che il Percoll per aggregare. Circa 6.5ml di 1N HCl sono necessari per ogni litro di Percoll. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li><li> A 35% e un 60% (vol: vol) diluizione Percoll saranno utilizzati nella fase gradiente Percoll. Preparare 100 ml di diluizioni Percoll contenente 35 o 60 ml di Percoll stock, 25 ml di 4X CMF-PBS-EDTA e distillata / deionizzata H2O al volume finale. Aggiungere poche gocce di blu di toluidina per la soluzione del 60%: ci aiuterà visualizzare l&#39;interfaccia e le cellule. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li><li> 4X CMF-PBS-EDTA non dovrebbe avere più di 3 mesi, come il buffering inadeguata causerà la morte delle cellule è aumentato durante la procedura. </li></ul></li><li> Coprioggetto PREPARAZIONE: coprioggetto di vetro (meglio se da Supply Company Carolina biologica) vengono lavati con il 10% HCl notte a temperatura ambiente con agitazione mite, sciacquati accuratamente con acqua distillata / deonized acqua e conservati in etanolo al 70%. Prima dell&#39;uso, coprioggetto singole sono di fiamma sterilizzati con brevemente tenendo con una pinza su una fiamma libera (becco Bunsen) fino alla evapora etanolo. 12-mm coprioggetto di vetro può essere posizionato in 4 pozzetti cultura e coprioggetto da 25 mm in 6 pozzetti cultura. </li><li> NAVI RIVESTIMENTO CULTURA CON SUPPORTO: Per immunofluorescenza o trattamenti farmacologici in vetro coprioggetto sono più adatti in quanto possono essere facilmente montate su vetrini per la visualizzazione al microscopio. Quando un gran numero di cellule sono necessarie per la raccolta di campioni di RNA e proteine, le cellule possono essere coltivate sui piatti tradizionali della cultura plastica notte prima della dissezione, coprioggetto di vetro o piatti di plastica per la cultura devono essere rivestiti con poli-D-lisina (500 mg / ml; 800 microlitri / pozzetto per 6-pozzetti o 350 microlitri / pozzetto per 4-pozzetti). 5 mg / ml soluzione stock di poli-D-lisina è conservato a -20 ° C, poi diluito in distillata sterile / deonized acqua filtrata e sterile destra prima dell&#39;uso. Recipienti di coltura vengono incubate a 37 ° C per una notte (o almeno per 2 ore prima placcatura) e lavato due volte con distillata sterile / deonized diritto all&#39;acqua prima di placcatura. </li><li> Preparazione di piatti PREPLATING: Questi piatti saranno utilizzati per il pre-plating le cellule isolate cerebellari prima cultura per rimuovere i contaminanti gliali, che aderiscono più facilmente a una minore concentrazione di substrato. Cappotto due 60 mm di plastica con piatti di cultura 4 ml al piatto di poli-D-lisina (100 mg / ml; Nota questa è 1 / 5 della concentrazione usata per la coltura). Incubare a 37 ° C per una notte (o almeno per 2 ore prima della dissezione). Poco prima la dissezione, rimuovere il poli-D-lisina soluzione, lavare i piatti due volte con acqua sterile e lasciare asciugare nel cappuccio. </li><li> Sterilizzare gli strumenti dissezione in autoclave o il giorno della dissezione, immergere gli strumenti in etanolo al 70% per 20 minuti. Strumenti necessari: Permaset forbici, forbici microdissecting, quattro Dumont # 5 dissettore. </li></ol> Parte 2: Preparazione per la dissezione (giorno di dissezione) - (dimostrato in video) Tutte le seguenti procedure vengono eseguite in una cappa di coltura di tessuti a meno che celebre. <ol><li> Pulire l&#39;area dissezione con il 70% di etanolo. Riscaldare la media a 37 ° C a bagnomaria o in un 5% di CO 2 37 ° C incubatore. </li><li> Quando si avvia un nuovo sistema di papaina dissociazione Kit (Worthington), preparare la soluzione di albumina-ovomucoid inibitore. Aggiungere 32 mldi EBSS (soluzione salina bilanciata di Earle, fornito nel kit) per l&#39;albumina-ovomucoid miscela inibitore e permettere il contenuto di sciogliere durante la preparazione degli altri componenti. Ricostituire per il primo utilizzo, poi conservare la soluzione rimanente a 2-8 ° C e utilizzare fino a cinque isolamenti consentiti da ogni kit sono stati completati. </li><li> Aggiungere 5 ml di EBSS ad un flaconcino papaina dal Kit dissociazione (ogni fiala è sufficiente per la dissociazione di 4-15 dal cervello dei topi dopo la nascita giorno 5). Porre la fiala papaina in un 5% di CO 2 37 ° C o incubatore a 37 ° C bagnomaria per 5 a 10 minuti fino a quando la papaina è completamente sciolto e la soluzione appare chiara. Mantenere la soluzione a temperatura ambiente durante la dissezione. </li><li> Aggiungere 500 ml di EBSS ad un flaconcino DNasi nel kit dissociazione. Mescolare delicatamente toccando il flacone dal DNasi è sensibile alla denaturazione taglio. Aggiungere 250 microlitri di questa soluzione al flacone contenente la papaina (concentrazione finale è di 20 unità / ml di papaina e DNasi 0,005%). Salva il flacone rimanenti DNasi per l&#39;uso in fase 5.1 o 6.1. </li></ol> Parte 3: dissezione e rimozione Meningi <ol><li> L&#39;età ottimale per la coltura dei granuli delle cellule di topo C57BL/6J è il giorno dopo la nascita 4-6, quando il numero di cellule progenitrici delle cellule dei granuli in EGL peaks1, 10. Sezionare cuccioli uno alla volta e come si diventa più familiarità con la dissezione cerebellare cercare di ridurre i tempi di dissezione, per non più di 6 minuti per ogni cucciolo. La velocità è essenziale. Se il passo gradiente Percoll è bypassato, otto giorni dopo la nascita-5 cuccioli di topo si possono ottenere cellule sufficiente per un 6-bene piastra di coltura (o sei coprioggetto da 25 mm) o per sei a 4 e piastre di coltura (o 24 12 - coprioggetto mm). Rendimento stimato è di 4 a 5x106 cellule per densità cucciolo e placcatura può variare tra 1 e 5x105 cells/cm2. Dato che le cellule del 15-20% vengono persi durante la step4 Percoll, più animali sono necessari per ottenere la stessa densità cella desiderata. </li><li> Pipettare 15 ml di HBSS-glucosio in una di 60 mm piatto di plastica coltura di tessuto e 10 ml in una sterile Falcon 15 tubo di plastica ml. Mettere in ghiaccio. </li><li> Al di fuori della cappa, pulire la testa del cucciolo con il 70% di etanolo. Usare le forbici Permaset di decapitare il cucciolo. (Decapitazione non verrà mostrato nel video). </li><li> Nel cappuccio, tenere la testa con una pinza Dumont in modo che si può vedere chiaramente la parte posteriore del cranio. Accedi al cervello con l&#39;inserimento di forbici microdissecting nel foro occipitale e taglio dritto verso gli occhi. Con le pinzette e staccarsi la pelle e sollevare il cranio per esporre il cervello. Utilizzando pinze Dumont, pizzichi via il cervelletto e il mesencefalo circostante e trasferirlo al piatto con HBSS-glucosio. (E &#39;più facile manipolare il cervelletto e rimuovere le meningi se il cervelletto è ancora attaccato al tessuto circostante). </li><li> Sotto il microscopio da dissezione, delicatamente sbucciare le meningi fuori il cervelletto e anche tra i lobi con una multa Dumont # 5 forcipe durante l&#39;uso del forcipe altro ancora lungo il cervelletto alla piastra. Noterete vasi sanguigni sulla superficie del cervelletto. Questi vasi sanguigni sono un buon modo per identificare le meningi. Rimuovere le meningi fino a quando il cervelletto assume un aspetto opaco bianco. Separare il cervelletto dal resto del mesencefalo. Girare per il suo lato ventrale ed estrarre il plesso coroideo, che si presenta come un nastro rosso tra il cervelletto e il mesencefalo ventrale adiacenti. Mettete ogni cervelletto a freddo HBSS-glucosio in un tubo da 15 ml su ghiaccio appena sezionato. Cambia la soluzione dissezione a fresco HBSS-glucosio dopo dissezione 3 cervelli. </li></ol> Parte 4: sospensione cellulare <ol><li> Una volta che tutte le dissezioni sono finiti, rimuovere il HBSS-glucosio dal tubo e sostituirlo con la soluzione di papaina effettuata nel passaggio 2.4. Anche se il kit raccomanda il taglio del tessuto in piccoli pezzi, troviamo che non è necessario tagliare o tritare il cervello dei a questa età. Posizionare il + soluzione papaina tessuto (in un tubo da 15 ml) nel 37 ° C in bagno d&#39;acqua o 5% di CO 2 37 ° C incubatore per 15 a 20 minuti. Da 4 a 8 cervelletti, a 15 minuti a 37 ° C è sufficiente, per un numero maggiore di cervello dei 20 a 30 minuti è meglio. Agitare delicatamente il tubo ogni 3 o 4 minuti. </li><li> Triturare la miscela con un puntale sterile p1000 aerosol che è stato rivestito con FBS. Fare questo passo delicatamente per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. Pipette in vetro lucido fuoco può essere utilizzato, ma a nostro parere siero rivestito sterile p1000 suggerimenti aerosol funzionare altrettanto bene. Per ricoprire la punta della pipetta con FBS, FBS pipetta su e giù due volte prima dell&#39;uso. Circa 10 su e giù per i movimenti con la pipetta sono sufficienti per dissociare il tessuto. La soluzione diventerà torbida. Consentono la sospensione a sedere per 30-60 secondi in modo che qualsiasi grossi pezzi di tessuto dissociato si depositerà sul fondo della provetta. </li><li> Rimuovere le cellule in sospensione (attenzione a non rimuovere i pezzi di tessuto non dissociato al bottom) in un nuovo tubo 15 ml con una punta di siero pipetta rivestito. Centrifugare a circa 200xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Preparare la risospensione media. Per fare questo, mix EBSS 2,7 ml con 300 ml di albumina ricostituito-inibitore ovomucoid soluzione in una provetta sterile. Aggiungere 150 ml di soluzione di DNasi dal punto 2.4. </li><li> Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e subito risospendere il pellet cellulare in diluita DNasi / soluzione inibitore albumina preparata al punto 4.3 con un siero rivestito p1000 aerosol puntale. </li><li> Preparazione di un gradiente discontinuo di densità come segue. Aggiungere 5 ml di albumina-ovomucoid soluzione inibitore ad un tubo da 15 ml. Con attenzione sospensione strato della cella in cima. Centrifugare a circa 70xg per 6 minuti a temperatura ambiente. Cellule dissociate pellet sul fondo del tubo, frammenti di membrana rimangono a livello di interfaccia. </li><li> Se si desidera ottenere colture che si arricchiscono in granuli, superare la fase di gradiente di Percoll di separazione (che produce le culture più pura di granuli cerebellari), e passare alla Parte 6. Se si desidera isolare ulteriormente le cellule gliali e granuli da interneuroni grandi per separazione gradiente di Percoll, passare alla Parte 5. L&#39;uso del passo gradiente Percoll ridurrà il rendimento delle celle. Nelle nostre mani, la riduzione della resa è di circa 20-35%. Tuttavia, vi è un aumento della arricchimento dei neuroni dei granuli e cellule progenitrici di circa il 90% al 95-99%. </li></ol> Parte 5: Separazione gradiente Percoll <ol><li> Eliminare il supernatante e risospendere immediatamente il pellet in 2 ml di HBSS-glucosio con 50 ml di DNasi dal punto 2.4. Filtrare la sospensione cellulare anche se una maglia di nylon (dimensione dei pori 70 micron) per gravità. Questo passo sarà la rimozione di grandi cellule non neuronali e prevede una sospensione migliore singola cella. </li><li> Preparare due incendi lucidato vetro pipette Pasteur. Per fare questo, delicatamente fiamma la punta di una pipetta di vetro fino a quando il bordo è semplificate ed il foro pipetta è 40-50% delle dimensioni originali. Fare attenzione a non fare l&#39;apertura troppo piccola. </li><li> Preparare gradiente Percoll. Introdurre 10 ml di soluzione di Percoll al 35% in una provetta sterile da 50 ml conica. Percoll 60% (10 ml) viene caricato con una siringa da 10 ml sterile con un ago sterile spinale allegato. Delicatamente lo strato di soluzione di Percoll al 60% sotto la soluzione al 35%, con l&#39;aggiunta di una soluzione al 60% sul fondo del tubo con l&#39;ago spinale. Aver cura di mantenere un&#39;interfaccia netta tra i due strati. Aggiungi le cellule alla parte superiore del gradiente usando un incendio lucidato pipetta, aggiungere delicatamente lungo il lato del tubo senza disturbare l&#39;interfaccia. </li><li> Posto con attenzione il tubo nella centrifuga e centrifugare a 1800xg. Rampa la velocità di un passo ogni 20 secondi (incrementi di velocità sono le seguenti: circa 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg) in modo che ci vogliono circa 2 minuti per raggiungere la velocità desiderata. Avviare il timer a 10 minuti quando 1800xg è raggiunto. Al termine, diminuire la velocità gradualmente un passo ogni 20 secondi. </li><li> Rimuovere l&#39;interfaccia superiore del gradiente (contenente glia grande, cellule di Purkinje, e interneuroni) e scartare. </li><li> Rimuovere con attenzione le cellule a livello di interfaccia tra il 35% e il 60% Percoll con un fuoco lucido pipetta e trasferirli in un tubo da 50 ml. Risospendere in 3 volumi di HBSS-glucosio e mescolare capovolgendo più volte. Centrifugare per 5 minuti a 1100xg. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 4 ml di 10% di media FBS con 50 ml di DNasi. Risospendere il pellet delicatamente con un incendio lucidato pipetta per formare una sospensione singola cella. Passare al punto 6.2. </li></ol> Parte 6: Pre-placcatura e placcatura <ol><li> Eliminare il supernatante e risospendere immediatamente il pellet in 4 ml di FBS 10% medio con 50 ml di DNasi dal punto 2.4. Filtrare la sospensione cellulare anche se una maglia di nylon (dimensione dei pori 70 micron) per gravità. Questo passo sarà la rimozione di grandi cellule non neuronali e prevede una sospensione migliore singola cella. </li><li> Piastra le cellule raccolte in un poli-D-lisina rivestito pre-placcatura piatto per 20 minuti in un 5% di CO 2 37 ° C incubatore. Ripetere con un piatto fresco. Le cellule astroglia e più pesanti si stabilizzerà e rispettare i piatti e lasciare i neuroni dei granuli piccoli e cellule progenitrici dei neuroni galleggianti. Dopo l&#39;incubazione, i neuroni granulari liberamente aderito e le cellule progenitrici dei neuroni sono spostano facilmente e allentato con lievi colpetti della piastra. </li><li> Raccogliere i neuroni dei granuli e le cellule progenitrici dei neuroni in un tubo da 15 ml e centrifugare a 200xg per 5 minuti. Risospendere il pellet in 1 ml di mezzo privo di siero e contare una aliquota di 10 microlitri con un emocitometro. </li><li> Aggiungere mezzo privo di siero per raggiungere la densità cellulare desiderato. Linee guida di massima per il numero di cellule per piastra per densità media: per 6-pozzetti da 3,5 a 4 milioni di cellule, per piatti 4-bene, 650.000 cellule. Per 6-pozzetti cultura, io piatto 1,5 ml / pozzetto e per 4 ben plates, io piatto 0,5 ml / pozzetto. Le cellule sono mantenute in un 5% di CO 2 37 ° C incubatore. Cambia il medium completamente 24 ore dopo con modifiche successive ogni due o tre giorni. </li></ol>

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</ol>

Questo protocollo si basa su modificazioni delle procedure che sono state descritte in passato 3,7,11. Ci sono diversi punti importanti da notare come descritto di seguito. I neuroni e le cellule progenitrici dei granuli aderire entro 2 ore dalla placcatura. Le cellule sane hanno una morfologia rotonda sotto il contrasto di fase 4 microscopio. Entro 24 ore dopo la placcatura, le cellule sane si diffonderà in modo uniforme in tutto il coprioggetto o il pozzo di plastica e formeranno processi. Al momento del camb...

<table><tbody><tr><td>Filtro cellulare con pori da 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Ago spinale</td><td>BD Biosciences</td><td>405182</td><td>20G x 3-1/2 pollici</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina, peso molecolare&amp;gt;300.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>Ogni nuovo lotto di poli-D-lisina deve essere testato.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1644</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-103</td><td>Deve essere privo di calcio e magnesio.</td></tr><tr><td>Mezzo Neurobasal A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento privo di siero B-27 (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip circolari da 12 mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td>Questi sono prodotti in Germania da Deckglaser.</td></tr><tr><td>Coverslip circolari da 25 mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3037</td><td>Questi sono prodotti in Germania da Deckglaser.</td></tr><tr><td>Sistema di dissociazione con papaina</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK 003150</td><td>Il kit è sufficiente per cinque isolamenti.</td></tr><tr><td>Forbici Permaset</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6782</td><td></td></tr><tr><td>Dumont n. 5 (Dumostar)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4978</td><td></td></tr><tr><td>Piatto coltura da 4 pozzetti</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Piatto coltura da 6 pozzetti</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140685</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e la coltura di cellule post-natal neuron cerebellare granuli mouse progenitore e neuroni

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

La corteccia cerebellare è una struttura ben descritto che offre opportunità uniche per studiare le proprietà neuronali e 1,2 di sviluppo. Dei tipi neuronali del cervelletto (cellule dei granuli, cellule di Purkinje e interneuroni inibitori), i neuroni dei granuli sono di gran lunga i più numerosi e sono il tipo più abbondante di neuroni nel cervello dei mammiferi. Nei roditori, i neuroni granuli cerebellari sono generati durante i primi due post-natale settimane da cellule progenitrici nello strato più esterno della corteccia cerebellare, lo strato granulare esterno (EGL). Il protocollo presentato qui descrive le tecniche per arricchire e neuroni dei granuli cultura e le loro cellule progenitrici dal post-natale del cervelletto mouse. Si descrivono le procedure per ottenere colture di purezza crescente 3,4, che può essere utilizzato per studiare la differenziazione delle cellule progenitrici proliferano in neuroni dei granuli 5,6. Una volta che le cellule progenitrici differenziare, le culture forniscono anche una popolazione omogenea di neuroni granulari per la manipolazione sperimentale e caratterizzazione di fenomeni come la sinaptogenesi, la funzione dei recettori del glutammato 7, l&#39;interazione con altre cellule purificate cerebellari 8,9 o morte cellulare 7.

Qui vi presentiamo un metodo per isolare e cultura dei granuli cerebellari cellule progenitrici dei neuroni e neuroni granuli cerebellari da mouse postnatale.

Isolamento e la coltura di cellule post-Natal Neuron cerebellare granuli mouse progenitore e Neuroni

La corteccia cerebellare è una struttura ben descritta che offre opportunità uniche per lo studio delle proprietà e dello sviluppo neuronale1,2. Tra le...

Questa procedura inizia rimuovendo il cervelletto da P quattro a P cinque. Le meningi di topi neonati e il plesso coroideo vengono rimossi da ciascun cervelletto, che successivamente vengono raccolti in un tubo conico da 15 millilitri. I cervelletti vengono dissociati con la papaina e portati a una sospensione monocellulare mediante agitazione delicata.Questa sospensione viene filtrata per gravità attraverso una maglia di nylon con una dimensione dei pori di 70 micron. Il flusso filtrato viene delicatamente stratificato sopra un gradiente discontinuo di perca e centrifugato per separare le cellule granulari dalla glia in neuroni e neuroni del gene Perkin. Le cellule presenti all'interfaccia del gradiente vengono raccolte e seminate preliminarmente in piastre rivestite con poli-l-lisina.Per rimuovere ulteriormente le cellule gliali, le cellule granulari vengono raccolte, contate e seminate a densità desiderate su coprivetri rivestiti di poli-l-lisina o su piastre di coltura in plastica. Ciao, sono Hey Young Lee del laboratorio del Dott. Lloyd Green del Dipartimento di Anatomia Patologica dell'Università di Columbia. Oggi vi mostreremo una procedura per l'isolamento e la coltura di neuroni granulari cerebellari da topi postnatali.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la proliferazione e la differenziazione dei progenitori neurogenici dei granuli. Cominciamo dunque. Questa procedura inizia con l'uso di etanolo al 70% nell'area di dissezione per dissociare le cellule granulari del cervelletto; utilizziamo il sistema di dissociazione di Papin.All'inizio di un nuovo kit, preparare la soluzione inibitrice di albumina OVO equate MOID. Per fare ciò, prelevare 32 millilitri di soluzione salina equilibrata di Earl o EBSS, fornita nel kit, e aggiungerla alla miscela di albumina OVO moid. Metterla da parte durante la preparazione degli altri componenti per consentire la dissoluzione del contenuto.Successivamente, aggiungere cinque millilitri di EBSS a una provetta di papaina proveniente dal kit di dissociazione. Ogni provetta è sufficiente per dissociare da quattro a quindici cervelletti di topi P5. Quindi, collocare la provetta di papaina in un incubatore con 5% di CO₂ a 37 gradi Celsius per cinque-dieci minuti, fino a quando la papaina si sarà completamente sciolta e la soluzione apparirà limpida.Mantenere la soluzione a temperatura ambiente durante la dissezione. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di EBSS al vial 1D NAS del kit. Mescolare delicatamente agitando leggermente il vial.Dato che il DNAS è sensibile alla denaturazione meccanica, aggiungere 250 microlitri di questa soluzione al flaconcino di pepane per ottenere una concentrazione finale di 20 unità per mil e dello 0,005% di DNA; conservare il DNA rimanente per l'uso nei passaggi successivi. Una volta pronti strumenti e reagenti, procedere con la dissezione dei cervelletti e la rimozione delle meningi per questa procedura. Vengono utilizzati topi C57 neri sei tra i giorni postnatali quattro e sei.Questa fascia d'età è ottimale per la coltura di cellule granulari perché il numero di progenitori delle cellule granulari dello strato granulare esterno o EGL è massimo. Iniziare prelevando con pipetta 15 millilitri di HBSS con glucosio in una piastra di coltura tissutale in plastica da 60 millimetri e 10 millilitri in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Porre il tubo sul ghiaccio, pulire la testa del cucciolo con etanolo al 70%. Utilizzare forbici da dissezione per rimuovere la testa.Trasferire la testa nell'incubatore e trattenerla con pinzette in modo che la parte posteriore del cranio sia chiaramente visibile. Inserire le forbici da microdissezione nel forame magno per accedere al cervello, quindi tagliare in linea retta verso gli occhi. Utilizzare pinzette fine Dumont.Punto cinque, utilizzare la pinzetta per rimuovere la pelle e sollevare il cranio per esporre il cervello. Quindi staccare il cervelletto e la parte circostante del mesencefalo. Trasferirlo nella piastra contenente HBSS glucosio.Si noti che è più facile manipolare il cervelletto e rimuovere le meningi se il cervelletto è ancora attaccato al tessuto circostante. Successivamente, posizionare il tessuto sotto un microscopio stereoscopico. Quindi, utilizzare un paio di pinzette per fissare il cervelletto alla piastra.Utilizzare pinzette fini Dumont numero cinque per staccare delicatamente le meningi dal cervelletto e dalle zone tra i lobi. Si noteranno vasi sanguigni sulla superficie del cervelletto.Questi vasi sanguigni rappresentano un buon metodo per identificare le meningi. Continuare a rimuovere le meningi finché il cervelletto non assume un aspetto bianco opaco. Successivamente, separare il cervelletto dal resto del mesencefalo.Posizionarlo sul lato ventrale ed eliminare il plesso corioideo, che ha l'aspetto di un nastro di colore rossastro tra il cervelletto ventrale e il mesencefalo adiacente. Non appena il cervelletto è stato dissezionato, collocarlo in HBSS glucosio freddo nel tubo conico da 15 millilitri posto sul ghiaccio. Dopo aver dissezionato tre cervelli, sostituire la soluzione di dissezione con HBSS glucosio fresco.Man mano che acquisirai maggiore familiarità con la dissezione del cervelletto, cerca di ridurre il tempo di dissezione a non più di sei minuti per ogni cucciolo. Al termine delle dissezioni, procedi con la preparazione della sospensione cellulare. Passaggio per generare una sospensione cellulare a partire dalle dissezioni del cervelletto.Innanzitutto, rimuovere l'HBSS con glucosio dal tubo e sostituirlo con la soluzione di papaina. Sebbene il kit raccomandi di tagliare il tessuto in piccoli pezzi, abbiamo riscontrato che ciò non è necessario a quest'età. Collocare il tessuto e la soluzione di papaina in un incubatore a 5% CO₂ e 37 gradi per 15-20 minuti.Per quattro a otto cervelletti, incubare per 15 minuti. Per un numero maggiore, incubare fino a mezz'ora. Agitare delicatamente il tubo ogni tre o quattro minuti.Al termine dell'incubazione, iniziare il passaggio di rotazione: ricoprire una punta sterile per pipetta aerosol P 1000 con FBS aspirando e dispensando due volte. Ora centrifugare la miscela. Assicurarsi di pipettare delicatamente per evitare la formazione di bolle d'aria.Circa 10 movimenti su e gi&ugrave; con la pipetta sono sufficienti per dissociare il tessuto. La soluzione dovrebbe diventare torbida. Lasciare riposare la sospensione per 30-60 secondi in modo che eventuali frammenti grandi di tessuto non dissociato si depositino sul fondo del tubo.Sebbene le pipette di vetro lucidate a fuoco possano essere utilizzate per la titolazione, abbiamo riscontrato che i puntali sterili P1000 rivestiti con siero funzionano altrettanto bene. Successivamente, trasferire le cellule in sospensione in un nuovo tubo conico da 15 ml utilizzando un puntale di pipetta rivestito con siero, avendo cura di non prelevare i pezzi di tessuto non associati presenti sul fondo. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a circa 200 ×g per cinque minuti.A temperatura ambiente durante la centrifugazione, preparare il mezzo di sospensione per la risospensione. Per fare ciò, aggiungere 2,7 millilitri di EBSS in un tubo sterile. Quindi aggiungere 300 microlitri della soluzione ricostituita di inibitore albumina OVO MOID.Infine, aggiungere 150 microlitri della soluzione di DNA. Al termine della centrifugazione, scartare il soprannatante e risospendere immediatamente il pellet cellulare nella soluzione diluita di inibitore dell'albumina del DNA. Utilizzare nuovamente una punta di pipetta rivestita con siero per risospendere il pellet.Ora preparare un gradiente di densità discontinuo. A tale scopo, aggiungere cinque millilitri della soluzione inibitrice di albumina oval MOID in un tubo conico da 15 millilitri. Sovrapporre la sospensione cellulare sulla soluzione aggiungendo delicatamente le cellule lungo il lato del tubo, quindi centrifugare a circa 70 G per sei minuti.A temperatura ambiente, le cellule dissociate si depositano sul fondo del tubo mentre i frammenti di membrana rimangono all'interfaccia. Se si desidera ottenere colture arricchite in cellule granulari, non è necessaria ulteriore purificazione. Scartare il sopranatante e risospendere immediatamente il pellet in quattro millilitri di mezzo con FBS al 10% aggiungendo 50 microlitri di DNAasi.Filtrare questa sospensione per gravità attraverso una maglia di nylon con una dimensione dei pori di 70 micron. Questo passaggio rimuove le cellule non neuronali di grandi dimensioni e consente di ottenere una migliore sospensione di cellule singole. Successivamente, saltare il seguente passaggio di separazione su gradiente pericoloso e procedere direttamente al passaggio di semina cellulare.O se si desidera ulteriormente purificare le cellule granulari da glia e grandi interneuroni, procedere al gradiente per call. Passaggio: eliminare il sopranatante e sospendere immediatamente il pellet in due millilitri di HBSS con glucosio e 50 microlitri di DNAasi.Di nuovo, filtrare la sospensione attraverso una maglia di nylon. Prima di iniziare la separazione su gradiente di percoll, preparare due pipette Pasteur con la punta arrotondata a fiamma. Riscaldare delicatamente la punta di una pipetta fino a quando il bordo risulta liscio e il diametro interno è ridotto a circa metà delle dimensioni originali. Fare attenzione a non rendere l'apertura troppo piccola.Ora preparare il gradiente di percoll. Aggiungere 10 ml di soluzione di percoll al 35% in un tubo conico sterile da 50 ml. Successivamente, caricare 10 ml di percoll al 60% in una siringa sterile da 10 ml con ago spinale sterile applicato.Aggiungere delicatamente la soluzione al 60% per pozzetto sotto la soluzione al 35% facendo toccare la punta della siringa al fondo del tubo. Prestare attenzione a mantenere un'interfaccia netta tra i due strati. Successivamente, aggiungere le cellule sulla parte superiore del gradiente.Utilizzando una pipetta levigata a fuoco, aggiungere delicatamente le cellule lungo il lato del tubo senza disturbare l'interfaccia. Dopo aver stratificato attentamente le cellule, posizionare il tubo nella centrifuga. Iniziare la centrifugazione a circa 18 G. Aumentare la velocità di un passo ogni 20 secondi in modo da impiegare circa due minuti per raggiungere 1800 G. Dopo 10 minuti a 1800 G, ridurre gradualmente la velocità di un passo ogni 20 secondi.Al termine della centrifugazione, rimuovere e scartare lo strato superiore dell'interfaccia del gradiente. Questa interfaccia contiene grandi cellule ggl bikini e interneuroni. Successivamente, utilizzare una pipetta flame-polished per rimuovere con attenzione le cellule presenti all'interfaccia.Trasferire le cellule in una provetta da 50 ml. Se il volume dovesse essere superiore a 15 ml, suddividerle in due provette da 50 ml e risospendere in tre volumi di HB S'S glucosio, mescolando per inversione ripetuta. Centrifugare quindi per cinque minuti a 1100 ×g. Rimuovere ora il soprannatante e aggiungere 4 ml di mezzo contenente 10% di FBS e 50 microlitri di D ns reus.Sospendere delicatamente il pellet utilizzando una pipetta levigata a fiamma per ottenere una sospensione monocellulare. Una volta risospesi, procedere con il prepl. Le cellule preplano le cellule raccolte su una piastra rivestita con polilisina per 20 minuti.In un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Durante l'incubazione, le astroglie e le cellule più pesanti si depositeranno e aderiranno alle piastre, mentre i neuroni granulari piccoli e le cellule progenitrici neuronali rimarranno in sospensione o debolmente aderenti. Dopo 20 minuti, battere delicatamente sulla piastra per staccare le cellule granulari debolmente aderenti.Quindi trasferire la sospensione cellulare in una nuova piastra rivestita con poli-l-lisina e ripetere l'incubazione. Successivamente, raccogliere i neuroni granulari e le cellule progenitrici neuronali in un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 200 ×g per cinque minuti. Quindi risospendere il pellet in 1 ml di mezzo privo di siero e contare le cellule utilizzando un emocitometro.Infine, aggiungere mezzo privo di siero per raggiungere la densità cellulare desiderata per la semina a densità media. Per piastre a sei pozzetti, utilizzare circa 3,5-4 milioni di cellule per piastre a quattro pozzetti.Utilizzare 650.000 cellule. Mantenere le cellule in un incubatore a 37 gradi con 5% CO2. Cambiare completamente il mezzo 24 ore dopo il semina iniziale, quindi ogni due o tre giorni successivamente.Ecco alcune immagini di colture sane di neuroni granulari e cellule progenitrici, a 24 ore dal seeding e a sei giorni dal seeding. Queste cellule possono essere mantenute in coltura fino a due settimane.Si noti che entro 24 ore dal seeding, le cellule sane si distribuiranno uniformemente attorno ai coverslip o al fondo della piastra e svilupperanno prolungamenti. L'aggregazione cellulare e la presenza di varicosità sui prolungamenti indicano che le cellule sono in condizioni non ottimali o che il substrato di poli-l-lisina è tossico. Come mostrato nel diagramma, i progenitori dei neuroni granulari iniziano a differenziarsi subito dopo il seeding ed esprimono marcatori specifici.Rappresentativo della loro differenziazione. La proliferazione dei progenitori dei neuroni granulari può essere notevolmente prolungata aggiungendo sonic hedgehog al mezzo. È possibile aggiungere anche laminina come substrato, oltre alla polilisina, per favorire l'outgrowth dei neuriti.Queste caratteristiche della coltura di cellule granulari offrono un sistema per lo studio sia della biologia dei neuroni granulari sia della regolazione della differenziazione delle cellule progenitrici in neuroni. Vi abbiamo appena mostrato come isolare e coltivare progenitori e neuroni granulari cerebellari MAO. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che il rendimento approssimativo è di 4-5 × 10¹⁰.Dei sei cellule per cucciolo, le densità di semina possono variare tra e cinque volte il centro delle cinque cellule per centimetro quadrato. Pertanto, se il passaggio del gradiente al percoll viene omesso, otto cuccioli di topo al quinto giorno postnatale possono fornire un numero sufficiente di cellule per sei piastre di coltura a quattro pozzetti; secondo la mia esperienza, l'uso del passaggio con gradiente al percoll ridurrà la resa cellulare di circa il 25-30%. Tuttavia, la percentuale di neuroni granulari nelle colture aumenta dal 90-95% al 99%. Le cellule granulari arricchite ottenute senza il passaggio di separazione tramite gradiente al percoll sono state utilizzate per studiare la regolazione della proliferazione e della differenziazione dei progenitori dei neuroni granulari. Tuttavia, se le colture devono essere mantenute per più giorni in vitro, si raccomanda l'inclusione del passaggio con gradiente al percoll al fine di ridurre la contaminazione dei neuroni granulari da parte di cellule non neuronali in proliferazione.Inoltre, assicurarsi che le soluzioni utilizzate per preparare il gradiente per cot siano fresche, poiché un'errata tamponatura provoca una maggiore morte cellulare. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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