Name: calcium chloride dna uptake in e. coli
Uploaded: 2023-04-30T07:10:31.000Z
Duration: 10 min 54 s
Channel: JoVE

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Florida Department of Education

High School

Life Science

SC.912.L.16

SC.912.L.16.7

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

このプロトコルは、塩化カルシウム手順(12)の適応を用いて有能な大腸菌DH5αの調製および形質転換について説明する。
1. セットアップ
<ol><li>
機器
	<ul>
<li>分光 光度 計</li>
		<li>ソルバル遠心分離機(または同等)</li>
		<li>ベンチトップ遠心分離機</li>
		<li>ヒートブロックまたは水浴</li>
		<li>オービタルシェーカー</li>
		<li>ステーナリーインキュベーター</li>
		<li>ゲル鋳造トレイ</li>
		<li>まあ櫛</li>
		<li>電圧源</li>
		<li>ゲルボックス</li>
		<li>紫外線光源</li>
		<li>マイクロ波</li>
	</ul>
</li>
	<li>
ソリューションと試薬
	<ul>
<li>ルリア・ベルタニ(LB)スープ(10gカゼイン酵素加水分解物、5g酵母エキス、5g塩化ナトリウム1000 mLのH2O)</li>
		<li>カタボライト抑圧(SOC):(2%(w/v)トリプトン、0.5%(w/v)酵母エキス、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl 2、10mMMgSO4、および20mMグルコース)</li>
		<li>CaCl2-MgCl2 (80 mM MgCl2,20 mM CaCl2)溶液.</li>
		<li>M CaCl2溶液(細胞が直ちに形質転換される場合)または10%(v/v)グリセロールを含む0.1MCaCl2溶液(細胞が将来の使用のために凍結される場合)。</li>
		<li>LB寒天プレート</li>
		<li>LB寒天選択プレート(この実験では、プラスミド使用済みのアンピシリン耐性を付与するので、アンピシリン100μg/mLを含むLB寒天プレートを用いた)</li>
		<li>
大腸菌DH5α株</li>
		<li>プラスミド pUC19 DNA (100 pg/ μl)</li>
		<li>QIAprep スピン ミニプレップ キット (キアゲン)</li>
		<li>
ヒンドIII制限酵素</li>
		<li>1 kb プラス DNA はしご</li>
		<li>低融点アガローズ</li>
		<li>1X TAEバッファー(40mMトリスベース、20mM酢酸、1mM EDTA)</li>
		<li>臭化エチジウム (10mg/mL)</li>
	</ul>
</li>
	<li>
一般的な安全に関する注意事項 大腸菌DH5αは、バイオセーフティレベル1(BSL1)に分類されます。このカテゴリーの微生物は、健康な成人における感染の脅威をほとんどまたは全くもたらさない。しかし、微生物の慎重な操作が必要です。</li>
</ol>重要重要このプロトコルのすべてのステップは、無菌技術を使用して、指示がない限り氷または4°Cの温度で行われる必要があります。
2. プロトコル
<ol><li>大腸菌DH5αの凍結ストック(LBで成長した一晩培養から20%グリセロールで凍結)から、LB寒天プレート上で単離するための細菌をストリークアウトする。一晩37°C(16~20時間)でインキュベートしてください。</li>
	<li>単一のコロニーをチューブ内のLBスープの3 mLに接種します。一晩37°C(16-20時間)で210 rpmで揺れを成長させる。</li>
	<li>一晩培養のOD600を測定します。一晩培養を使用して、1リットルのフラスコで100 mLのLBスープをOD600=0.01に接種します。培養量がOD600=0.35(約3時間)に達するまで、分光光度計で37°CモニタリングOD600で激しく揺れる培養(210rpm)を15~20分ごとにインキュベートします。 注:変換を効率的に行うには、細菌細胞が指数関数的な成長段階にある必要があります。細胞の最大数は108細胞/mLである必要があり、大腸菌のほとんどの株はOD600=0.4に対応します。分光光度計を使用すると、OD600を測定することができ、細胞が適切な成長段階にあることを判断することができます。このプロトコルが細菌の他の株に使用される場合、この相関を決定するために、特定のOD600値でコロニー形成単位の数を決定するための較正が必要になります。</li>
	<li>培養物の50mLを2本の冷たいポリプロピレン遠心分離ボトルに移します。ボトルを氷の上に20分間置き、冷まします。</li>
	<li>2700g(ソルバルGSAローターで4100rpm)の遠心分離によって細胞を回収し、4°Cで10分間回収します。</li>
	<li>上清を取り除く。ボトルをパッドまたはペーパータオルの上に逆さまに置くことによって、メディアの最後の痕跡を排出します。</li>
	<li>各細菌ペレットをCaCl2-MgCl2(80 mM MgCl2、20 mM CaCl2)の30 mLに再ステーペンします。まず溶液の5 mLを追加し、ペレットが完全に溶解するまで慎重に旋回し、残りの25 mLの溶液を追加します。</li>
	<li>手順 2.4 を繰り返します。</li>
	<li>手順 2.5 を繰り返します。</li>
	<li>有能な細胞が直接形質転換される場合は、チューブを慎重に旋回することにより、各細菌ペレットをCaCl 2(0.1M)氷冷溶液の2mLに再ステージングします。ペレットがこの方法で再懸濁されない場合は、上下にゆっくりとピペッティング(気泡形成を避ける)によって再懸濁する。 あるいは、有能な細胞を凍結し、後で使用するために保存することができる。有能な細胞の凍結ストックを調剤するために、10%(v/v)グリセロールを含む0.1MCaCl2溶液の2mlでペレットを再中断する。このソリューションは、氷冷である必要があります。アリコット細胞懸濁液を氷冷1.5 mLポリプロピレンチューブ(チューブ当たり160μl)に注入。有能な細胞をドライアイス/エタノール浴で直ちに凍結する。チューブを-70°Cの冷凍庫に移します。</li>
	<li>CaCl2-処理細胞を形質転換するには、50 μlの有能な細胞を2つの1.5mlポリプロピレンチューブのそれぞれに移します。pUC19プラスミドDNAの1 μl(100 pg)をチューブの1つに加え、DNAなしで2番目のチューブを残します(陰性対照)。穏やかに混ぜる(気泡形成を避ける)。氷の上で30分間インキュベートします。 注:10μL以下の体積のDNAは50ng以下で、変換に使用する必要があります。</li>
	<li>チューブをヒートブロックに移し、42°Cで45度正確にインキュベートします。 注:ヒートショックは重要なステップです。温度またはインキュベーション時間を超えないようにしてください。</li>
	<li>容易に氷に管を移す。2分間インキュベートします。</li>
	<li>950 μLのSOC培地を加え、37°Cで1時間チューブをインキュベートし、プラスミドにコードされた抗生物質耐性マーカーを回収して発現させます。</li>
	<li>SOCで1000 μLの細胞懸濁液の10μLを希釈し(1/100希釈)、SOCで1000μLの細胞懸濁液の100μL(1/10希釈)。希釈のプレート100μlは、コントロールと同様に、選択的プレート上に、へらを用いて広がる。通常、1/100および1/10希釈のメッキ100 μLは、プレートあたり十分な数のコロニー形成単位(cfu)をもたらすでしょう。理想的には、この数は30~300 cfuの範囲で、十分なコロニーがあるが互いに分離している必要があります。ただし、cfu の数は変換効率によって異なります (データ分析と結果セクションを参照)。</li>
	<li>プレートを37°Cでインキュベートします。形質転換されたコロニーは12〜16時間で現れるはずです(この範囲は細胞株と選択方法によって異なります)。ネガティブコントロールでコロニーが成長してはなりません。</li>
	<li>変換のために得られたcfu/プレートをカウントします(表1)。</li>
	<li>pUC19プラスミドを持つ形質転換体を確認するために、プラスミド調製およびその後の消化が行われる。この目的のために、チューブ内のLBスープの3ミリリットルに単一のコロニーを接種します。一晩37°C(16-20時間)で210 rpmで揺れを成長させる。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、QIAprepスピンミニプレップキットを使用してプラスミド製剤を準備します。</li>
	<li>精製したpUC19の1μgを37°Cで1時間37°Cで消化する。 注:pUC19複数のクローニング部位で切断する酵素は、このステップに使用できます。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>量</td>
		</tr>
<tr>
<td>10X 制限ダイジェスト バッファ</td>
			<td>2.5 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>プラスミド pUC19</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>
ヒンドIii</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>20.5 μl (25 μl まで)</td>
		</tr>
</tbody></table><ol start="21"><li>分子量はしご、消化されたpUC19 DNAおよび同量の未消化pUC19 DNAを1%のアガロースゲルで95Vで1時間の臭化物を含む。 注:時間と電圧は、使用する機器によって異なります。</li>
	<li>紫外線の下でゲルを視覚化します。消化されたpUC19 DNA(図2)の大きさを比較する(データ分析と結果セクションを参照)。 各特定の変換実験の目標に従って変換を検証するために必要な手順を進めます。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig2.jpg"> 図2:形質転換DH5α細胞からの回収プラスミドDNAの消化。プラスミドDNAは形質転換されたDH5α細胞から回収し、ヒンdIIIで消化し、1%のアガロースゲルで走り、UV源で可視化した(ステップ2.19~2.22)。
3. データ分析と結果
形質転換効率を計算するには、細胞が細胞外DNAをどの程度よく取り上げたかを示す指標で、形質転換で得られたコロニーをカウントする必要があります。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>希釈</td>
			<td>Cfu</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/100</td>
			<td>34</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/10</td>
			<td>246</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:コロニー形成単位(cfu)は、形質転換実験からカウントされた。
形質転換効率(TE)は、1μgのプラスミドを所定の容積の有能な細胞に変換することから生じるcfuの数の尺度である。多くのパラメータは、プラスミドサイズ、細胞遺伝子型、能力準備中の成長段階、変換方法など、変換効率に影響を与えます。TE を計算する際には、めっき前に行われた希釈(もしある場合)を考慮し、cfuの総数の計算に組み込むことが重要です。変換効率 (TE) は、次の式で計算されます。
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq1.jpg">
まず、この例では0.0001μgのDNAのμgでcfuを分割します。次に、結果を希釈係数で除算します。この例では、1/10希釈を用いて、1ml溶液の100μLをめっきした(希釈:1/10×100μL/1000 μL=0.01)。
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq2.jpg">

形質転換は、研究室の多くの分子生物学アプリケーションの鍵となる細菌細胞に外因性DNAを導入するための強力な方法です。さらに、細菌細胞が遺伝性の変化を増加させ、幅広い条件下で生存のための異なる有益な形質の獲得を可能にする遺伝物質を交換できるようにすることで、自然界で大きな役割を果たしています。多くの細菌株は、自然な能力に必要な遺伝子をコードします。しかし、これらの遺伝子が誘導される条件はまだ不明である。これらの条件を決定するためにさらなる研究が必要です。.

適応塩化カルシウム手順を用いて大腸菌細胞の形質転換

ソース: ナタリア・マーティン1, アンドリュー・J・ヴァン・アルスト1, リアノン・M・ルヴェーク1, ビクター・J・ディリタ1 1ミシガン州立大学微生物学・分子遺伝学専攻
細菌は、水平遺伝子導入として知られているプロセスで遺伝物質(デオキシリボヌクレイン酸、DNA)を交換する能力を有する。外因性DNAを組み込むことは、細菌が自然の生息地に見られる抗生物質や抗体(1)または分子の存在など、変化する環境条件に適応することを可能にする新しい遺伝的形質を獲得できるメカニズムを提供する。(2)水平遺伝子導入には、形質転換、経転移、共役の3つのメカニズムがある(3)ここでは、環境から自由なDNAを取り込む細菌の能力、形質転換に焦点を当てます。実験室では、形質転換プロセスには、4つの一般的なステップがあります:1)有能な細胞の調製、2)DNAを用いて有能な細胞のインキュベーション、3)細胞の回収、および4)形質転換剤の増殖のための細胞のめっき(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig1.jpg"> 図 1: 変換プロセスの一般的な手順。形質転換プロセスには、4つの一般的なステップがあります:1)有能な細胞の調製、2)DNAによるインキュベーション、3)細胞の回収、4)形質転換剤の増殖のためのめっき細胞。
変換が起こるには、レシピエント細菌が能力と呼ばれる状態である必要があります。一部の細菌は、特定の環境条件に応じて自然に有能になる能力を持っています。しかし、他の多くの細菌は自然に有能にならないか、またはこのプロセスの条件はまだ不明です。DNAを細菌に導入する能力は、目的とするDNA分子の複数のコピーを生成し、大量のタンパク質を発現させる、クローニング手順の構成要素として、他の研究用途の範囲を持っています。分子生物学への変換の価値のために、自然な能力のための条件が不明な場合に細胞を人工的に有能にすることを目的としたいくつかのプロトコルがあります。人工的に有能な細胞を調造するには、1)細胞の化学処理を通じて、2)細胞を電気パルス(エレクトロポレーション)にさらす2つの主な方法が使用されます。前者は、DNAと細胞表面の間に引力を生み出す手順に応じて異なる化学物質を使用し、後者は電界を使用してDNA分子が入り込むことができる細菌細胞膜の細孔を生成します。化学的能力のための最も効率的なアプローチは、二価陽イオンを用いてインキュベーションであり、最も顕著なカルシウム(Ca2+)(4,5)カルシウム誘発能力は、ここで説明する手順である(6)。この方法は、主にグラム陰性細菌の形質転換に使用され、それはこのプロトコルの焦点になります。
化学的変換の手順は、細胞が化学的能力を誘発するために陽イオンにさらされる一連のステップを伴う。これらのステップは、その後、温度変化-ヒートショック-有能な細胞による外来DNAの取り込みを支持する(7)。細菌細胞の封筒は負の帯電である。大腸菌のようなグラム陰性菌では、外膜はリポ多糖(LPS)の存在により負の帯電(8)である。これにより、同様に負電荷を帯んだDNA分子の反発が生じる。化学的能力誘導において、正に帯電したカルシウムイオンは、この電荷反発を中和し、細胞表面へのDNA吸光を可能にする(9)。DNAによるカルシウム処理とインキュベーションは氷上で行われます。続いて、より高い温度(42°C)でのインキュベーション、ヒートショックが行われる。この温度の不均衡は、DNAの取り込みをさらに有利にします。細菌細胞は、ヒートショック治療に耐えるために、中指数成長期である必要があります。他の成長段階では、細菌細胞は熱に敏感になりすぎて、変換効率が大幅に低下する生存率の損失をもたらす。
異なるDNA源を変換に使用できます。典型的には、プラスミドは、小さな円形、二本鎖DNA分子、大腸菌におけるほとんどの実験室手順における形質転換に使用される。プラスミドを形質転換後に細菌細胞に維持するには、複製の起源を含む必要があります。これにより、細菌染色体とは独立して細菌細胞内で複製することができる。すべての細菌細胞が形質転換手順中に変換されるわけではありません。したがって、形質転換は、形質転換された細胞と非形質化された細胞の混合物をもたらす。これら2つの集団を区別するために、プラスミドを獲得した細胞を同定する選択方法が用いられる。プラスミドは通常、選択可能なマーカーを含み、これは成長の利点を与える形質をコードする遺伝子である(すなわち、抗生物質または化学的または成長性の補助性からの救助に対する耐性)。形質転換後、細菌細胞は選択的培地上にめっきされ、形質転換細胞の増殖のみが可能となる。所定の抗生物質に対する耐性を与えるプラスミドで形質転換した細胞の場合、選択的培養剤はその抗生物質を含む増殖培養剤となる。選択的培養剤中に成長したコロニーが形質転換体であることを確認するためにいくつかの異なる方法を使用することができます(すなわち、プラスミドを組み込んだ)。例えば、プラスミドはプラスミド調製法(10)を用いてこれらの細胞から回収し、プラスミドサイズを確認するために消化することができる。あるいは、コロニーPCRは、目的のプラスミド(11)の存在を確認するために使用することができる。
この実験の目的は、塩化カルシウム手順(12)の適応を用いて大腸菌DH5α化学的に有能な細胞を調作し、プラスミドpUC19でそれらを変換して変換効率を決定することである。大腸菌株DH5αは、分子生物学アプリケーションで一般的に使用される株です。その遺伝子型、特にrecA1およびendA1のために、この株は挿入安定性を高め、その後の調製におけるプラスミドDNAの質を改善することを可能にする。DNAのサイズが大きくなると形質転換効率が低下するため、プラスミドpUC19はサイズが小さい(2686 bp)のでこのプロトコルで使用された(https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html参照ベクトルマップ)。pUC19はアンピシリンに対する耐性を付与し、したがって、これは選択に使用される抗生物質であった。

TEは多くの要因に依存しているが、このような非商業的な有能な細胞製剤は、通常、プラスミドのマイクログラム当たり106〜10 7形質転換体を得る。したがって、この調製物は、TE= 2.46 x 108 cfu/μgを有し、TEが予想範囲をはるかに超えた。特定のアプリケーションに対して高い変換効率が必要な場合に、超有能なセルを作成するための追加のプロトコルが利用可能です (13) .
形質転換細胞から回収されたプラスミドDNAの消化の分析は、このプラスミドがpUC19 DNA(2686 bp)の期待サイズを有することを示した。

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

バクテリアは非常に適応性が高く、この適応を促進するメカニズムの1つは、外部のDNA分子を取り込む能力です。細菌が取り込むことができるDNAの一種はプラスミドと呼ばれ、抗生物質耐性遺伝子などの有用な情報を頻繁に含む環状のDNAです。外部から取り込まれた新しい遺伝情報によって細菌が改変される過程は、形質転換と呼ばれます。形質転換は、大腸菌または大腸菌を使用して実験室で簡単に行うことができます。形質転換されるためには、大腸菌細胞はまず、環境からDNA分子を取り込むことができる能力を持つ必要があります。これを達成するためのプロトコルは驚くほど簡単で、塩化カルシウム溶液中で細胞を短時間インキュベートします。このインキュベーションにより、細胞はDNA分子に対して透過性になります。細胞を遠心分離によってペレット化した後、上清を除去します。プラスミドDNAは、コンピテントセルに追加されます。細胞をDNAとインキュベートした後、混合物を摂氏42度に短時間加熱した後、氷上で急冷します。この熱ショックにより、DNAは細胞の壁と膜を横切って移動されます。その後、細胞を新鮮な培地でインキュベートします。次に、バクテリアを37度に配置して、膜を再シールし、耐性タンパク質を発現できるようにします。プラスミドを取り込んだ細胞は、DNAを忠実にコピーして子孫に渡し、抗生物質耐性メディエーターを含む、DNAによってコードされる可能性のあるタンパク質を発現します。これらの耐性遺伝子は、プラスミドを取り込んでいない細胞は耐性遺伝子産物を発現しないため、形質転換に成功した細菌を同定するための選択マーカーとして使用できます。これは、適切な抗生物質を含む固体培地に細胞を播種すると、プラスミドを取り込んだ細胞のみが増殖することを意味します。成長中のコロニーにおける細胞の形質転換は、サンプルからDNAを抽出する前に、それらの細胞を液体培地で一晩培養して収量を増やすことで、さらに確認することができます。DNAが単離されると、診断用制限酵素消化を行うことができます。制限酵素は予測可能な位置でDNAを切断するため、これらの消化物をゲル上で分析すると、目的のプラスミドがうまく形質転換された場合、予測可能なパターンが示されるはずです。例えば、pUC19を調製し、制限酵素HindIIIで切断すると、ゲル上に2686ヌクレオチドの単一バンドが見られるはずです。本研究室では、DH-5 Alpha株をpUC19で形質転換し、DNAゲル電気泳動により形質転換が成功することを確認します。手順を開始する前に、白衣や手袋などの適切な個人用保護具を着用してください。次に、ワークスペースを70%エタノールで滅菌します。次に、滅菌LB寒天プレートにループいっぱいの細菌を沈着させ、新しいループで細菌をストリーキングすることにより、化学的にコンピテントな細胞を調製します。その後、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、ベンチトップを再び70%エタノールで滅菌し、プレートをインキュベーターから取り出します。1つの十分に分離されたコロニーを、滅菌ループ付きのチューブ内の3ミリリットルのLBブロスに接種します。次に、210 RPMで振とうしながら、摂氏37度で一晩培養します。翌日、分光光度計で一晩の培養物の光学密度を測定します。次に、1リットルのフラスコに100ミリリットルのLBブロスを加え、光学濃度0で一晩培養して接種します。01.次に、培養物を摂氏37度で振とうしながらインキュベートし、培養物が中指数関数的成長段階に達するまでOD600を15〜20分ごとにチェックします。約3時間後、50ミリリットルの培養物を2本の氷冷ポリプロピレンボトルに移します。次に、ボトルを氷の上に20分間戻し、冷まします。次に、遠心分離により細胞を回収します。上清を捨て、ボトルを逆さまにしてペーパータオルの上に置きます。次に、バクテリアペレットを5ミリリットルの氷冷塩化カルシウム塩化マグネシウム溶液に再懸濁し、ペレットが完全に溶解するまで慎重に渦巻きます。次に、溶解した細菌ペレットにさらに25ミリリットルの溶液を追加します。前に示したように、他の細菌ペレットを再懸濁します。.この後、遠心分離を繰り返し、上清を取り除きます。コンピテントセルを直接形質転換する場合は、チューブを慎重に回転させて、氷冷した0.1モル塩化カルシウム溶液の2ミリリットルに各細菌ペレットを再懸濁します。形質転換手順を開始するには、50マイクロリットルのコンピテントセルを2本の標識1.5ミリリットルポリプロピレンチューブに移します。次に、チューブの1つに1マイクロリットルのpUC19プラスミドDNAを加えます。気泡が発生しないように穏やかに混合し、両方のチューブを氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブをヒートブロックに移し、摂氏42度で45秒間インキュベートします。すぐにチューブを氷に移し、2分間インキュベートします。次に、各チューブに950マイクロリットルのSOC培地を追加し、摂氏37度で1時間インキュベートして細菌を回復させ、プラスミドにコードされた抗生物質耐性マーカーを発現させます。1〜100希釈するには、990マイクロリットルのSOC培地と10マイクロリットルの細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに加えます。次に、1.5ミリリットルのチューブに900マイクロリットルのSOC培地と100マイクロリットルの細胞懸濁液を加えて、1〜10希釈します。次に、希釈した細胞懸濁液100マイクロリットルとネガティブコントロール100マイクロリットルを、アンピシリンを含む別々の選択プレート上にスプレッダーを用いてプレート化し、プレートを摂氏37度で12〜16時間インキュベートする。インキュベーション後、形質転換によって得られたプレートあたりのコロニー形成単位(CFU)をカウントし、これらのデータを記録します。形質転換体がpUC19プラスミドを持っていることを確認するには、滅菌ループのあるプレートから十分に分離された単一のコロニーを選択し、それを3ミリリットルのLBブロスを含むチューブに導入します。次に、培養物を摂氏37度で振とうしながら一晩インキュベートします。翌日、DNA Mini Prep Kitを使用して、製造元の指示に従って、培養物の3 mLからDNAを単離します。DNAミニ調製が完了したら、精製したpUC19 1 μgを制限酵素で摂氏37度で1時間消化します。次に、20マイクロリットルの分子量ラダー、1マイクログラムの消化プラスミドDNA、および1マイクログラムの未消化プラスミドDNAを、1ミリリットルあたり1マイクログラムの臭化エチジウムを含む1%アガロースゲルの連続ウェルにロードします。その後、ゲルを95ボルトで1時間泳がせます。最後に、UVイルミネーターでゲルを視覚化します。この実験では、塩化カルシウム手順の適応を使用して大腸菌DH5アルファ化学的にコンピテントな細胞を調製し、プラスミドpUC19で形質転換して形質転換効率を決定しました。形質転換効率を計算するには、100分の1および10分の1の希釈、およびCFUカウントが30〜300のその他の希釈について記録されたCFUカウントを使用します。まず、記録されたCFU数(この例では246)を、めっきしたDNA(ここでは0.0001マイクログラム)で割る。次に、この数値を希釈係数で除算して、マイクログラムあたりのCFU単位の形質転換効率を求めます。この例では、1〜10の希釈を使用し、1ミリリットルの溶液の100マイクロリットルをめっきし、最終希釈係数を0.01にしました。未消化のプラスミドレーンでは、環状DNAは、明るさの異なる2つまたは3つの異なるバンドとして現れることがあります。これは、環状の未切断のDNAが、スーパーコイル状、白円状、またはより直線状であるなど、いくつかの異なるコンフォメーション状態で存在し、それぞれが異なる速度でゲル内を移動するためです。回収されたプラスミドDNA消化の分析により、使用されたプラスミドは、予想されるサイズのpUC19 DNA(2,686塩基対)であることが示されました。

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calcium chloride dna uptake in e. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency.

Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation. Transformation is the process in which bacteria take up free DNA from the environment. In the lab, it usually includes four steps: preparing competent cells, mixing cells with DNA, recovering the cells, and plating them so transformants can grow.

For transformation to occur, cells must be competent, which means they can take in DNA. Some bacteria become naturally competent under certain conditions. Others do not, or the conditions are not known. For that reason, scientists often make cells artificially competent. Two common approaches are chemical treatment and electroporation, which uses electric pulses to open pores in the cell membrane.

This protocol uses calcium ions, especially Ca2+, to create chemical competence. It is mainly used with Gram-negative bacteria. E. coli cells and their outer membrane carry negative charge, and DNA is also negatively charged. Calcium helps neutralize this repulsion so DNA can attach to the cell surface. The cells and DNA are kept on ice during this step, and then a heat shock at 42°C helps drive DNA into the cells.

The cells must be in mid-exponential growth phase before heat shock. At other growth stages, they are more sensitive to heat and may lose viability. That lowers transformation efficiency. The DNA used for transformation is usually a plasmid, which is a small circular double-stranded DNA molecule. To stay in the cell after transformation, the plasmid must have an origin of replication so it can copy itself independently of the bacterial chromosome.

Not every cell becomes transformed, so the result is a mix of transformed and non-transformed cells. To find the cells that received the plasmid, the procedure uses selection. Plasmids often carry selectable markers, such as antibiotic resistance genes or genes that rescue a growth need. After transformation, the cells are plated on selective media. In this case, the media contains ampicillin, which allows only the transformed cells to grow.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

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enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

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Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

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Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

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Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

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Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

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Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

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Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

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Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

このコレクションは、適切な滅菌技術と播種、選択培地の使用方法と試料の濃縮方法、混合または純粋試料の培養方法など、微生物学研究の主要なツールを示しています。さらに、微生物分離株を同定するための一般的な方法、および細菌の遺伝子操作の手順についても説明します。

See how calcium chloride makes E. coli competent for DNA uptake, then use heat shock and ampicillin selection to identify transformants.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli | JoVE K12

Natalia Martin

Andrew J. Van Alst

Rhiannon M. LeVeque

Victor J. DiRita

Department of Microbiology and Molecular Genetics

Michigan State University

Concepts

Performing the Experiment

Results

Genetic Lingo

Overview

An organism is diploid if it inherits two variants, or alleles, of each gene, one from each parent. These two alleles constitute the genotype ...

Punnett Squares

Overview

A Punnett square displays the possible genotypes offspring can inherit from two parental genotypes. If a trait&#x2019;s inheritance pattern ...

Monohybrid Crosses

Overview

In the 1850s and 1860s, Gregor Mendel investigated inheritance by performing monohybrid crosses in pea plants. He crossed two plants that were ...

Dihybrid Crosses

Overview

To determine whether traits are inherited together or separately, Gregor Mendel crossed pea plants that differed in two traits. These parental ...

Law of Segregation

When crossing pea plants, Mendel noticed that one of the parental traits would sometimes disappear in the first generation of offspring, called the F1 ...

Law of Independent Assortment

While Mendel&#x2019;s Law of Segregation states that the two alleles for one gene are separated into different gametes, a different question of how ...

Test Cross

Alleles are different forms of the same gene. Humans and other diploid organisms inherit two alleles of every gene, one from each parent.

An allele is ...

Pedigree Analysis

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Use Mendel's laws of segregation and independent assortment to analyze patterns of inheritance.

SC.912.L.16.1

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Discuss observed inheritance patterns caused by various modes of inheritance, including dominant, recessive, codominant, sex-linked, polygenic, and multiple alleles.

SC.912.L.16.2

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Describe the basic process of DNA replication and how it relates to the transmission and conservation of the genetic information.

SC.912.L.16.3

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

Mutations

Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

Mutation, Gene Flow, and Genetic Drift

In a population that is not at Hardy-Weinberg equilibrium, the frequency of alleles changes over time. Therefore, any deviations from the five conditions ...

Explain how mutations in the DNA sequence may or may not result in phenotypic change. Explain how mutations in gametes may result in phenotypic changes in offspring.

SC.912.L.16.4

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

RNA Structure

The basic structure of RNA consists of a string of ribonucleotides attached by phosphodiester bonds. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

Types of RNA

Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs perform diverse ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Bacterial RNA Polymerase

Eukaryotic RNA Polymerases

General Transcription Factors

Tissue-specific transcription factors contribute to diverse cellular functions in mammals. For example, the gene for beta globin, a major component of ...

RNA Polymerase II Accessory Proteins

Transcription Elongation Factors

pre-mrna-processing-modification-of-pre-mrna-ends

Pre-mRNA Processing: Modification of pre-mRNA Ends

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Pre-mRNA Processing: RNA Splicing

Transfer RNA Synthesis

Ribosomal RNA Synthesis

The Nucleolus

Additional Subnuclear Structures

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

Improving Translational Accuracy

Nonsense-mediated mRNA Decay

Molecular Chaperones and Protein Folding

The Proteasome

Regulated Protein Degradation

Proteins: From Genes to Degradation

Explain the basic processes of transcription and translation, and how they result in the expression of genes.

SC.912.L.16.5

Chromatin Structure and RNA Splicing

Alternative RNA Splicing

Nuclear Export of mRNA

Discuss the mechanisms for regulation of gene expression in prokaryotes and eukaryotes at transcription and translation level.

SC.912.L.16.6

Molecular Cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

Recombineering and Gene Targeting

One of the most widely used tools in modern biology is molecular cloning with restriction enzymes, which create compatible ends between DNA fragments that ...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

CRISPR

Bacterial Transformation

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Bacterial Transformation
ExpandFirst, ensure that each student or student group has a filled ice bucket.
Then, set up a tube rack for each work station.
...

Bacterial Transformation
ExpandIMPORTANT: In addition to wearing the appropriate personal protective equipment, be sure to take care to keep your face ...

Describe how viruses and bacteria transfer genetic material between cells and the role of this process in biotechnology.

What is the Cell Cycle?

The cell cycle refers to the sequence of events occurring throughout a typical cell&#8217;s life. In eukaryotic cells, the somatic cell cycle has two ...

Explain the relationship between mutation, cell cycle, and uncontrolled cell growth potentially resulting in cancer.

SC.912.L.16.8

A. DNA stores and transmits genetic information. Genes are sets of instructions encoded in the structure of DNA.

B. Genetic information is passed from generation to generation by DNA in all organisms and accounts for similarities in related individuals.

C. Manipulation of DNA in organisms has led to commercial production of biological molecules on a large scale and genetically modified organisms.

D. Reproduction is characteristic of living things and is essential for the survival of species.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

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