Name: dna extraction, quantification, and cutting
Uploaded: 2019-01-31T09:26:45.000Z
Duration: 4 min 46 s
Channel: JoVE

K12 Standards

north-carolina-k-12-science-standard-course-of-study

North Carolina K-12 Science Standard Course of Study

9-12

Biology

heredity-inheritance-and-variation-of-traits

Heredity- Inheritance and Variation of Traits

LS.Bio.8.1

dna-isolation-and-restriction-enzyme-analysis

DNA Isolation and Restriction Enzyme Analysis

DNA抽出とは、細胞からDNAを除去して精製することです。まず、細胞は溶解されます-壊れて開きます-通常は、物理的な混乱と化学物質(細胞と核膜を溶解する洗剤など)による処理の組み合わせによって行われます。SDSまたはドデシル硫酸ナトリウムは、これらの膜を構成するタンパク質と脂質を可溶化することによって機能する一般的に使用される洗剤です。その後、内容物は周囲の溶液に自由に浮かぶことができます。

次に、DNAは存在する他の分子から分離する必要があります。反応に添加されたプロテイナーゼKは、ペプチド結合を分解し、汚染タンパク質を消化します。次に、塩をサンプルに添加すると、DNAの骨格内の負に帯電したリン酸基が安定化し、氷冷アルコールを添加した後、DNAが溶液から沈殿します。白い沈殿物は、遠心分離機で回転させ、チューブの底に沈殿させることによって収集されます。洗浄して緩衝液に再懸濁した後、抽出されたDNAは最終的に研究やバイオテクノロジーアプリケーションで使用できます。

DNAフィンガープリント法など、特定のDNAの新規パターンを特定できるバイオテクノロジーアプリケーションには、制限酵素の使用が含まれます。制限酵素は、DNAと相互作用し、特定の配列を認識する分子です。特定の部位が特定されると、DNAを切断します。これにより、ストランドが1つ以上の直線状に切断されます。抽出されたDNAがプラスミド、つまり細菌に最も多く見られるDNAの環状片であった場合、切断するとDNAは線状フラグメントを形成します。異なる制限酵素は異なるDNA配列を認識するため、これらを組み合わせて使用すると、異なるフラグメントが生成される可能性があります。

DNAフィンガープリント法では、DNAまたはゲル電気泳動と呼ばれる技術を使用してこれらのフラグメントを調べることができます。ゲルを調製するために、粉末アガロースを緩衝液と混合し、溶解するまで加熱する。次に、ヌクレオチド染色を温かい混合物に加え、この溶液を鋳造型に注ぎます。櫛を挿入してウェルを形成します。固化したら、ゲルをバッファーで満たされたゲルボックスに移し、コームを取り除きます。既知の長さの染色されたDNA断片の参照混合物であるDNAラダーを1つのウェルに加え、目的の染色されたDNAサンプルを残りのウェルにロードします。ボックスは電源に接続されており、電源を入れると、DNAヌクレオチド中の負に帯電したリン酸基がゲルを介してアノード(正端)に向かって移動します。小さな破片は、移動が困難な大きな破片よりも速く移動します。

ランが完了したら、ゲルを紫外線にさらして、DNAサンプル中のヌクレオチド染色を視覚化します。それらの存在は、はしごバンドに対する相対的な位置に基づいて確認できます。配列が異なるDNAは、異なる場所に切断部位を持つため、新しいバンドパターンやフィンガープリントが生成され、これを使用して個体や変異DNAプロファイルを区別できます。

このラボでは、SDSの有無にかかわらずバッファーを使用してDNA抽出を行い、DNA単離における界面活性剤の重要性を評価し、さまざまな制限酵素でプラスミドDNAを消化して、得られたDNAプロファイルを調べます。

dna単離および制限酵素解析

DNAがすべての生物の遺伝分子であることの解明は、科学と医学の大きな進歩をもたらし、自分自身や他の生物に対する私たちの理解を著しく高めました。DNAの単離とプロファイリングは、前世紀の多くの進歩の基本的な第一歩でした。遺伝子機能の同定から、農業や法医学の革命まで。

<h4>細胞からのDNAの単離</h4>

DNAの単離は、細胞の回収、溶解、タンパク質の分解、そして最後にDNAの沈殿という、いくつかの重要なステップを必要とする非常に単純な手順です。一般に、DNAは、植物の一枚の葉、動物の毛包、上皮細胞など、単純な生理食塩水で口の中で簡単に剥がすことができる少量の組織から採取できます。DNAは真核細胞内の核またはミトコンドリア内で区画化されているため、科学者は最初に細胞と核膜を分解してDNAを露出させます。しかし、DNAが露出すると、重金属イオンや極端なpHによって劣化する可能性があります。そのため、界面活性剤含有緩衝液は、細胞膜を溶解するだけでなく、溶液中の分解要素からDNAを保護するためにも使用されます。さらに、DNAは異常に長い分子であり、ヒストンと呼ばれる特殊なタンパク質の周りに密集することにより、核内に凝縮されています。そこで、タンパク質のペプチド結合を分解するプロテイナーゼKという酵素を付加して、ヒストンや他のタンパク質からDNAを分離します。次に、科学者は、その化学的特性を使用して、細胞抽出物の残りの部分からDNAを分離します。核酸の負に帯電した構造により、塩化ナトリウム溶液中のNa+イオンは、絡み合ったDNA鎖に結合して統合します。DNAが凝集すると、肉眼で観察できます。DNAはアルコールに不溶で、低温で容易に沈殿するため、科学者は冷たいアルコールを加えてDNAを沈殿させます。最後に、沈殿したDNAは、核酸を分解する可能性のある酵素を含まない脱イオン水またはマイルドバッファーに溶解して保存することができます。

<h4>DNAの定量</h4>

DNAを使用する反応では、多くの場合、高純度で正確な量のDNAが必要です。したがって、DNA単離後、科学者は分光光度計を使用して、サンプル中のDNAの量とサンプル中のDNAの純度を定量化します。分光光度計は、サンプルを通過する光ビームの強度を、その波長の関数として測定します。核酸は260nmで光を吸収し、タンパク質は280nmで光を吸収します。260nmの光ビームの強度を測定することで、科学者はDNA濃度を決定できます。さらに、260 nmと280 nmの両方で光強度を評価することにより、DNA含有量の純度を決定できます。純粋なDNAのサンプルでは、260/280 nmの比率は2の値に近づくはずです。

<h4>制限酵素</h4>

クローニング、シーケンシング、DNAフラグメントやゲノムのマッピングなど、多くの解析では、制限酵素を使用して単離されたDNAを特定の配列で切断する必要があります。これらの酵素は、侵入したウイルスDNAに対する自然免疫のメカニズムとして細菌によって産生され、分子のはさみとして機能します。したがって、制限酵素はウイルスDNAを同定した後、認識する特定のヌクレオチド配列でセグメントに切断することにより、ウイルスDNAをバラバラにし始めます。これらのヌクレオチド配列は、多くの場合、6〜12ヌクレオチド長で、一般に回文性であり、これは、3'-5'および5'-3'方向に同じヌクレオチド配列を有することを意味する。例えば、制限酵素EcoRIは、配列3'でDNAを切断します...GAATTC...-5' は 5'-3' 方向で同じ読み取りを行います。EcoRIと同様に、多くの異なる回文配列に対応する何百もの酵素があります。これらの酵素によってDNAが切断されると、科学者はDNAを電気泳動チャンバー内のゲルにロードし、ゲルに電流を流すことができます。DNAは負の電荷を持っているため、DNA断片がアノードに向かって移動します。しかし、ゲルの細孔は、小さなDNA配列に比べて大きなDNA断片を遅くするため、断片はそのサイズに応じて分離します。電気泳動の完了後、DNA分子に特異的に結合する色素を用いてDNA断片を可視化することができます。

制限酵素でDNAを切断し、電気泳動でDNA断片を分離することで、研究者は標準的なラダーと比較して未知の断片のサイズを特定できます。これらの目的のフラグメントは、さらに単離し、遺伝子クローニングのためのプラスミドベクターにライゲーションすることができます。これらの方法により、遺伝子工学と実験室での分析は大幅に改善されました。DNAプロファイリングにより、科学者はゲノムの配列を解読して生物の働きをさらに理解することができ、特定の遺伝子1を特定して特徴付けすることもできます。

DNAの単離とプロファイリングは、日常生活に直接影響を与えるイベントにも実用的です。例えば、法医学者は、刑事事件や民事事件の証拠を提供するために、日常的にDNAサンプルを分析しています2。同様に、医療従事者はDNAを抽出して分析し、父子病や遺伝性疾患をチェックします。最近、DNA祖先分析キットは、ユーザーが自分の遺伝的系統を特定し、親戚を見つけ、さらにはさまざまな健康状態に対する遺伝的素因を発見することができることで人気を博しました3。最後に、バイオテクノロジーと遺伝子工学の進歩により、個別化医療は、個人の遺伝子データを使用して治療法を開発する臨床研究者の間で勢いを増しており、有害な副作用なしに患者を効果的に治療する道が開かれています4。

<h4>参照</h4>

<ol class="references">
	<li>チェンバース、GK、他。動物学におけるDNAフィンガープリント:過去、現在、未来。Investig Genet. 2014年、第5巻、3 doi:10.1186/2041-2223-5-3。</li>
	<li>ローワー、L.法医学におけるDNAフィンガープリント:過去、現在、未来。調査ジェネ。 2013年、第4巻、22 doi:10.1186/2041-2223-4-22。</li>
	<li>カークパトリック、BEおよびラシュキン、MD。祖先検査と遺伝カウンセリングの実践。J Genカウンセリング。 2016年、第26巻、1(6-20)。</li>
	<li>マサチューセッツ州ハンブルクとFSのコリンズ。個別化医療への道。N Engl J Med . 2010;、第363巻、301-304。</li>
</ol>

DNA単離および制限酵素解析

DNAがすべての生物の遺伝性分子であることの解明は、科学と医学の大きな進歩をもたらし、私たちの...

Education

JoVE Lab Manual

生物学

Genetics

遺伝学

dna extraction, quantification, and cutting

DNA extraction, quantification, and cutting are key steps in many biology labs. Scientists use these methods to study genes, prepare DNA for testing, and compare fragments for analysis.

DNA isolation starts with a small sample, such as a leaf, hair follicles, or epithelial cells from the mouth collected with a saline solution. The first steps are cell harvesting, lysis, protein degradation, and DNA precipitation. Lysis breaks open the cell and nuclear membranes so the DNA can be released from the nucleus or mitochondria in eukaryotic cells. A detergent-containing buffer helps dissolve membranes and also protects DNA from degrading conditions such as heavy metal ions and extreme pH.

After the DNA is exposed, Proteinase K is added. This enzyme breaks peptide bonds in proteins and helps separate DNA from histones and other proteins. The DNA is then mixed with sodium chloride, and Na+ ions help the tangled DNA strands clump together because nucleic acids carry negative charges. Cold alcohol is added next, since DNA does not dissolve in alcohol and will precipitate at low temperatures. The DNA can then be dissolved in deionized water or a mild buffer for storage, as long as the solution is free of enzymes that could break it down.

Once DNA is isolated, scientists often measure how much DNA they have and how pure it is. A spectrophotometer does this by sending light through the sample at specific wavelengths. DNA absorbs light at 260 nm, while proteins absorb light at 280 nm. The 260 nm reading shows DNA concentration, and the 260/280 ratio helps estimate purity. In a sample of pure DNA, that ratio should approach 2.

For cloning, sequencing, and mapping DNA fragments or genomes, scientists often need to cut DNA at specific sites. They use restriction enzymes, which are bacterial proteins that act like molecular scissors against invading viral DNA. These enzymes recognize short nucleotide sequences, often six to twelve bases long, and the sequences are usually palindromic, meaning they read the same in both directions. EcoRI is one example and cuts at the sequence GAATTC.

After cutting, the DNA fragments are loaded into a gel and separated by electrophoresis. DNA is negatively charged, so it moves toward the anode when an electric current is applied. Smaller fragments travel faster through the gel pores than larger ones, so the pieces separate by size. Dyes that bind to DNA make the fragments visible, and researchers compare them with a standard ladder to estimate fragment size. The fragments can then be isolated and ligated into a plasmid vector for genetic cloning.

These methods support many modern applications. Scientists use DNA profiling to sequence genomes and to identify and study genes. DNA analysis also helps in forensics for criminal and civil cases, in paternity testing, and in checks for genetic diseases. Ancestry kits use DNA to help people trace lineage, find relatives, and learn about possible health traits. These tools also support personalized medicine, where researchers use a person’s genetic data to design treatments with fewer harmful side effects.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting

dna-extraction-quantification-and-cutting

genetics of organisms

Mendelian Traits and Exceptions

Mendelian genetics explains how traits move from parents to offspring. Gregor Mendel studied pea plants in 1865 and showed that many visible traits are controlled by two alleles, or gene versions, with one inherited from each parent. He also found that some alleles are dominant and others are recessive. Mendel’s work was not widely accepted until 1900, and it took about 30 more years for Mendelian inheritance to fit into evolutionary theory. One reason for the delay was that real breeding...

dna isolation and restriction enzyme analysis

DNA extraction, quantification, and cutting are key steps in many biology labs. Scientists use these methods to study genes, prepare DNA for testing, and compare fragments for analysis. DNA isolation starts with a small sample, such as a leaf, hair follicles, or epithelial cells from the mouth collected with a saline solution. The first steps are cell harvesting, lysis, protein degradation, and DNA precipitation. Lysis breaks open the cell and nuclear membranes so the DNA can be released from...

bacterial transformation

Plasmid DNA Transfer in Bacteria

Plasmid DNA transfer in bacteria helped launch modern genetic engineering. The idea traces back to Frederick Griffith’s work on pneumonia-causing Streptococcus pneumoniae in the early 20th century. He studied a rough, non-virulent R strain and a smooth, virulent S strain with a protective polysaccharide capsule. When he injected mice with heat-killed bacteria of either strain, the mice survived. But when heat-killed S-strain bacteria were mixed with live R-strain bacteria, the mice died, and...

genetics

Learn how DNA is isolated, measured with a spectrophotometer, cut with restriction enzymes, and separated by gel electrophoresis for analysis.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting | JoVE K12

DNA単離および制限酵素解析 を教える準備を、この 2 分間の教員向けガイドで行いましょう。JoVE Lab Manual の Biology ラボの主要な準備手順を解説します。

Biology の DNA単離および制限酵素解析 教員準備 - 14K+ 回の視聴 | JoVE Lab Manual

この 13 分間の学生プロトコル動画で、DNA単離および制限酵素解析 の手順をステップごとに学びましょう。JoVE Lab Manual の Biology コレクションの一部です。

Biology の DNA単離および制限酵素解析 学生プロトコル - 33K+ 回の視聴 | JoVE Lab Manual

What is Meiosis?

Meiosis is the process by which diploid cells divide to produce haploid daughter cells. In humans, each diploid cell contains 46 chromosomes, half from ...

Meiosis I

Meiosis II

Meiosis vs. Mitosis

Crossing Over

Crossing over is the exchange of genetic information between homologous chromosomes during prophase I of meiosis I. Genetic recombination gives rise to ...

Nondisjunction

Nondisjunction is the failure of homologous chromosomes or sister chromatids to separate correctly and move to the opposite poles of the cells. This ...

Spermatogenesis

Spermatogenesis is the process by which haploid sperm cells are produced in the male testes. It starts with stem cells located close to the outer rim of ...

Oogenesis

In human women, oogenesis produces one mature egg cell or ovum for every precursor cell that enters meiosis. This process differs in two unique ways from ...

Fertilization

During fertilization, an egg and sperm cell fuse to create a new diploid structure. In humans, the process occurs once the egg has been released from the ...

Cleavage and Blastulation

After a large-single-celled zygote is produced via fertilization, the process of cleavage occurs while zygotes travel through the uterine tube. Cleavage ...

Gastrulation

Gastrulation establishes the three primary tissues of an embryo: the ectoderm, mesoderm, and endoderm. This developmental process relies on a series of ...

Neurulation

Neurulation is the embryological process which forms the precursors of the central nervous system and occurs after gastrulation has established the three ...

Cell Migration

Cell migration, the process by which cells move from one location to another, is essential for the proper development and viability of organisms ...

Determination

During embryogenesis, cells become progressively committed to different fates through a two-step process: specification followed by determination. ...

Use models to explain how DNA is passed from parents to offspring through the processes of meiosis and fertilization in sexual reproduction.

LS.Bio.6.1

Mutations

Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

genome-size-and-the-evolution-of-new-genes

Genome Size and the Evolution of New Genes

types-of-genetic-transfer-between-organisms

Types of Genetic Transfer Between Organisms

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Overview of DNA Repair

Base Excision Repair

Nucleotide Excision Repair

DNA Distortion and Damage
Cells are regularly exposed to mutagens&#8212;factors in the environment that can damage DNA and generate mutations. UV ...

Mismatch Repair

Organisms are capable of detecting and fixing nucleotide mismatches that occur during DNA replication. This sophisticated process requires identifying the ...

Fixing Double-strand Breaks

Homologous Recombination

Gene Conversion

Restarting Stalled Replication Forks

Construct an explanation to summarize how inheritable genetic variations may result from: new genetic combinations in meiosis, mutations during replication, or mutations caused by environmental factors.

LS.Bio.6.2

An Overview of Genetic Analysis

An organism&#8217;s physical traits, or phenotype, are a product of its genotype, which is the combination of alleles (gene variants) inherited from its ...

Genetic Crosses

To dissect genetic processes or create organisms with novel suites of traits, scientists can perform genetic crosses, or the purposeful mating of two ...

Punnett Squares

Monohybrid Crosses

Dihybrid Crosses

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Law of Independent Assortment

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Pedigree Analysis

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Use mathematics and computational thinking to predict the variation and distribution of expressed traits based on: Mendelian inheritance, co-dominance, incomplete dominance, multiple alleles, and sex-linked inheritance.

LS.Bio.7.1

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Probability Laws

Overview

The probability of inheriting a trait can be calculated using the sum and product rules. The sum rule is used to calculate the probability of ...

The Concept of Multiple Allelism

Multiple allelism describes genes that exist in three or more allelic forms. Although diploid organisms, like humans, ...

Analyze and interpret data to explain how polygenic traits result in a wide range of phenotypes.

LS.Bio.7.2

Pleiotropy

Pleiotropy is the phenomenon in which a single gene impacts multiple, seemingly unrelated phenotypic traits. For example, defects in the SOX10 gene cause ...

Nature and Nurture

Many human characteristics, like height, are shaped by both nature&mdash;in other words, by our genes&mdash;and by nurture, or our environment. For ...

Construct an explanation to summarize how traits result from interactions of genetic factors (multiple genes and/or alleles) and environmental factors.

LS.Bio.7.3

PCR: The Polymerase Chain Reaction

The polymerase chain reaction, or PCR, is a technique used to amplify DNA through thermocycling &#8211; cyles of temperature changes at fixed time ...

DNA Gel Electrophoresis

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

DNA Isolation

DNA isolation protocols can be fast and straightforward or complex and time-consuming depending on the type and quality of DNA required for further ...

Restriction Enzymes

Restriction enzymes are bacterial enzymes used to cut DNA in a sequence-specific manner. To cleave DNA, they bind to specific palindromic sequences called ...

DNA Agarose Gel Electrophoresis

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify ...

The revelation of DNA as the hereditary molecule in all organisms has led to enormous scientific and medical breakthroughs and significantly enhanced our ...

Preparation of Solutions and Materials
ExpandNOTE: For this lab to run smoothly, it is recommended to not exceed 12 samples per laboratory class.
First ...

DNA Isolation
ExpandNOTE: In this experiment you will perform DNA isolation under two experimental conditions: one using a buffer containing the detergent ...

Analyze and interpret data to compare DNA samples.

Transgenic Organisms

Reproductive Cloning

CRISPR

Synthetic Biology

Synthetic biology is an interdisciplinary science that involves using principles from disciplines such as engineering, molecular biology, cell biology, ...

Ribosome Profiling

Ribosome profiling or ribo-sequencing is a deep sequencing technique that produces a snapshot of active translation in a cell. It selectively sequences ...

Transgenic Plants

Recombinant DNA technology called transgenesis is often used to add a foreign gene or remove a detrimental gene from an organism. Such genetically ...

Gene Therapy

biofuels-producing-ethanol-from-cellulosic-material

Biofuels: Producing Ethanol from Cellulosic Material

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
In this experiment, cellulosic material (such as corn stalks, leaves, ...

Testing For Genetically Modified Foods

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
Genetic modification of foods has been a controversial issue due to debated ...

Obtain and communicate information that summarizes the impact of biotechnology applications on the individual, society, and the environment, including agriculture and medicine.

LS.Bio.8.2

Understand genetic mechanisms for variation.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards