細胞分裂

1. 根先端の細胞周期を観察する Expand
   • 仮説：:実験仮説は、微小管重合を妨げる化学物質であるノコダゾールで処理された根の先端スライスでは、すべての細胞が細胞周期の同じ段階で停止し、未処理のタマネギチップスライスでは、細胞周期の異なる段階がすべて視覚化されるというものです。帰無仮説は、2 つのグループ間で有糸分裂に違いはなく、細胞周期の異なる段階が視覚化されるというものです。
   • この実験の準備として、新しい白い根の先端が芽を出し始めるまで数日間水に入れたタマネギを使用します。かみそりの刃を使用して、根の先端の1つの端から1cmのピースを切り取ります。
   • タマネギのスライスをノコダゾール状態の「N」とラベル付けされた微量遠心チューブに入れます。
   • 次に、タマネギの根の先端を1cm切って、制御条件の「C」とラベル付けされた微量遠心チューブに入れます。
   • Nとラベル付けされた微量遠心チューブに5 mg/mLのノコダゾールを2 μLの水に加え、Cとラベルされたチューブにのみ1 mLの水を加えます。
   • 根の先端を含むチューブを12時間インキュベートし、70%エタノールでワークスペースを拭き取ります。
   • インキュベーションが完了したら、ヒートブロックを60°Cに設定します。
   • ノコダゾール処理チップを水で洗い、液体を吸引します。
   • この洗浄をさらに2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。
   • 両方のチューブに1mLの正常塩酸を1mL充填します。チューブを60°Cのヒートブロックで12〜15分間インキュベートし、酸を廃フラスコに捨てます。
   • 次に、1mLの蒸留水をチューブに少なくとも3回追加して、サンプルをすすぎます。
   • ここで、10mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1マイクロリットルのDAPI染色を加えます。
   • 次に、この希薄なDAPI染色液50μLを各チューブに入れ、室温で12分間インキュベートします。
   • この後、ステップ10のように3つの蒸留水洗浄を予行します。
   • 1つの顕微鏡スライドを「Control」、もう1つのスライドを「Nocodazole」とラベル付けします。
   • 染色した根をそれぞれの顕微鏡スライドに移し、コントロールスライドに水を一滴加え、ノコダゾールスライドにノコダゾールを一滴加えます。
   • カミソリの刃を使用して各根の先端の汚れていない部分を取り除き、各サンプルにガラスカバースリップを置きます。
   • 手袋をはめた指先で各カバースリップを慎重に押し下げ、スライドを10分間放置します。
   • 最後に、蛍光顕微鏡の40倍対物レンズの下でスライドを表示し、ルートチップ細胞調製物の画像をキャプチャします。
2. 細胞周期制御の喪失を理解する Expand
   • 注:細胞が細胞周期のすべての段階を通過する前に、いくつかのチェックポイントを通過する必要があります。これらのチェックポイントは、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼタンパク質(CDK)によって制御されています。サイクリンとCDKが、以前の細胞イベントが十分に完了していないと判断した場合、このステップで細胞を停止し、細胞の増殖を防ぎます。がん細胞では、細胞分裂を調節するためのこれらの分子拘束の1つまたはいくつかが失われ、これにより損傷した細胞が細胞増殖制御から逃れることができます。これらの異常な細胞は、体の正常な機能を妨げる制御されていない増殖細胞の塊である腫瘍に発展します。分裂する前に、このがん細胞が光顕微鏡下で非常に強く光を丸めて屈折する様子に注目してください。これは、有糸分裂の各ラウンド後にすべてのがん細胞が娘細胞にうまく分裂するわけではないためです。これは、細胞が細胞小器官とDNAを過剰に含んでいることが多く、この細胞含有量の増加は、正常な細胞よりも強く光を屈折させることを意味します。
3. 結果 Expand
   • 収集した画像を調べ、ノコダゾールで処理したタマネギチップスライスで識別できるさまざまな細胞構造とステージを表1に記録します。ここをクリックして表1をダウンロードしてください。
   • 有糸分裂中の細胞がある場合は、細胞分裂のどの段階が見えるかに注意してください。
   • 表1に有糸分裂の各段階の細胞の割合を記録します。
   • 次に、未処理のタマネギチップスライスの画像を調べて、どの細胞構造を特定できるかを記録します。
   • 有糸分裂中の細胞がある場合は、細胞分裂のどの段階を見るかを検討し、有糸分裂の各段階の細胞の割合を表1に記録してください。

実験的仮説は、微小管重合を妨害する化学物質であるノコダゾールで処理された根の先端スライスでは、すべての細胞が細胞周期の同じ段階で停止し、未処理のタマネギ先端スライスでは、細胞周期の異なる段階がすべて視覚化されるというものです。帰無仮説は、2 つのグループ間で有糸分裂に違いはなく、細胞周期の異なる段階が視覚化されるというものです。この実験の準備として、新しい白い根の先端が芽出し始めるまで数日間水に入れたタマネギを使用します。

かみそりの刃を使用して、根の先端の1つの端から1センチメートルのピースを切り取ります。タマネギのスライスをノコダゾール状態のNとラベル付けされた微量遠心チューブに入れます。次に、タマネギの根の先端を1センチメートルで2枚目に切り、制御条件としてCとラベル付けされた微量遠心チューブに入れます。

Nとラベル付けされたマイクロ遠心チューブ内の水1ミリリットルにノコダゾールあたり5ミリグラムの2マイクロリットルを、Cとラベル付けされたチューブに1ミリリットルの水を加えます。インキュベーションが完了したら、ヒートブロックを摂氏60度に設定します。ノコダゾール処理された先端を水で洗い、液体を吸引します。.

この洗浄を2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。両方のチューブに1ミリリットルの1つの通常の塩酸を入れます。チューブを摂氏60度のヒートブロックで12〜15分間インキュベートし、酸を廃フラスコに捨て、1ミリリットルの蒸留水をチューブに少なくとも3回追加してサンプルをすすぎます。

次に、10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に1マイクロリットルのDAPI染色液を追加します。次に、50マイクロリットルの希釈DAPI染色液を各チューブに入れ、室温で12分間インキュベートします。このプリフォームの後、先ほど示したように3つの蒸留水洗浄を行います。

1つの顕微鏡スライドをコントロールとラベル付けし、もう1つのスライドをノコダゾールとラベル付けします。染色した根をそれぞれの顕微鏡スライドに移し、コントロールスライドに一滴の水を加え、ノコダゾールスライドにノコダゾールを一滴加えます。かみそりの刃を使用して、各根の先端の汚れていない部分を取り除き、各サンプルにガラスカバースリップを置きます。

手袋をはめた指先で各カバースリップを慎重に押し下げ、スライドを10分間放置します。最後に、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡の40倍対物レンズの下でスライドを表示し、ルートチップ細胞調製物の画像を撮影します。細胞が細胞周期のすべての段階を通過する前に、細胞が通過しなければならないいくつかのチェックポイントがあります。

これらのチェックポイントは、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼタンパク質(CDK)によって制御されています。サイクリンとCDKが、以前の細胞イベントが十分に完了していないと判断した場合、このステップで細胞を停止し、細胞の増殖を防ぎます。がん細胞では、細胞分裂を調節するためのこれらの分子拘束の1つまたはいくつかが失われ、これにより損傷した細胞が細胞増殖制御から逃れることができます。

これらの異常な細胞は、体の正常な機能を妨げる制御されていない増殖細胞の塊である腫瘍に発展します。分裂する前に、このがん細胞が光顕微鏡下で非常に強く光を丸めて屈折する様子に注目してください。これは、有糸分裂の各ラウンド後にすべてのがん細胞が娘細胞にうまく分裂するわけではないためです。

これは、細胞が細胞小器官とDNAを過剰に含んでいることが多く、この細胞含有量の増加は、正常な細胞よりも強く光を屈折させることを意味します。すべてのデータが収集されたので、結果を見てみましょう。ノコダゾールで処理したタマネギチップスライスにはどのような細胞構造が同定できますか?

有糸分裂を受けている細胞はありますか?細胞分裂のどの段階が見えますか?有糸分裂の各段階の細胞の割合を表に記録します。

次に、未処理のタマネギチップスライスを見てください。どのような細胞構造を同定できますか?有糸分裂を受けている細胞はありますか?

細胞分裂のどの段階が見えますか?有糸分裂の各段階の細胞の割合を表に記録します。ノコダゾール処理されたタマネギスライスのほとんどの細胞は、試薬の微小管破壊特性により、紡錘体繊維の形成とその後の染色体の分配および細胞分裂を防ぐため、有糸分裂の同じ段階にあることに気付くでしょう。

有糸分裂は健康な生物で進行中のプロセスであるため、未処理のスライスの細胞には有糸分裂の多くの異なる段階が見られます。